13 Cap 1 Validarea Metodelor Bioanalitice PDF

Cap. 1.
Validarea metodelor bioanalitice
Cap. 1. Validarea metodelor bioanalitice

1.1. Introducere
Validarea unei metode de analiză reprezintă punerea la punct a unei
metodologii de verificare, de confirmare sau de acreditare a validităţii
ştiintifice a unei metode de analiză. Scopul aceastei metodologii este acela
de a demonstra că metoda sau un procedeu analitic corespunde utilizării
pentru care a fost prevăzut.
Validarea este o componentă importantă în determinarea şi
asigurarea încrederii în repetabilitatea şi reproductibilitatea rezultatelor
analitice, deci în asigurarea calităţii acestor rezultate şi implicit în metoda de
analiză ce conduce la aceste rezultate1 2 3.
Conceptul de validare este un concept relativ nou, care a început să
se dezvolte spre sfârşitul anilor 80. Ulterior, dezbaterile din cadrul unui
număr mare de congrese si seminarii, desfăşurate atât în SUA (tabelul 1),
cât şi în Europa, au condus la elaborarea unui cadru reglementar de norme şi
recomandări4 5 6 7 8
. Cu toate acestea, chiar urmând aceste ghiduri, nu se
1
P. Bruce, P. Minkkinen, M.L. Riekkola – Practical method validation: validation
sufficient for an analytical method, Mikrochimica Acta, 1998, 128, 93-106
2
S. Touratier, D. Pradeau – Validation d’une méthode analytique appliqué au dosage du
medicament, ed. EM. Analyse pratique du medicament APHIF 1990, 115 – 141.
3
J.M. Green – A Practical Guide to Analytical Method Validation, Analytical Chemistry
News and Futures, 1996, Mai 1, 305A – 309A
4
United States Pharmacopeia XXIII, General Chapter <1225>, Validation of compendial
methods, National Formulary, XVIII, Rockville MD, The United States Pharmacopeia
Convention Inc., 1995, 1982-1984
5
US FDA Technical Review Guide - Validation of Chromatographic Methods, Center for
Drug Evaluation and Research (CDER), Rockville MD, 1993
6
US FDA – General principles of validation, Center for Drug Evaluation and Research
(CDER), Rockville MD, mai 1987
1
poate furniza o dovadă suficientă că metoda dezvoltată este adecvată pentru

eliberarea produsului9 10 11 12 13.
Chimia bioanalitică are ca scop analiza calitativă şi cantitativă a
substanţelor medicamentoase şi ale metaboliţilor acestora în matrice
biologice (plasmă, urină, fluid cerebrospinal, ţesuturi). Ea joacă un rol
important în evaluarea şi interpretarea biodisponibilităţii, bioechivalenţei şi
a datelor farmacocinetice. O metodă bioanalitică presupune un set de
proceduri implicate în colectarea, procesarea, depozitarea şi analiza unei
matrice biologice pentru un compus chimic. Principalele faze ale unei
metode analitice sunt: dezvoltarea metodei, validarea metodei şi analiza
probei (aplicarea metodei)14 15 16 17.
7
US FDA – Draft Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods Validation,
Center for Bioanalytical Evaluation (CBER), Bethesda MD, 2000
8
US FDA –Guidance for Industry- Bioanalytical Method Validation, Center for Drug
Evaluation and Research (CDER), Bethesda MD, 2001
9
S.O. Krause – Validating Analytical Methods for Biopharmaceuticals, Part 1:
Development and Optimization, BioPharm Int. 2004, 17(10): 52-61.
10
S.O. Krause – Validating Analytical Methods for Biopharmaceuticals, Part 2: Formal
validation, BioPharm Int. 2004, 17(11), 46-52
11
S.O. Krause –Analytical Methods Validation for Biopharmaceuticals: A Practical Guide,
BioPharm Int. 2005, 18(10), 52-69
12
S.O. Krause – A guide for testing biopharmaceticals, Part I: General strategies for
validation extension, J. Pharm. Tech. 2006, 18(5)
13
S.O. Krause – A guide for testing biopharmaceticals, Part II: Acceptance criteria and
analytical method maintenance, J. Pharm. Tech. 2006, 18(6)
14
J. R. Lang, S. Bolton – A comprehensive method validation strategy for bioanalytical
applications in the pharmaceutical industry -1. Experimental considerations, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1991, 9(5), 357-361
15
J. R. Lang, S. Bolton – A comprehensive method validation strategy for bioanalytical
applications in the pharmaceutical industry - 2. Statistical analyses, Journal of
16
S. Braggio, R. J. Barnaby, P. Grossi, M. Cugola – A strategy for validation of
bioanalytical methods, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 1996, 14(4),
375-388
2
Validarea unei metode bioanalitice18 19 20 21 include toate procedurile

care demonstrează că o anumită metodă utilizată pentru determinarea
cantitativă a analiţilor într-o matrice biologică dată (sânge, plasmă, ser sau
urină) este sigură şi reproductibilă pentru utilizarea dorită. Pentru a obţine
rezultate sigure care pot fi interpretate satisfăcător, este esenţial să se
utilizeze metode de validare bine definite şi complet validate 22. Metodele şi
tehnicile analitice sunt supuse continuu schimbării şi îmbunătăţirilor, în
multe cazuri situându-se la limita tehnologiei. Este important de subliniat
faptul că fiecare tehnică analitică are caracteristicile sale, care pot varia de
la analit la analit. Mai mult, obiectivitatea tehnicii poate fi influenţată de
scopul studiului. Sunt necesare criterii specifice de validare pentru fiecare
dintre metodele destinate analizei fiecărui analit (medicament şi /sau
metabolit). Deşi validarea fiecarei metode în parte este suficientă, sunt
situaţii în care sunt necesare comparaţii între metode (de exemplu atunci
când a fost utilizată mai mult de o metodă într-un studiu pe termen lung).
Atunci când analiza unei probe pentru un studiu dat este realizată în mai
17
R. Causon – Validation of chromatographic methods in biomedical analysis viewpoint
and discussion, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications
1997, 689(1), 175-180.
18
E. Gelpí - Bioanalytical aspects on method validation, Life Sciences, 1987, 41(7), 849-
852
19
C. Hartmann, J. Smeyers-Verbeke, D. L. Massart and R. D. Mcdowall – Validation of
bioanalytical chromatographic methods , Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis 1998, 17 (2), 193-218.
20
C.A. James, M. Breda, E. Frigerio – Bioanalytical method validation: a risk-based
approach? Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2004, 35(4), 887-893
21
H.T. Karnes, G. Shiu, V.P. Shah – Validation of bioanalytical methods, Pharmaceutical
Research, 1991, 8(4), 421-226
22
W.J. Lough, I.W. Wainer – Method development and quantitation in High Performance
Liquid Chromatography. Fundamental principles and practice, editors W.J. LOUGH, I.W.
WAINER, Blackie Academic and Professional, Chapman & Hall, London, 1996, 143-167
3
multe locuri, se impune validarea metodei analitice în fiecare laborator şi

furnizarea de informaţii utile în validare pentru a stabili siguranţa inter-
laboratoare. Dacă o metodă nu este utilizată pe o bază reglementată care să
ateste încrederea în validitatea sa continuă, atunci este esenţial să se
demonstreze că metoda este încă validă înainte de analiza probelor într-un
studiu.
Tabelul 1 Etape parcurse în procesul de validare a metodelor analitice în SUA
Validarea metodelor analitice – Istoric (SUA)
 Pharmacopoeial Forum – current concept for the validation of

compendial assays (1986 + Current revision)
 Federal Code of Regulation – Guidelines for submitting samples and

analytical data for method evaluation (21 CFR 10.90, 1987)
 Pharmacopeial Forum Validation of compendial assays – Guidelines

(1988) USP XXI (1989), XXII (1990), XXIII (1995)
 FDA: Center for Drug Evaluation end research – Validation of

chromatographic methods – Reviewer guidance (1994)
 ICH-Q2A / ICH-Q2B: Validation of analytical procedures: definitions

and terminology / methodology (1995)
 FDA – CDER Draft – Analytical procedure and method validation

(2000)
4
Din considerentele enumerate anterior, stabilirea unor criterii de

validare a metodelor bioanalitice a fost un proces amplu şi de durată,
principalele etape parcurse până în prezent fiind prezentate în tabelul 2.
Tabelul 2 Etape parcurse în stabilirea criteriilor de validare a metodelor bioanalitice
Validarea metodelor bioanalitice – Istoric
 Testing laboratory act (Noua Zeelandă – 1972)
 Nota explicativă a Comisiei CE (1989)
 Conferinţa de la Washington (Arlington) (1990)
 Conferinţa de la Barcelona (1992)
 Conferinţa de la Munchen (1994)
 Comisia SFSTP (1997)
 Conferinţa de la Washington (2000)
 AAPS, Indianapolis (2000)
 FDA, Bioanalytical Method Validation (2001)
 Bioval, Londra (02/2002)
 Bioval, Londra (02/2004)
 Conferinţa de la Washington (2006)
5
1.2. Tipuri de validare a metodelor
1.2.1. Validarea completă

O validare completă este necesară:
-dacă metoda este dezvoltată şi implementată pentru prima oară;
-dacă este analizată o entitate medicamentoasă nouă;
-dacă sunt adăugaţi metaboliţi la o analiză existentă, pentru determinare.
1.2.2. Validarea parţială

Validările parţiale sunt modificări ale metodelor bioanalitice deja
validate. Validarea parţială poate varia de la câteva proceduri, ca
determinarea acurateţii şi preciziei intra-zi până la o validare aproape
completă.
Situaţii tipice pentru o validare parţială sunt:
 transferuri ale metodei analitice între laboratoare şi analişti;
 modificarea metodologiei analitice (de ex. modificarea sistemelor de
detecţie);
 schimbarea anticoagulantului în fluidul biologic recoltatat;
 modificarea matricei aceleiaşi specii (de ex. plasmă umană cu urină
umană);
 modificarea procedurilor de procesare a probei;
 schimbarea speciilor în interiorul aceleiaşi matrice (de ex. plasmă de
şobolan cu plasmă de şoarece);
 modificarea domeniului de concentraţie relevant;
6
 schimbarea instrumentului şi/sau programelor informatice;

 volum de probă limitat (de ex. în determinările pedriatice);
 matrici rare;
 demonstrarea selectivităţii unui analit în prezenţa unei medicaţii
concomitente;
 demonstrarea selectivităţii unui analit în prezenţa unor metaboliţi
specifici.
1.2.3. Validarea încrucişată

Într-o validare încrucişată se compară parametrii de validare atunci
când sunt utilizate două sau mai multe metode bioanalitice pentru obţinerea
datelor în acelaşi studiu sau în cadrul unor studii diferite23. Un exemplu de
validare încucişată ar putea fi situaţia în care metoda bioanalitică validată
iniţial serveşte ca referinţă, iar metoda revizuită este de comparaţie.
Comparaţiile trebuie făcute în ambele sensuri.
Atunci când analizele probei în cadrul aceluiaşi studiu sunt efectuate
în două sau mai multe locuri sau în două sau mai multe laboratoare,
validarea încrucişată cu probele standarde de matrice ţintă şi cu probele
spiked trebuie realizată în fiecare loc sau laborator pentru a stabili siguranţa
inter-laboratoare. O validare încrucişată trebuie de asemenea luată în
considerare atunci când datele obţinute prin tehnici analitice diferite (de ex.
23
M. T. Gilbert, I. Barinov-Colligon, J. R. Miksic – Cross-validation of bioanalytical
methods between laboratories, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1995,
13( 4-5), 385-394
7
LC-MS-MS, faţă de ELISA) în studii diferite sunt incluse într-un material

supus reglementării.
Procesul prin care o metodă bioanalitică specifică este dezvoltată,
validată şi utilizată în analiza de rutină a probelor, poate fi împărţit în: (1)
prepararea standardului de referinţă, (2) dezvoltarea metodei bioanalitice şi
stabilirea unei proceduri de analiză şi (3) aplicarea metodei validate la
analiza de rutină a medicamentului şi criterii de acceptare pentru derularea
analizei şi/sau seriei.
1.3. Standardul de referinţă

Analiza unor medicamente şi a metaboliţilor lor într-o matrice
biologică se realizează folosind probe spiked cu standarde de calibrare (de
referinţă) şi utilizând probe de control a calităţii (QC). Puritatea
standardului de referinţă utilizat pentru a prepara probe spiked poate afecta
datele studiului. Din acest motiv, trebuie utilizat un standard de referinţă
analitică certificat, de identitate şi puritate cunoscută, pentru a prepara
soluţii de concentraţii cunoscute. Dacă este posibil, standardul de refrinţă
trebuie să fie identic cu analitul. Atunci când acest lucru nu este posibil,
poate fi utilizată o formă chimică stabilită (bază liberă sau acid, sare sau
ester) de puritate cunoscută. Uzual, se utilizează trei tipuri de standarde de
referinţă:
- standarde de referinţă certificate (de exemplu standarde conform
cerinţelor USP);
- standarde de referinţă furnizate comercial obţinută dintr-o sursă
comercială cu reputaţie;
8
- alte materiale de puritate documentată sintetizată la comandă într-

un laborator analitic sau o altă locaţie non-comercială. Pentru fiecare
standard de referinţă trebuie furnizate: sursa şi numărul lotului, data
expirării, certificate de analiză când sunt disponibile şi/sau o dovadă
generată intern sau extern a identităţii şi purităţii.
1.4. Dezvoltarea metodei: analiza chimică

În această secţiune sunt descrişi parametrii fundamentali pentru
validarea unei dozări chimice, şi anume GC, HPLC şi electroforeza capilară.
Pentru imunoanalize sunt date considerente speciale. Măsurătorile pentru
fiecare analit în matricea biologică trebuie să fie validate. În plus, trebuie
determinată stabilitatea analitului în în probele spiked. Dezvoltarea metodei
tipică şi stabilirea pentru o metodă bioanalitică includ determinarea (1)
selectivităţii (2) acurateţii, preciziei şi regăsirii, (3) curbei de calibrare şi (4)
stabilitatea analitului în probe spiked.
1.4.1. Selectivitatea
Selectivitatea este capacitatea unei metode analitice de a diferenţia şi
cuantifica într-o probă analitul în prezenţa altor componenţi. Pentru
selectivitate, analizele unor probe blanc ale matricei biologice respective
trebuie să fie obţinute din cel puţin 6 surse. Fiecare probă blanc trebuie să
fie testată în ceea ce proveşte interferenţele ce pot fi determinate de
componenţi ai matricei endogene, metaboliţi, produşi de descompunere şi
medicaţie concomitentă şi alte xenobiotice exogene. Selectivitatea trebuie
asigurată la limita inferioară de cuantificare (LLOQ).
9
1.4.2. Acurateţea, precizia şi regăsirea

Acurateţea
Acuarteţea unei metode analitice descrie apropierea dintre media
rezultatelor experimentale obţinute prin metoda respectivă de valoarea
adevărată (concentraţia) analitului. Acurateţea este determinată prin analiza
replicată a probelor ce conţin cantităţi cunoscute de analit. Acurateţea
trebuie să fie măsurată utilizând un minimum de 3 concentraţii şi 5
determinări per concentraţie. Valoarea medie trebuie să fie până la 15%
din valoarea nominală, cu excepţia limitei inferioare de cuantificare
(LLOQ), unde ea nu trebuie să devieze cu mai mult de 20%. Deviaţia mediei
de la valoarea adevărată serveşte ca o măsură a acurateţii.
Precizia
Precizia unei metode analitice descrie apropierea dintre măsurătorile
individuale ale unui analit când procedeul este aplicat repetat la multiple
eşantioane dintr-un volum omogen unic de matrice biologică. Precizia
trebuie să fie măsurată utilizând un minimum de 3 concentraţii şi 5
determinări per concentraţie. Precizia determinată la fiecare nivel de
concentraţie nu trebuie să depăşească 15% din valoarea coeficientului de
variaţie (CV), cu excepţia LLOQ, unde ea nu trebuie să depăşească 20%.
Precizia este subîmpărţită în:
 precizie sau repetabilitate în cadrul aceluiaşi ciclu analitic, intra-lot,
care exprimă precizia în timpul unui singur ciclu analitic şi
10
 precizie sau repetabilitate între cicluri analitice, inter-loturi, care

măsoară precizia cu timpul, şi poate implica analişti diferiţi, echipamente,
reactivi şi laboaratoare diferite.
Regăsirea
Regăsirea unui analit este răspunsul detectorului obţinut dintr-o
cantitate de analit adăugat la şi extras dintr-o matrice biologică, comparat cu
răspunsul detectorului obţinut pentru concentraţia nominală a standardului
autentic pur. Experimentele de regăsire trebuie să fie realizate comparând
rezultatele analitice pentru probe extrase la 3 concentraţii (mică, medie şi
mare) cu standarde neextrase care reprezintă regăsire 100%.
Recuperarea unui analit nu este necesar să fie 100% dar gradul de
regăsire al unui analit şi al unui standard intern trebuie să fie concordant,
precis şi reproductibil.
1.4.3. Calibrare/curba standard

Curba de calibrare
Relaţia dintre valoarea răspunsului experimental şi concentraţii
cunoscute ale analitului este denumită curbă de calibrare. O curbă de
calibrare trebuie să fie preparată în aceeaşi matrice biologică ca probele din
studiul intenţionat, prin impregnarea matricei cu concentraţii cunoscute de
analit24. În cazul în care nu este sufiecientă probă blanc disponibilă, de
24
H.T. Karnes, C. March – Calibration and validation of linearity in chromatographic
biopharmaceutical analysis, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1991,
9(10-12), 911-918
11
exemplu din fluidul cerebrospinal, trebuie să fie selectată o matrice

potrivită, cum este soluţia 0,9% NaCl, iar răspunsul obţinut din ambele
matrice trebuie să fie comparat.
Numărul de standarde utilizate pentru construirea curbei de
calibrareva fi în funcţie de domeniul de valori analitice anticipat şi de natura
relaţiei analit/răspuns. Concentraţia standardelor trebuie să fie aleasă pe
baza domeniului de concentraţie aşteptat într-un studiu particular. O curbă
de calibrare trebuie să fie compusă dintr-o probă blanc (proba matrice
procesată fără standard intern), o probă de zero (proba matrice procesată cu
standard intern) şi 6-8 probe non-zero care acoperă domeniul aşteptat,
inclusiv LLOQ.
Trasarea curbei de calibrare trebuie să fie realizată prin aplicarea
celui mai simplu model care descrie adecvat relaţia concentraţie-răspuns.
Selectarea unei compensări şi utilizarea unei ecuaţii de regresie complexe
trebuie să fie justificate.
Următoarele condiţii trebuie îndeplinite în construirea unei curbe de
calibrare:
 15% deviaţie a standardelor altele decât LLOQ de la concentraţia
nominală şi
 20% deviaţie a LLOQ de la concentraţia nominală.
Cel puţin 4 din cele 6 standarde non-zero trebuie să îndeplinească
condiţiile de mai sus, inclusiv LLOQ şi standardul de calibrare la cea mai
mare concentraţie.
12
Limita inferioară de cuantificare

LLOQ este cea mai mică concentraţie a unui analit care poate fi
măsurată cu o acuarateţe şi precizie acceptabile. Cel mai jos standard pe
curba de calibrare trebuie să fie acceptat ca LLOQ dacă sunt îndeplinite
următoarele condiţii:
 răspunsul analitului trebuie să fie la cel puţin 5 ori răspunsul
comparat cu răspunsul blanc.
 picul analitului (răspunsul) trebuie să fie identificabil, discret şi
reproductibil cu o precizie de 20% şi o acurateţe de 80-120%.
1.4.4. Stabilitatea
Stabilitatea medicamentului într-un fluid biologic depinde de
condiţiile de depozitare, de proprietăţile chimice ale medicamentului25, de
matrice şi de recipient. Stabilitatea unui analit în matricea biologică la
temperaturile de depozitare intenţionate trebuie să fie stabilită26. În plus,
stabilitatea trebuie să fie studiată la temperatura ambiantă pe o perioadă de
timp care acoperă durata unei preparări a probei tipice, manipularea probei
şi timpul ciclului analitic. Procedura trebuie de asemenea să includă o
evaluare a stabilităţii analitului în soluţia stoc pentru cel puţin 6 ore.
Influenţa ciclurilor îngheţare/dezgheţare trebuie să fie studiată la cel puţin 3
cicluri la 2 concentraţii triplicat.
25
M. Jemal, Y.Q. Xia – Bioanalytical method validation design for the simultaneous
quantitation of analytes that may undergo interconversion during analysis, Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2000, 22(5), 813-827
26
D. Dadgar, P. E. Burnett – Issues in evaluation of bioanalytical method selectivity and
drug stability, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 1995, 14( 1-2), 23-31
13
Toate determinările de stabilitate trebuie să utilizeze un set de probe

preparate dintr-o soluţie stoc proaspăt preparată de analit într-un blanc
potrivit, matrice biologică lipsită de interferenţe.
Se cercetează stabilitatea în următoarele condiţii:
-stabilitatea la îngheţare şi dezgheţare
-stabilitatea la temperatură pe termen scurt
-stabilitatea la temperatură pe termen lung
-stabilitatea soluţiei stoc
-stabilitatea post-preparativă.
1.5. Principii ale validării şi stabilirii metodei bioanalitice

Parametrii esenţiali pentru a asigura acceptabilitatea performanţei
validării metodei bioanalitice sunt acurateţea, precizia, selectivitatea,
sensibilitatea, reproductibilitatea şi stabilitatea.
Trebuie scrisă o descriere specifică, detaliată a metodei bioanalitice.
Aceasta poate fi sub forma unui protocol, plan de studiu, raport sau
Procedura Standard de Operare (Standard Operation Procedure - SOP).
Fiecare pas al metodei bioanalitice trebuie investigat pentru a
determina gradul în care variabilele de mediu înconjurător, mediu de
cultură, materiale sau proceduri, de la data colectării probelor până la
analiză, inclusiv analiza, pot afecta estimarea analitului în mediu.
Variabilitatea mediului datorită stării fiziologice trebuie luată în
considerare. În cazul procedurilor pe bază de LC-MS-MS, este esenţial ca
paşii respectivi să fie făcuţi pentru a asigura lipsa efectelor mediului prin
14
aplicarea metodei, mai ales dacă natura mediului a fost schimbată faţă de
cea folosită în timpul validării metodei iniţiale.
O metodă bioanalitică ar trebui validată pentru folosirea sau
aplicarea dorită. Toate experimentele folosite pentru a demonstra teoriile
sau a trage concluzii despre validitatea metodei ar trebui prezentate într-un
raport (raportul validării metodei).
Când este posibil, acelaşi mediu bioanalitic ca cel din proba dorită ar
trebui folosit în scopul validării. (Pentru ţesuturile cu disponibilitate
limitată, ca măduva osoasă, mediile potrivite fiziologic sunt suficiente).
Stabilitatea analitului (medicament şi/ sau metabolit) în mediu în
timpul procesului de colectare şi perioada depozitării probelor ar trebui
stabilite, de preferat înainte de analiza probei.
Pentru acei compuşi cu metaboliţi potenţial labili, este recomandat
ca stabilitatea analitului în mediu din subiecţii (sau speciile) supuşi dozării
să fie confirmată.
Acurateţea, precizia, reproductibilitatea, funcţia răspuns şi
selectivitatea metodei în funcţie de substanţele endogene, metaboliţi şi
produşi de degradare cunoscuţi ar trebui sa fie stabilite in funcţie de mediul
biologic. Cu privire la selectivitate, ar trebui să devină evident că substanţa
cuantificată este compusul supus analizei.
Intervalul concentraţiei în care analitul va fi determinat, trebuie să
fie definit prin metoda bioanalitică, bazată pe evaluarea mostrelor standard
curente din interval, inclusiv variaţiile lor statistice. Acesta defineşte curba
standard.
15
Este necesar să se foloseasca un număr suficient de standarde pentru

a defini într-un mod adecvat relaţia dintre concentraţie şi răspuns. Relaţia
dintre răspuns şi concentraţie trebuie să fie demonstrată a fi continuă şi
reproductibilă. Numărul standardelor de folosit vor fi o funcţie a intervalului
dinamic şi a naturii relaţiei concentraţie-răspuns. In multe cazuri, 5-8
concentraţii (excluzând valorile nule) pot defini curba standard. Mai multe
concentraţii standard pot fi necesare mai mult pentru relaţii nonliniare decât
liniare.
Abilitatea, în termeni de acurateţe şi precizie, de a dilua mostrele
originale deasupra limitei superioare a curbei standard, poate fi demostrată
prin validare.
Acurateţea şi precizia, cu care pot fi determinate concentraţiile
cunoscute ale analitului din matricea biologică, trebuie demostrate. Aceasta
poate fi realizată prin analiza seturilor reproduse/ duplicate ale mostrelor de
analiţi cu concentraţii cunoscute – mostre pentru controlul calităţii (QC) –
de la un mediu echivalent biologic. Minimum, 3 concentraţii reprezentând
întregul interval al curbei standard ar trebui studiate: una cu 3x LLOQ
(mostra QC cea mai scăzută), una lângă centru (QC de mijloc), şi una lângă
limita superioară a curbei standard (QC ridicată). Numărul mostrelor QC
pentru a asigura un control adecvat al analizei trebuie să fie determinat pe
baze statistice. Plasarea mostrelor de QC trebuie luată în considerare într-un
mod judicios în momentul derulării.
Pentru ca metoda bioanalitică să fie considerată validă, criterii de
acceptare specifice a priori trebuie stabilite şi atinse pentru acurateţe şi
precizie pentru validarea mostrelor QC peste intervalul standardelor.
16
Analiza repetată a mostrelor penetrate de obicei nu este necesară. Orice

probleme potenţiale ale degradării trebuie investigate printr-un experiment
de stabilitate utilizând probe invazate.
1.6. Recomandări specifice pentru validarea metodei

Curba legată de mediul standard trebuie să fie formată din minimum
5 puncte standard, excluzând blank-urile, utilizând mostre unice sau
replicate. Curba standard trebuie să acopere întregul interval de concentraţii
uzuale.
Fitarea curbei standard este realizată prin utilizarea celui mai simplu
algoritm (model) care descrie cel mai bine relaţia între concentraţie şi
răspuns, folosind cea mai potrivită compensare şi teste statistice de fitare.
Acest lucru se bazează pe punctele standard la fiecare rulare a analizei. Este
necesar să fie continuu şi reproductibil, şi trebuie să se bazeze pe
minimizarea erorii procentuale relative a valorilor anterior calculate.
Limita inferioară de cuantificare (LLOQ – the lower limit of
quantification) este cea mai mică concentraţie de pe curba standard poate fi
măsurată cu o acurateţe şi precizie acceptabilă. LLOQ trebuie fi determinată
folosind cel puţin 5 probe independente de standard şi determinând
coeficientul de variaţie şi/ sau intervalul de încredere cel mai potrivit.
LLOQ poate servi ca fiind cea mai mică concentraţie de pe curba standard şi
nu trebuie confundată cu limita de detecţie (LOD) şi/ sau proba de QC cea
mai mică. Cel mai concentrat standard va defini Limita superioară a
cuantificării (ULOQ) unei metode analitice.
17
Pentru validarea unei metode bioanalitice, acurateţea şi precizia vor

fi determinate utilizând un minim de 5 (excluzând blanc-urile) determinări
per concentraţie. Valoarea principală trebuie să se încadreze în ±15% din
valoarea teoretică, cu excepţia LLOQ, unde deviaţia nu trebuie să fie mai
mare de ±20%. Precizia în jurul valorii medii nu trebuie să depăşească 15%
din coeficientul de variaţie (CV), cu excepţia LLOQ unde nu trebuie să se
depăşească 20% din CV. Alte metode de stabilire a acurateţii şi preciziei,
care se încadrează în aceste limite, sunt acceptate.
Stabilitatea analitului în mediul biologic la temperatura de
depozitare dorită trebuie stabilită. În plus, influenţa în ciclurile îngheţ-
dezgheţ (un minim de 3 cicluri la 2 concentraţii în triplare) trebuie studiată.
Stabilitatea analitului în mediu la temperatura ambientală trebuie evaluată
pe o perioadă de timp care ia în calcul durata pregătirii probei tipice,
manipularea mostrei şi durata evaluării analitice.
Reproductibilitatea reinjecţiei trebuie evaluată pentru a determina
dacă execuţia analitică poate fi reanalizată, în cazul în care apar întârzieri
neaşteptate ale analizelor, precum defecţiunea instrumentelor.
Specificitatea metodologiei de testare trebuie stabilită folosind o
sursă de minimum 6 surse independente ale aceluiaşi mediu. Această cerinţă
pentru 6 medii independente pentru a fi testate pentru interferenţă poate să
nu fie necesară pentru metode bazate pe spectometria de masă cuplată. In
cazul procedurilor bazate pe LC-MS şi LC-MS-MS, efectele mediului
trebuie să fie investigate pentru a asigura că precizia, selectivitatea şi
sensibilitatea să nu fie compromise. Stabilirea selectivităţii metodei necesită
18
evaluare în timpul dezvoltării şi validării metodei, şi poate continua în

timpul aplicării metodei în mostrele studiate la momentul prezent.
Criteriile de acceptare/ respingere a standardelor de calibrare pe
bază de matrice spiked şi a validarii probelor QC trebuie să se bazeze pe
concentraţia nominală (teoretică) a analiţilor. Criterii specifice pot fi
stabilite a priori pentru o acurateţe şi precizie peste limita standardelor, daca
este dorit acest lucru.
1.7. Aplicarea metodei validate la analiza de rutină a

medicamentului
În urma unei validări cu succes, analiza unor probe biologice poate fi
dată printr-o singură determinare. Necesitatea unei analize duplicat poate
apărea în cazuri speciale, de ex analiţi labili, când precizia şi acurateţea
tolerate sunt dificil de atins. În acest caz, un raţionament pentru analiza în
duplicat trebuie să fie dezvoltat a priori.
Adecvarea sistemului
Pe baza analitului şi tehnicii, trebuie să fie identificat un test de
adecvare a sistemului specific sau a probei pentru a asigura operarea optimă
a sistemului utilizat.
Calibrarea
O curbă de calibrare pe baza matricei trebuie să fie construită pentru
fiecare ciclu şi trebuie să fie utilizată pentru calcularea concentraţiei
analitului în probe necunoscute analizate cu acel ciclu.
Este important să se utilizeze o curbă de calibrare care să acopere
întregul domeniu de concentraţii în probele necunoscute. Estimarea unor
19
necunoscute prin extrapolare sub LLOQ sau peste limita superioară a

domeniului nu este acceptabilă. În loc de aceasta, curba de calibrare trebuie
să fie redeterminată sau probele trebuie să fie re-analizate după diluare cu
matrice.
Controlul de calitate al probelor
Controlul de calitate (QC) al probelor în duplicat la un minimum de
3 concentraţii (una în regiunea 3 x LLOQ, una în mijlocul şi una aproape de
limita superioară a domeniului) trebuie să fie inclus în fiecare ciclu. Trebuie
să fie un minimum de 5% QC raportat la numărul de probe într-un ciclu sau
6 probe QC în total, oricât este de mare acesta.
Criterii de acceptanţă
Rezultatele controlului de calitate a probelor furnizează baza pentru
acceptarea sau respingerea unui ciclu. Cel puţin 67% (4 din 6) din probele
QC trebuie să fie în intervalul 15% din valorile lor nominale respective.
33% din probele QC (dar nu toate replicatele la aceeaşi concentraţie) pot fi
în afara a ± 15% domeniu al valorii nominale.
Repetarea analizei
Un ghid pentru repetarea analizei trebuie să fie stabilit a priori.
Motive anticipate pentru repetarea analizei trebuie să fie definite, de
exemplu erori în procesarea probei, defecţiuni ale echipamentului,
cromatografie defectuoasă. Raţiunea pentru repetarea analizei trebuie să fie
clar documentată.
20
1.8. Documentarea şi arhivarea datelor analitice

Datele generate de stabilirea metodei bioanalitice27 şi probele QC
trebuie să fie documentate şi disponibile pentru auditul datelor şi inspecţie.
În particular, documentarea trebuie să cuprindă:
 descriere operaţională a metodei analitice,
 evidenţa purităţii şi identităţii unor standarde de medicament,
standarde de metaboliţi şi standarde interne utilizate în experimente de
validare şi analize de rutină,
 toate rapoartele de validare completă, parţială şi încucişată,
 cromatograme, electroferograme sau spectrograme de masă tipice,
dacă sunt aplicabile,
 tabele rezumative ce conţin informaţii despre procesarea şi stocarea
probelor, incuzând identificarea probei, colectarea datelor, depozitarea
înainte de transport, informaţii privind transportul seriilor şi depozitarea
înaintea analizei,
 tabele rezumative ale ciclurilor analitice ale probelor clinice şi
preclinice, incluzând identificarea ciclului de determinare, data şi timpul
analizei, metoda de dozare, analişti, timpul de debut şi de oprire, durata,
modificări semnificative ale echipamentului şi materialului, şi orice orice
neconcordanţă potenţială sau abatere de la metoda stabilită,
 tabele rezumative cu datele curbei de calibrare,
27
D. Dadgar, P. E. Burnett, M. G. Choc, K. Gallicano, J. W. Hooper – Application issues
in bioanalytical method validation, sample analysis and data reporting, Journal of
21
 informaţii rezumative asupra datelor QC utilizate pentru acceptarea

ciclului analitic,
 tabele cu date din ciclurile analitice al probelor clinice şi preclinice,
inclusiv identificarea ciclului de determinare, identificarea probei şi
succesiunea datelor,
 serii de cromatograme complete de la 5-20% dintre subiecţi cu
calibrarea şi probe din cele ale ciclurilor analitice,
 motive pentru pierdere de probe,
 documentaţia pentru repetarea analizei, inclusiv rezultatele analizei
iniţiale şi repetate, rezultatul raportat şi motivul pentru repetarea analizei,
 documentaţie pentru datele re-integrate, inclusiv rezultatele
integrării iniţiale şi repetate, metoda utilizată pentru reintegrare, rezultatul
raportat şi motivul pentru re-integrare.
Documentele trebuie să fie arhivate pentru cel puţin 10 ani.
1.9. Proiectarea si validarea unor metode bioanalitice specifice -

Cefalexina
Cefalexina este o cefalosporină semisintetică din clasa
cefalosporinelor din prima generaţie, activă în administrare pe cale orală, cu
timp de înjumătăţire scurt (0,5-2 ore) şi legare redusă de proteinele
plasmatice (circa 6 – 15 %).28 . Biodisponibilitatea dupa administrare pe
cale orala est de 90-100%.
28
Spyker. D.A, Thomas B. L. Sande M.A Bolton W.K – Pharmacokinetics of cefaclor and
cephalexin: dosage nomograms for impaired renal function – Antimicrob. Agents.
Chemoter. – 1978, 14:172-177
22
Dupa administrarea orala a 500 mg cefalexina concentraţia

plasmatică maximă inregistrata este de aproximativ 16 μg/ml 29. Principala
cale de excretie este cea urinara, in forma nemetabolizata30.
Proprietati fizico-chimice:
Structura chimica:
Fig. 1 : Structura chimica a cefalexinei
Denumire chimica: (6R,7R)-7-[[(2R)-Aminofenilacetil]amino]-3–metil–8–

oxo–5–tia–1–azabiciclo[4.2.0] oct–2–en–2–carboxilic acid monohidrat
Formula moleculara: C16H17N3O4S,H2O=365.4
CAS—15686–71–2 (forma anhidra); 23325–78–2 (forma monohidrat)
Aspect si solubilitate: Cefalexina se prezinta sub forma unei pulberi
cristaline de culoare alba sau slab galbuie, usor higroscopica, solubila 1:100
29
Goodman & Gillman’s – The Pharmacologicla Basis of Therapeutics, Ninth Edition -
1995
30
C.H. Nightingale, D.S. Greene and R.J. Quintiliani,- Pharmacokinetics of Cefaclor and
Cephalexin: Dosage Nomograms for Impaired Renal Function - J. Pharm. Sci., 64 (1975)
12.
23
in apa, 1:30 in acid clorhidric 0,2% , practic insolubila in etanol, cloroform

si eter etilic, solubila in solutii diluate de hidroxizi alcalini.
Este o moleculă ce conţine atât grupări acide, cât si grupări bazice
(zwiterion), cu punct izoelectric in solutie = 4.5-5. Solubilitatea în apă este
mică la temperatura camerei, dar cantităţi de 1-2 mg/ml apă se pot dizolva
uşor în aceste condiţii. Este o substanţă insolubilă în alcool, eter sau
cloroform. De aici rezultă că fiind mai solubilă în apă decât în solvenţi
organici, extracţia lichid/lichid indiferent de solventul organic folosit are un
randament foarte mic.
Constanta de disociere: pKa:2.5, 5.2, 7.3.
Coeficient de partitie: Log P(octanol/apa), 0.6.
Spectru de absorbtie in UV: In solutie apoasa acida cefalexina prezinta un
maxim de sbsorbtie la 258 nm; in apa maximul de absorbtie se deplaseaza la
260 nm.
Fig. 1: Spectrul de absorbtie in UV al Cefalexinei
24
Compusul este un "zwitterion"; molecula contine atat radicali: bazici

(-NH2) cat si acizi (-COOH). Punctul izoelectric al cefalexinei in solutie
apoasa este de aproximativ 4,5-5.
Prima problemă în determinarea medicamentelor din probele
biologice o constituie procedura de prelucrare a probelor, în vederea izolării
şi concentrării analitului din matricea plasmatică.
Foarte utilizata ca metoda de purificare a probelor continand analiti
cu polaritate ridicata (asa cum este cazul cefalexinei) este precipitarea
proteinelor cu electroliti, solventi sau cu acizi. Precipitarea cu solventi
organici duce la diluarea probelor si aceasta, de regula, nu este de acceptat,
deoarece concentratiile foarte mici ale analitilor in probele biologice sunt o
dificultate majora – specifica bioanaliticii. Precipitarea cu polielectroliti sau
acizi concentrate reduce diluarea probelor, dar inglobarea substantelor
active in precipitat este foarte variabila, in functie de cat de rapid si complet
se face precipitarea. Filtrarea probelor pentru separarea proteinelor
precipitate este posibila, dar de foarte multe ori o parte semnificativa din
analit poate sa ramana in filtru. In plus, filtrele nu se pot utilize decat o
singura data.
Deproteinizarea este o metodă foarte uşor de aplicat, dar rezultatele
sunt mult mai variabile decât la metodele de extracţie.
 un parametru critic este cantitatea de acid. În scopul evitării diluării
probelor, se folosesc soluţii concentrate. O eroare mică în volumul adăugat
are drept consecinţă o variaţie mare a pH-ului rezultant al probei şi deci a
calităţii de proteine precipitate. O precipitare incompletă duce la
25
cromatograme foarte incarcate. O precipitare completă şi rapidă duce la

pierderi de substanţă activă prin înglobarea sa în cheagul de proteine.
 Un alt parametru de care depinde rezultatul final (aspectul
cromategramelor şi cantitatea de substanţă activă regasită) este compoziţia
plasmei. După ingestia de alimente, plasma este mult mai încărcată de
grăsimi, ceea ce complică toate procesele de partiţie şi concentratiile în
extras.
De aceea, în literatura de specialitate au fost descrise mai multe
metode de separare a cefalexinei din matricea initială: extracţie în faza
solidă, extracţie lichid-lichid, deproteinizare etc; în cele mai multe cazuri s-
au folosit tehnici de deproteinizare cu diverşi reactivi:
 solvenţi organici (metanol-acetat de sodiu 0.1M31, metanol32 ),
 acizi (HClO433, acid tricloracetic34,35 )
 polielectroliţi (ZnSO436).
31
Signs S.A., File T.M., Tan J.S.,-High-Pressure Liquid Chromatographic Method for
Analysis of Cephalosporins- Antimicrob-Agents-Chemoter., Nov. 1984; 26 (5), 652-655
32
Milap C. Nahata - High+performance liquid chromatographic determination of
cephalexin in human plasma, urine and saliva- Journal of Chromatography, 225 (1981)
532-538
33
Csiba A., Graber H.- Act New highly sensitive liquid chromatographic method for the
determination of antimicrobial substances in biological fluids Acta-Pharm-Hung Martie
1988; 58 (2), 81-93
34
Shyu W.C;Shukla U.A.;Shah V.R., Papp E.A., Barbhaiya R.H.- Simultaneous High-
Performance Liquid Chromatographic Analysis of Cefprozil Diastereomers in a
Pharmacokinetic Study- Pharmaceutical Research, Volume 8 (8), August 1991 , 992-996
35
Leroy P., Decolin D. şi colab., Residue determination of two co-administered
antibacterial agents - cephalexin and colistin - in calf tissues using high-performance
liquid chromatography and microbiological methods J.Pharm-Biomed-Anal., 1989; 7 (12),
1837-1846
36
Najib NM, Suleiman MS, el-Sayed YM, Abdulhameed ME.- High performance liquid
chromatographic analysis of cephalexin in serum and urine.- J Clin Pharm Ther. 1987
Dec;12(6):419-26.
26
O metoda alternativa utilizata tot mai mult in ultima perioada pentru

separarea din plasma a cefalexinei este extractia in faza solida. Au fost
utilizate cartuse de extractie in faza solida de tip Sep-Pak, Bond-Elut
C18/OH sau Bond-Elut C18, elutia analitului realizandu se cu metanol sau
un amestec de acid fosforic si metanol in diferite proportii 37,38.
Din punct de vedere al metodelor instrumentale de analiza a
cefalexinei din probe biologice, tehnicile lichid cromatografice sunt cele
mai utilizate, fiind cele mai adecvate din punctual de vedere al sensibilitatii
si specificitatii. Detectia in ultraviolet este utilizata in majoritatea cazurilor,
insa exista si metode ce utilizeaza detectia florimetrica dupa derivatizarea
probelor continand cefalexina.39.
Din punctul de vedere al mecanismului de separare, a in cele tehnica
pe faza inversa este utilizaa in cele mai multe dintre cazuri. Fazele mobile
uzuale utilizate pentru separarea cefalexinei contin de obicei acetonitril
si/sau metanol, precum si o solutie apoasa de acid acetic40,41,5, de tampon
acetat42 sau tamon fosfat43
37
Kovach Paul M. Lantz., Ronald J - High-performance liquid chromatographic
determination of loracarbef, a potential metabolite, cefaclor and cephalexin in human
plasma, serum and urine- Journal of Chromatography, 567 (1991) 129-I 39
38
Moore, C.M. Sato, K. Hattori, H. Katsumata, Y. - Improved HPLC method for the
determination of cephalosporins in human plasma and a new solid-phase extraction
procedure- , Clinica Chimica Acta, 190, 1990, 121-123
39
Katsumi Miyazaki, Kyoko Ohtani, Kyoko Sunada, Takaichi Arita- Determination of
ampicillin, amoxicillin, cephalexin, and cephradine in plasma by high-performance liquid
chromatography using fluorometric detection- Journal of Chromatography, 276 (l983) 478-
482
40
Mei-Chich, Hsu, Yu-Shan Lin, Hsiou-Chuan Chung - High-performance liquid
chromatographic method for potency determination of cephalexin in commercial
preparations and for stability studies- Journal of Chromatography A, 692 (1995) 67-7
27
Structura de “zwitterion” a cefalexinei o face insa susceptibila de a

putea fi separata cromatografic si printr-un mecanism de schimb ionic,
putand fi utilizati drept contraioni in faza mobile atat anioniti cat si cationiti.
(alchil-sulfonati de sodiu la pH<4 sau saruri de tetra-alchil amoniu11 la pH
apropiat de neutralitate.)
Dintre reactivii de schimb ionic cei mai utilizati sunt alchil-sulfonatii
de sodiu, atat cei cu catena alchilica mare (dodecil-sulfat de sodiu44), cat si
cei cu catena ceva mai scurta. (heptan sulfonat de sodiu10 sau pentan-
sulfonat de sodiu45). Este de remarcat faptul ca monografia oficiala din
Farmacopeea Americana prevede la capitolul “Dozare” o metoda
cromatografica utiliand schimbul ionic.
Totusi, in cazul mediilor biologice, continand foarte multe specii
chimice, procesul de schimb ionic este mai putin reproductibil decat in cazul
dozarilor din produse farmaceutice, nefiind mecanismul de separare de
electie.
41
Terumichi Nakagawa, Jun Ejaginaka, Kiyoshi Yamaoka Toyozo Un0 -Direct high-speed
liquid chromatographic determination of cephalexin in urine-Journal of Chromatography,
147 (1978) 509-512
42
V.F. Samanidou, E.A. Hapeshi, I.N. Papadoyannis-R apid and sensitive high-
performance liquid chromatographic determination of four cephalosporin antibiotics in
pharmaceuticals and body fluids-Journal of Chromatography B, 788 (2003) 147–158
43
Hikida K., Inoue Y.; Okuura T. ; Miyazaki T. ; Kojima H. ; Ohkura Y..- Determination
of cephalexin in human plasma and rabbit serum by automated column-switching HPLC -
Bunseki-Kagaku., 1989; 38 (3), 135-139
44
Tyczkowska K., Aronson A.L. - Analysis of cephalexin from canine skin biopsy by liquid
chromatography with ultraviolet-visible photodiode-array detection. – J. Chromatogr. 1988
May 13; 427(1):103-12.
45
*** - United States Pharmacopoeia ed. 27, 2005, Rockville MD: United States
Pharmacopoeia Convention, Inc.;
28
Optimizarea metodei de prelucrare a probelor de plasma continand

cefalexina:
O problemă în proiectarea metodelor bioanalitice este legată de
domeniul de concentraţii pentru care se aplică metoda şi, în primul rând,
limita de cuantificare. In cazul Cefalexinei, limita superioară a domeniului
trebuie să fie peste 25 μg/ml pentru a include concentraţia maximă. Pentru
limita inferioară trebuia tinut cont de faptul ca pentru studiul
farmacocineticii compusului recoltarea probelor se întinde pe un interval de
timp de cel puţin trei timpi de înjumătăţire pentru analitul de cercetat. In
acest context, o limită de cuantificare de Cmax/24 este o proiecţie acceptabilă.
In cazul administrarii per os a 500 mg cefalexina, aceasta ar corespunde la
15/16, deci o valoare in jur de 1 μg/ml. Dat fiind însă variabilitatea
biologică foarte mare, obţinerea unei limite de cuantificare de circa 0.25
μg/ml s-a considerat a fi mai asiguratorie.
Pentru metodele HPLC descrise in literatura limitele de cuantificare
au fost între 100 ng/ml si 1 μg/ml. Limitele inferioare sunt destul de mari,
absorbţia în UV fiind destul de mică.
Au mai fost descrise tehnici de separare a cefalosporinelor prin
extracţie în faza solidă (limita de cuantificare 0.25 μg/ml)4, tehnica column-
switching (detecţie la 254 nm, interval de liniaritate 1-100 μg/ml)46,
derivatizare post-coloană cu fluorescamină (detecţie fluorimetrică la 485
nm, excitare la 385 nm, intervalul de liniaritate cuprins între 10 si 500 ng la
46
Lee Y.J., Lee H.S.,- Simultaneous determination of cefoxitin, cefuroxime, cephalexin and
cephaloridine in plasma using HPLC and a column-switching technique -
Chromatographia., Jul. 1990; 30 (1-2), 80-84
29
un volum de injecţie de 10 μl)47 sau HPLC-MS (limita de detecţie 0.25

μg/ml la un volum de injecţie de 10 μg/ml şi detecţie la 254, 300 şi 260
nm48, respectiv 0.14 μg/ml cu un procent mediu de recuperare a analitului
după deproteinizare de 85%49).
Alegerea metodei de separare cromatografica a cefalexinei din

probe de plasma:
Metodele prezentate in literatura utilizeaza ca mecanism de separare
cromatografia pe faza inversa sau de schimb ionic, cu detectie in UV sau
fluorescenta. Fazele mobile utilizate sunt amestecuri ale unei solutii tampon
sau o solutie a unui acid diluat cu acetonitril sau metanol.
In vederea determinarii din probe de plasma a cefalexinei s-a
incercat utilizarea unui mecanism pe faza inversa, testandu-se utilizarea mai
multor faze mobile:
47
Blanchin M.D., Fabre H., Mandrou B. - Fluorescamine Post-Column Derivatization for
the HPLC Determination of Cephalosporins in Plasma and Urine - J. Liq-Chromatorg.,
Oct. 1988; 11 (14), 2993-3010
48
Martinez L.G., Campino-Falco P. J. - Improved Solid Phase Extraction Procedure for
Assay of Cephalosporins in Human Urine Samples- Liq-Chromatogr-Relat-Technol., Aug.
1998; 21 (14), 2191-2203
49
Pecavar A., Smidovnik A., Milivojevic D, Pro ek M - A reversed phase high-
performance liquid chromatography method for determination of cephalexin in human
plasma - J. High-Resolut-Chromatogr., Dec. 1997; 20 (12), 674-678
30
Tabel 1: Metodele de separare cromatografica testate in vederea selectarii

unei metode de dozare a cefalexinei din probe biologice
Cod Mod de Proporţia

Fază mobilă
metoda elutie utilizată
Tampon fosfat 0.025M
I pH=2,8: izocratic 85:7,5:7,5
acetonitril:metanol
II pH=3,0: izocratic 90:10
acetonitril
III pH=3,0: izocratic 85:7,5:7,5
acetonitril:metanol
IV pH=3,5: izocratic 90:10
acetonitril
V pH=3,5: izocratic 85:7,5:7,5
acetonitril:metanol
VI pH=4,2: izocratic 85:7,5:7,5
acetonitril:metanol
Acid acetic 1%:
VII izocratic 80:20
Acetonitril
Acid fosforic 0.1%:
VIII izocratic 85:15
Acetonitril
S-a constatat ca utilizarea unei faze mobile netamponate (acid acetic

sau acid fosforic) a condus la obtinerea unor peak-uri asimetrice (factor de
simetrie 2.54 in cazul acidului fosforic si respectiv 3.16 la utilizarea acidului
acetic).(fig. -3 si 4)
31
0.14
0.12
Cefalexin
0.10
0.08
AU
0.06
0.04
0.02
0.00
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00
Minutes
Fig. 2 Elutia cefalexinei utilizand ca faza mobila Acid fosforic 0.1%:

Acetonitril(85:15, v/v) (metoda VIII)
0.30
0.25
0.20
Cefalexin
0.15
AU
0.10
0.05
0.00
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00
Minutes
Fig. 3 Elutia cefalexinei utilizand ca faza mobila Acid acetic 1%: Acetonitril(85:15, v/v)
(metoda VII)
Prin inlocuirea solutiei de acid cu o solutie tampon, simetria peak-

urilor s-a imbunatatit considerabil (factor de simetrie 1.38). (fig. II-5)
0.25
0.20
Cefalexin
0.15
AU
0.10
0.05
0.00
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
Minutes
Fig. 4 Elutia cefalexinei utilizand ca faza mobila Tampon fosfat 0.025M pH=3,0:
acetonitril (90:10, v/v) (metoda II)
32
Inlocuirea unei parti din acetonitrilul din proba cu metanol a dus la o

imbunatatire suplimentara a formei peak-ului cromatografic: (factor de
simetrie 1.06 pentru metoda I) (fig. 6)
0.30
0.25
Cefalexin - 5.444
0.20
0.15
AU
0.10
0.05
0.00
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
Fig. 5 Elutia cefalexinei utilizand ca faza mobila Tampon fosfat 0.025M pH=2,8:
acetonitril:metanol (85:7,5:7,5, v/v) (metoda I)
Astfel, s-a optat pentru utilizarea unei faze mobile continand o

solutie tampon fosfat, acetonitril si metanol.
Prin variatii ale pH-ului fazei mobile s-a remarcat o scadere liniara a
timpului de retentie al cefalexinei cu valoarea pH-ului acesteia.
Cefalexina pH=4,2
Cefalexina pH=3,5
0.18
Cefalexina pH=3,0
Cefalexina pH=2,8
0.16
0.14
0.12
0.10
AU
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
-0.02
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00
Minutes
Fig. 6: Elutia peakurilor cromatografice in raport cu variatiile pH-ului fazei mobile
33
Variatia timpului de retentie al analitilor in functie de pH-ul fazei

mobile
7.5
Cefalexina
7 Standard Intern
y = -0.6104x + 8.9243
Peak endogen
6.5 R2 = 0.9903
Timp de retentie (min)
5.5
5
y = 0.2855x2 - 1.8765x + 7.2603
4.5 R2 = 0.9925
4
y = 0.7788x2 - 5.1694x + 12.156
3.5 R2 = 0.995
3
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
pH
Fig. 7: Variatia timpului de retentie al analitilor in functie de pH-ul fazei mobile
Alegerea pH-ului optim al a solutiei tampon s-a realizat prin

evaluarea selectivitatii metodelor testate la diferite valori ale pH-ului fazei
mobile.
Pentru aceasta, a fost necesara gasirea unei metode adecvate de
prelucrare a probelor de plasma.
Intrucat cefalexina are polaritate inalta, metodele de prelucrare a
probelor biologice utilizand extractia lichid-lichid nu sunt aplicabile in cazul
acestui compus. Dintre metodele aplicabile, cea mai uzuala ramane
deproteinizarea.
34
Au fost incercate mai multe metode de deproteinizare a probelor

biologice continand cefalexina. S-a testat deproteinizarea cu solventi
organici (acetonitril:metanol 9:1 v/v), utilizandu-se 750 μl agent de
deproteinizare pentru fiecare 500 μl de proba luata in lucru. Cantitatea mare
de solvent organic, coroborata cu volumul relativ mare de injectie necesar
din cauza diluarii probelor (100 μl), au determinat insa procesul de
“focusare”, cu deformarea peak-ului de analit, si deci cu imposibilitatea
dozarii sale.
Utilizandu-se polielectroliti pentru deproteinizare (CuSO4 sau
ZnSO4 impreuna cu acetonitril), randamentele de extractie obtinute au fost
foarte mici (in jur de 30% in cazul utilizarii CuSO4 si aproximativ 60%
pentru ZnSO4). O explicatie pentru un grad de regasire atat de scazut il
constituie faptul ca analitul formează complecşi metalici puţin solubili cu
agentul de deproteinizare, care coprecipită cu proteinele.
O alta metoda de deproteinizare testata a fost precipitarea proteinelor
din matrix-ul plasmatic cu acizi tari. Au fost utilizati drept agenti de
precipitare acidul percloric si respectiv acidul tricloracetic. In toate cazurile,
datorita complexitatii mediului din care s-a realizat dozarea au existat in
cromatograme peak-uri corespunzand unor compusi endogeni. In cazul
utilizarii acidului tricloracetic numarul mare de astfel de compusi endogeni
prezenti in probe a condus la o slaba selectivitate a separarii, motiv pentru
care s-a renuntat la utilizarea sa drept agent de precipitare. In schimb, la
utilizarea acidului percloric probele rezultate au fost mult mai curate,
aparand doar un peak endogen, cere nu interfera cu analitul.
35
0.70
0.60
0.50
Peak endogen
0.40
AU
0.30
Timpul de retentie al cefalexinei
0.20
0.10
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

Minutes
Fig. 8 Aspectul unei probe blank de plasma dupa deproteinizare cu acid percloric
Un parametru critic este cantitatea de acid. O precipitare incompletă

duce la cromatograme foarte încărcate. O precipitare completă şi rapidă
duce la pierderi de substanţă activă ca urmare a înglobării sale în cheagul de
proteine.
In scopul optimizarii cantitatii de acid utilizate pentru deproteinizare
au fost testate trei solutii diferite de acid percloric:
- solutie 12 % de acid percloric in acetonitril
- solutie 6 % de acid percloric in apa
- solutie 12 % de acid percloric in apa
S-au adaugat cate 100 μl din solutiile de mai sus la cata 500 μl proba
continand 10 μg/ml cefalexina in plasma.
S-au injectat probele in sistemul cromatografic, calculandu-se
randamentul de extractie pentru fiecare caz in parte.
36
Tabel 2: Randamentul de extractie al cefalexinei din probe de plasma, utilizand

diferite solutii de acid percloric:
Agent de deproteinizare Randament de extractie (%)
solutie 12 % de acid percloric in
65 %
acetonitril
solutie 6 % de acid percloric in apa 93%
solutie 12 % de acid percloric in apa 91%
Se remarca faptul ca prin utilizarea unei solutii de acid percloric in

acetonitril randamentul de extractie al analitului este considerabil mai mic
decat la folosirea unor solutii apoase ale aceluiasi compus.
Desi utilizand o solutie 6% gradul de regasire al analitului este ceva
mai mare decat pentru solutia 12%, aceasta din urma a fost preferata,
intrucat in cazul solutiei 6% exista riscul unei precipitari incomplete a
proteinelor, care ar fi condus atat la scurtarea considerabila a vietii coloanei
cromatografice cat si la aparitia unor peak-uri endogene suplimentare in
cromatograma.
Un alt parametru de care depinde rezultatul final (aspectul
cromatogramelor şi cantitatea de substanţă activă regasită) este compoziţia
plasmei. După ingestia de alimente, plasma este mult mai încărcată de
grăsimi, ceea ce complică toate procesele de partiţie.
Alegerea standardului intern:

În vederea alegerii standardului intern au fost testaţi mai mulţi
compuşi cu caracteristici asemănătoare în ceea ce priveşte mecanismul de
retenţie. Printre aceştia: tetraciclina, ranitidina, aciclovir si paracetamol.
37
0.90
Paracetamol
Aciclovir
0.80
0.70
0.60
0.50
Cefalexina
AU
0.40
0.30
Tetraciclina
0.20
0.10
0.00
-0.10
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00
Minutes
Aciclovirul prezinta timpi de retentie prea mici, eluand foarte

aproape de peak-ul de injectie, ceea ce face inadecvata utilizarea lor ca
standard intern.
Tetraciclina desi corespunzatoare din punct de vedere al timpului de
retentie, prezinta asimetrie avansata, neputand fi utilizat.
Paracetamolul a fost substanta aleasa ca standard intern pentru
dozarea cefalexinei din probe de plasma.
O cromatograma obtinuta in urma analizei unei probe reale obtinuta
de la un voluntar sanatos la o ora dupa administrarea a 500 mg cefalexina
p.o este prezentata in figura de mai jos:
0.70
0.65
0.60
0.55
0.50
0.45
0.40
Paracetamol - 3.739
0.35
AU
0.30
Cefalexin - 8.288
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50
Minutes
38
1.10.Validarea metodei de determinare a cefalexinei din probe de

plasma
Materiale
A. Instrumente:
Principalele echipamente necesare realizarii dozarii cefalexinei din
probe de plasma sunt prezentate in tabelul
Tabel 3: Instrumentele utilizate pentru determinarea cefalexinei din plasma
Descriere echipament Producator
Sistem cromatografic Waters, alcatuit din:
- Pompa Waters 600
- Controller Waters 600 Waters, USA
- Sistem de injectare automata a probelor Waters 712 WISP
- Detector UV Waters 486
Coloana Cromatografica Inertsil 5 ODS-2 (Varian) 150 x 4.6 mm Varian
Baie de ultrasonare Branson 1510 Branson
Centrifuga Hettich
Balanta analitica Mettler AE200 Mettler
Micropipete cu volum reglabil Finnepipette, Finlanda
B. Reactivi:
Toti solventii si toti reactivii folositi au avut puritate HPLC si au
provenit de la diferiti producatori, enumerati în continuare. Apa de puritate
HPLC, purificata printr-un sistem Millipore, a fost folosita pentru elutia
cromatografica precum si pentru prepararea probelor.
39
C. Solutii stoc:
S-a preparat o solutie stoc de cefalexina avand concentratia de 250
μg/ml prin cantarirea a 25,0 mg de cefalexina substanta de referinta si
dizolvarea sa în 100 ml apa intr-un balon cotat de aceasta capacitate.
S-a preparat o solutie stoc de Standard intrern (paracetamol) avand
concentratia de 100 μg/ml prin cantarirea a 10,0 mg de paracetamol si
dizolvarea sa în 100 ml apa intr-un balon cotat de aceasta capacitate
Metode
A. Metoda cromatografica:
Faza stationara: Octadecil silicagel modificat chimic;
Coloana: Kromasil 100-5 C18 (Akzo Nobel)
Lungimea coloanei: 150 mm
Diametrul intern al coloanei: 4,6 mm
Temperatura coloanei: 45°C
Faza mobila: (Toti solventii Solvent A: Solutie tampon fosfat 0,025M,
au puritate HPLC) pH=2,8
Solvent B: Acetonitril:metanol =1:1 (v/v)
Compozitia fazei mobile: Solvent A: Solvent B= 85:15 (v/v)
Debit: 1 ml/min.
Detectie: UV,  = 261 4 nm
Volum de injectie: 100 µl
Tip de injectie: Automata
40
B. Metoda de prelucrare a probelor:

S-au prelevat cate 500 μl din fiecare proba de plasma in eprubete de
unica folosinta. In fiecare proba (mai putin in blank-uri) s-a adaugat cate 50
μl solutie standard intern (solutie de paracetamol in apa 100 µg/ml. S-au
adaugat 100 µl solutie acid percloric 12% (agentul de deproteinizare) in
fiecare proba. Probele astfel tratate au fost agitate energic timp de 1 minut si
apoi centrifugate 10 minute la 4000 rpm. Supernatantul obtinut a fost
transferat in fiolele autosampler-ului si 100 μl din ele au fost injectate in
sistemul cromatografic.
Solutii standard pentru calibrare si probe de control

A. Standarde de calibrare: Din solutia stoc de cefalexina (S0) au fost
preparate, prin dilutii succesive in plasma blank, probele standard utilizate
pentru a genera curba de calibrare pentru dozarea analitului din probe de
plasma
B. Probe de control: Aceste probe au avut ca rol principal verificarea
preciziei si acuratetiei metodei analitice, atat in cadrul validarii pre-studiu,
cat si in timpul desfasurarii studiului analitic. In afara de parametrii mai sus
mentionati, in practica ele sunt utilizate si pentru studiul stabilitatii analitilor
in diverse conditii.
Probele de control s-au preparat avand trei concentratii diferite, una
mica, una medie iar ultima mare, concentratii incluse in domeniul de
linearitate definit de concentratiile minima si maxima ale standardelor de
calibrare.Prepararea lor s-a realizat pornind de la solutia S0, preparata
separat de cea folosita pentru curba de calibrare.
41
Parametrii validarii
Selectivitatea metodei:
Prezentare: Selectivitatea este proprietatea metodei analitice de a diferentia
analitul în prezenta altor compusi din proba. Selectivitatea demostreaza
capacitatea metodei cromatografice de a separa cefalexina si paracetamolul
(standard intern) de componentele din matricea plasmatica.
Descriere: 6 probe blank si o sloutie standard continand toti compusii din
proba (cefalexina si paracetamol) s-au prelucrat simultan si s-au injectat in
sistemul cromatografic.
Criterii de acceptare: nu trebuie sa existe in probele de plasma interferente
ce ar putea impiedica cuantificarea analitilor.
Linearitatea:
Este o operatie destinata masurarii capacitatii atat a metodei de
preparare a probelor cat si a metodei cromatografice, de a produce rezultate
aflate într-o relatie de linearitate cu concentratiile analitilor din probele
plasmatice.
Din punct de vedere practic, au fost prelucrate cate trei probe din
fiecare dintre standardele de calibrare (probele de la S1 la S8 continand
cantitati descrescatoare de analit, proba zero necontinand analitul dar avand
standard intern si proba blank fiind plasma umana fara nici un adaos) si apoi
injectate in sistemul cromatografic in ordinea crescatoare a cantitatilor de
analit (deci incepand cu blank-ul si terminang cu S1).
Pentru fiecare cromatograma rezultata s-au integrat picurile, s-a
calculat aria medie si deviatia standard corespunzatoare. Calculele s-au
42
realizat raportand ariile picurilor corespunzatoare pentru analit la ariile

picurilor corespunzatoare standardului intern.
Criteriul de acceptare:
Coeficientul de corelatie pentru cefalexina sa fie mai mare decat
0,99.
Rezultatele testarii linearitatii metodei analitice pentru cefalexina
sunt prezentate in cele ce urmeaza:
Fig. 9: Linearitatea metodei cromatografice de dozare a cefalexinei
43
Evaluarea limitei de cuantificare (LLOQ):
Principiu:
Valoarea minima a standardului de pe curba de calibrare este
acceptata ca limita de cuantificare daca urmatoarele conditii sunt
îndeplinite:
 Raspunsul analitului la LLOQ ar trebui sa fie de cel putin 5 ori
raspunsul blank-ului.
 Raspunsul analitului (picul cromatografic) ar trebui sa fie identificabil,
reproductibil, cu o precizie de 20% si acuratete de 80-120%.
Descriere:
Limita de cuantificare a metodei a fost stabilita la 0.25 μg/ml. Pentru
validarea acestei valori ca LLOQ, 6 probe continanad 0.25 μg/ml cefalexina
(S8), au fost prelucrate si analizate. Dupa integrarea picurilor, s-a calculat
precizia, acuratetea, precum si raportul intre marimea semnalului
detectorului in probele blank si marimea semnalului detectorului la
concentratia testata ca LLOQ.
Cth Aria pic EXP 3174(µAU*s) Concentratia Precizia
Acuratetea
(μg/ Proba Proba % proba analitului medie (CV
medie
ml) LLOQ Blank blank (μg/ml) %)
19403 Np* 0 0.251
*
18706 Np 0 0.253
*
19149 Np 0 0.252
0.25
-0.77 2.13
17037 Np* 0 0.247
*
18738 Np 0 0.247
*
18399 Np 0 0.238
Np*=nu este prezent (picul nu poate fi detectat în proba blank)
44
Evaluarea acuratetii si preciziei metodei analitice:

Acuratetea metodei analitice descrie apropierea de media rezultatelor test
obtinute de metoda, fata de valoarea reala (concentratia) a analitului.
Precizia metodei analitice descrie apropierea masuratorilor individuale ale
analitului cand procedura este aplicata repetat la multiple analize ale mai
multor probe omogene de matrice biologice.
Acuratetea si precizia se determina atat intra-sencenta (cand probele
se analizeaza in cadrul aceleiasi secventa analitice), inter-secventa (probele
sunt analizate pe parcursul unor secvente de lucru diferite).
Criterii de acceptare:
Valoarea medie a acuratetei trebuie sa fie în intervalul ± 15% fata de
valoarea reala, exceptand limita de cuantificare (LLOQ) unde poate sa
varieze cu pana la 20%.
Precizia detereminata la fiecare nivel de concentratie, coeficientul de
variatie netrebuind sa depaseasca 15%, exceptand LLOQ limita este de
20%.
Descriere si rezultate:
Pentru testarea acuratetii si preciziei metodei analitice s-au utilizat
probele de control (QC1, QC2 si QC3). Pentru evaluarea acuratetii si
preciziei intra-secventa se realizeaza analiza succesiva a cate cinci probe
pentru fiecare dintre cele trei niveluri de concentratie. In cazul testelor inter-
secventa, cate un set de probe de control (QC3,QC2 si QC1) este analizat in
decursul a cinci secvente de lucru diferite (o secventa reprezentand o
45
perioada de timp in care nu se modifica nici un parametru al analizei

cromatografice, iar sistemul functioneaza fara intrerupere).
Acuratetea s-a evaluat dupa formula:
Acuratete % = Cexp/Cth x 100
unde
- Cexp reprezinta concentratia experimentala, obtinuta in urma interpolarii
curba de calibrare
- Cth reprezinta concentratia reala de analit in proba de control
Precizia metodei s-a exprimat prin intermediul coeficientului de
variatie, CV, definit ca raportul intre deviatia standard si valoarea medie a
concentratiei.
Randamentul de extractie:
Pentru testarea acuratetii si preciziei metodei analitice s-au utilizat
probele de control (QC1, QC2 si QC3) si un set de probe standard de
concentratii egale celor din probele de control, cu deosebirea ca preparerea
lor s-a facut prin dilutie cu faza mobila in loc de plasma. Probele de control
au fost prelucrate conform metodei prezentate anterior, in timp ce dilutiilor
in faza mobila li s-a adaugat standard intern (50 μl) si 100 μl de faza
mobila, pentru ajustarea volumului probei.
Dupa analiza ambelor tipuri de probe (extrase si neextrase), s-a
realizat compararea raspunsului detectorului pentru probele de accesi
concentratie, evaluarea randmentului de extractie s-a realizat prin raporterea
ariei picului din proba extrasa la aria picului din proba neextrasa de
concentratie egala.
46
Stabilitatea:
Stabilitatea solutiei stoc
Stabilitatea solutiei stoc de analit si de standard intern trebuie
evaluata la temperatura ambienta pentru cel putin 24 ore. Daca soutiile stoc
sunt pastrate la frigider pentru o perioada determinata, stabilitatea trebuie
documentata.
Dupa trecerea timpului determinat de stocare, stabilitatea trebuie
testata comparand raspunsul instrumentului cu raspunsul instrumentului
pentru solutiile proaspete.
Descriere:
Stabilitetea solutior stoc de analiti si standard intern a fost testata
dupa 24 de ore de mentinere la temperatura ambianta, dar si dupa
mentinerea timp de 20 zile in frigider. Rezultatele testelor au demonstrat
stabilitatea tuturor produsilor pe intreaga perioada testata.
Tabel II- 4 Evaluarea stabilitatii solutiei stoc de cefalexina:
Acuratete %
Aria
Conditii de pastrare (comparare vs.
(µAU*s)
control)
Solutia proaspata 962422 -

Solutia 24 ore la temperatura
945401 -1.77
ambianta
Solutia 16 zile in frigider (+4˚C) 980052 1.83
Solutia 20 zile in frigider (+4˚C) 964265 0.19
47
Stabilitatea post-preparativa:
Pentru testarea stabilitatii probelor procesat au fost utilizate patru
seturi de probe de control. Acestea au fost prelucrate si analizate la
momente difeite: primul set a fost analizat imediat dupa preparare, cel de-al
doilea dupa 4 ore, cel de-al treilea dupa 8 ore iar cel de-al patrulea dupa 24
ore. Rezultatele testului au demonstrat ca probele procesate sunt stabile cel
putin 24 ore.
Tabel 5 Evaluarea stabilitatii post-preparative a probelor de plasma continand
cefalexina
Acuratete %
Nivel Concentratie
Conditii pastrare (comparare
concentratie (μg/ml)
vs. control)
Initial 0.804 -
QC 3 4 ore la temperatura ambianta 0.778 -3.20
(0.75 μg/ml) 8 ore la temperatura ambianta 0.747 -7.06
24 ore la temperatura ambianta 0.739 -8.01
Initial 7.790 -
QC 2 4 ore la temperatura ambianta 7.728 -0.78
(7.5 μg/ml) 8 ore la temperatura ambianta 7.719 -0.90
Initial 29.836 -
QC 1 4 ore la temperatura ambianta 30.711 2.93
(30.0 μg/ml) 8 ore la temperatura ambianta 31.013 3.95
Stabilitatea la cicluri de inghet-dezghet :

Stabilitatea cefalexinei a fost studiata dupa trei cicluri de inghet-
dezghet. Pentru aceasta s-au utilizat probe la doua nivele de concentratii,
mic si mare (respectiv s-au folosit QC3 si QC1). Au fost efectuate initial
48
cate trei analize pentru fiecare nivel de concentratii (probe proaspete), apoi
probele au fost supuse la trei cicluri de inghet-dezghet. Dupa cel de-al
treilea, au fost efectuate inca trei analize pentru fiecare nivel de concentratie
luat in lucru. Prin compararea rezultatelor s-a demonstrat ca cefalexina este
stabila la ingheteri si dezghetari repetate.
Tabel 6- Stabilitatea cefalexinei la inghet-dezghet
Nivele Concentratii Concentratii dupa 3
Acuratete
concentratie initiale Media cicluri inghet/dezghet Media
(%)
(μg/ml) (μg/ml) (μg/ml)
29.436 28.121
QC1
30.028 30.231 27.590 27.825 -7.96
(30 μg/ml)
31.229 27.765
0.791 0.700
QC 3
0.774 0.780 0.723 0.709 -9.18
(0.75 μg/ml)
0.775 0.703
Stabilitatea pe termen scurt:

Testul se refera la testarea stabilitatii in timp a probelor neprocesate.
Pentru realizarea sa au fost utilizate probele de control (QC1, QC2 si QC3).
Un prim set de probe a fost procesat imediat dupa preparare, apoi probele
neprocesate au fost mentinute la temperatura camerei. Dupa 4, 8 si respectiv
24 ore, un al doilea al treilea si un al patrulea set de probe au fost prelucrate
si analizate. Testul a demonstrat stabilitatea cefalexinei cel putin 24 ore in
probe mentinute la temperatura camerei.
Stabilitatea pe termen lung:

Stabilitatea pe termen lung a fost evaluata prin pastrarea de probe de
control in aceleasi conditii cu probele reale (-20˚C), si analiza lor cu trei
49
ocazii diferite pe parcursul studiului (testele s-au efectuat pe durata de 3

luni). Rezultatele au demonstrat stabilitatea analitului pe toata perioada
studiului.
3.20
3.00
2.80
2.60
2.40
2.20
2.00
1.80
1.60
Area Ratio
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
-0.20
-0.40
-0.60
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00
Amount
50
Curbe de calibrare medii obtinute la validarea

inainte si respectiv in timpul studiului (cu SI)
3.0 y = 0.0513x + 0.0044
R² = 1
2.5
2.0
Arie analit/ Arie SI
y = 0.0505x - 0.0034
R² = 0.9998
1.5
1.0
Validare inainte de
studiu
0.5
0.0
0 10 20 30 40 50 60
Concentratie (ug/ml)
51
Curbe de calibrare medii obtinute la validarea

inainte si respectiv in timpul studiului (fara SI)
3500000
y = 61645x - 23390
3000000 R² = 0.9969
2500000 y = 59391x - 21445
R² = 0.9995
Arie analit
2000000
1500000
1000000
500000 Validare inainte de

studiu
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentratie (ug/ml)
52

13 Cap 1 Validarea Metodelor Bioanalitice PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

13 Cap 1 Validarea Metodelor Bioanalitice PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Cap. 1.

Validarea metodelor bioanalitice

Cap. 1. Validarea metodelor bioanalitice

poate furniza o dovadă suficientă că metoda dezvoltată este adecvată pentru

Validarea unei metode bioanalitice18 19 20 21 include toate procedurile

multe locuri, se impune validarea metodei analitice în fiecare laborator şi

Validarea metodelor analitice – Istoric (SUA)

 Pharmacopoeial Forum – current concept for the validation of

 Federal Code of Regulation – Guidelines for submitting samples and

 Pharmacopeial Forum Validation of compendial assays – Guidelines

 FDA: Center for Drug Evaluation end research – Validation of

 ICH-Q2A / ICH-Q2B: Validation of analytical procedures: definitions

 FDA – CDER Draft – Analytical procedure and method validation

Din considerentele enumerate anterior, stabilirea unor criterii de

 Testing laboratory act (Noua Zeelandă – 1972)

 Nota explicativă a Comisiei CE (1989)

 Conferinţa de la Washington (Arlington) (1990)

 Conferinţa de la Barcelona (1992)

 Conferinţa de la Munchen (1994)

 Comisia SFSTP (1997)

 Conferinţa de la Washington (2000)

 AAPS, Indianapolis (2000)

 FDA, Bioanalytical Method Validation (2001)

 Bioval, Londra (02/2002)

 Bioval, Londra (02/2004)

 Conferinţa de la Washington (2006)

1.2. Tipuri de validare a metodelor

1.2.1. Validarea completă

1.2.2. Validarea parţială

 schimbarea instrumentului şi/sau programelor informatice;

1.2.3. Validarea încrucişată

LC-MS-MS, faţă de ELISA) în studii diferite sunt incluse într-un material

1.3. Standardul de referinţă

- alte materiale de puritate documentată sintetizată la comandă într-

1.4. Dezvoltarea metodei: analiza chimică

1.4.2. Acurateţea, precizia şi regăsirea

 precizie sau repetabilitate între cicluri analitice, inter-loturi, care

1.4.3. Calibrare/curba standard

exemplu din fluidul cerebrospinal, trebuie să fie selectată o matrice

Limita inferioară de cuantificare

Toate determinările de stabilitate trebuie să utilizeze un set de probe

1.5. Principii ale validării şi stabilirii metodei bioanalitice

Este necesar să se foloseasca un număr suficient de standarde pentru

Analiza repetată a mostrelor penetrate de obicei nu este necesară. Orice

1.6. Recomandări specifice pentru validarea metodei

Pentru validarea unei metode bioanalitice, acurateţea şi precizia vor

evaluare în timpul dezvoltării şi validării metodei, şi poate continua în

1.7. Aplicarea metodei validate la analiza de rutină a

necunoscute prin extrapolare sub LLOQ sau peste limita superioară a

1.8. Documentarea şi arhivarea datelor analitice

 informaţii rezumative asupra datelor QC utilizate pentru acceptarea

1.9. Proiectarea si validarea unor metode bioanalitice specifice -

Dupa administrarea orala a 500 mg cefalexina concentraţia

Fig. 1 : Structura chimica a cefalexinei

Denumire chimica: (6R,7R)-7-[[(2R)-Aminofenilacetil]amino]-3–metil–8–

in apa, 1:30 in acid clorhidric 0,2% , practic insolubila in etanol, cloroform

Fig. 1: Spectrul de absorbtie in UV al Cefalexinei

Compusul este un "zwitterion"; molecula contine atat radicali: bazici

cromatograme foarte incarcate. O precipitare completă şi rapidă duce la

O metoda alternativa utilizata tot mai mult in ultima perioada pentru

Structura de “zwitterion” a cefalexinei o face insa susceptibila de a

Optimizarea metodei de prelucrare a probelor de plasma continand

un volum de injecţie de 10 μl)47 sau HPLC-MS (limita de detecţie 0.25