Probleme generale ale analizei

medicamentelor
FR X - capitolul “Monografii- Metode generale de analiză”:
 Prelevarea probelor pentru analiză.
 Controlul organoleptic
 Determinări fizice şi fizico-chimice
 Determinări cantitative
 Determinări farmacognostice
 Determinări farmacotehnice
 Determinări biologice şi biochimice
 Controlul preparatelor radiofarmaceutice

 Analiza medicamentului defineste in sens larg

examinarea partilor constituiente ale unui intreg
reprezentat de medicament, presupunand specific
determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei
si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand
strategii, metode si instrumente caracteristice.
1
 MEDICAMENT/
SUBSTANTA 1. Prelevarea probei
MEDICAMENTOASA

2. Pregatirea probei
PROBA FINALA pentru analiza PROBA REPREZENTATIVA
DE ANALIZAT

3. Determinari experimentale
(preliminare, calitative, cantitative) DATE
- direct, fara pregatire EXPERIMENTALE
- dupa o prelucrare specifica

4. Evaluarea critica
a rezultatelor

REZULTATUL ANALIZEI
BULETIN DE ANALIZA
2
 PRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZA

« Probele prelevate pentru determinarile calitative şi

cantitative trebuie să reprezinte, sub toate aspectele,
caracteristicile produsului din lotul sau seria respectiva»
(FR-X)

FR-X:
• lot - o cantitate de materie primă, presupusă a fi unitară,
din care se obţin una sau mai multe serii de produse

• serie - totalitatea unităţilor de produs obţinute în condiţii

identice, într-un singur ciclu de operaţii

• recipient - conţine unităţile de produs care constituie o

serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.

• ambalaj - conţine recipientele grupate adecvat

3
 PRELEVAREA PROBELOR

DEPOZIT FARMACII

Lot Serie Subst. farm. Prep. ind. Elaborate

Laborator
Cantitate – 4p Cantitate – 3p Cantitate – 3p Cantitate – 2p
Masa de analiza Cantitate – 3p
2p proba 2p proba 2p proba 1p proba
Cantitate – 1p 2p proba
2p contraproba 1p contraproba 1p contraproba 1p contraproba
1p contraproba

4
 CONTROLUL ORGANOLEPTIC

Aspect

Miros CONTROL ORGANOLEPTIC Gust

Culoare

5
 DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE ŞI
CHIMICE
DETERMINAREA SOLUBILITĂŢII

 prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ

privind solubilitatea substanţelor în diferiţi solvenţi
 prevederile înscrise în cadrul altor alineate, cum ar fi
"solubilitatea în alcool", au un caracter obligatoriu, fiind
considerate teste de puritate
 Solubilitatea poate fi exprimată prin specificarea volumului de
solvent (în mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substanţă solidă
sau 1 ml substanţă lichidă, la temperatura de 20  20C.
 Verificarea solubilităţii substanţelor farmaceutice nu este
necesar să se efectueze în toţi solvenţii prevăzuţi în monografie,
ci este necesar să se controleze solubilitatea în cel puţin doi
solvenţi diferiţi.
 Dacă se constată prezenţa unor impurităţi insolubile, se verifică
solubilitatea şi în ceilalţi solvenţi prevăzuţi.

6
 Diferitele solubilităţi pot fi exprimate şi cu ajutorul unor
expresii - în acest caz prevederile de solubilitate se referă la
temperatura de 20  5oC.

Expresii folosite Volumul de solvent (ml) necesar pentru a

dizolva 1 g substanţă solidă sau 1 ml
substanţă lichidă
foarte uşor solubil cel mult 1 ml
uşor solubil de la 1 ml până la 10 ml
solubil de la 10 ml până la 30 ml
puţin solubil de la 30 ml până la 100 ml
foarte puţin solubil de la 100 ml până la 500 ml
greu solubil de la 500 ml până la 1000 ml
foarte greu solubil de la 1000 ml până la 10.000 ml
practic insolubil mai mult de 10.000 ml

7
 DETERMINAREA INDICILOR
 Indice de aciditate = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor graşi liberi
conţinuţi în 1 g probă de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase,
balsamuri, ceruri etc.).

 Se calculează conform formulei:

5.61  V
I 
A m
în care:
- IA = indice de aciditate
- V = volumul de KOH 0.1 mol/l în apă folosit la titrare (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 5.61 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.1
mol/l.

8
 Indice de saponificare = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi şi a acizilor
rezultaţi din saponificarea a 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IS 
m
în care:
- IS = indice de saponificare
- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH
0.5 mol/l în alcool.

9
 Indice de ester = numărul de miligrame de hidroxid de potasiu
necesar pentru neutralizarea acizilor graşi rezultaţi din
saponificarea a 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

în care:
- IE = indice de ester
- IS = indice de saponificare
- IA = indice de aciditate.

10
 Indice de hidroxil = numărul de miligrame de hidroxid de
potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1
g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  28.05
IH   IA
m

în care:
- IH = indice de hidroxil
- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l în alcool folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- IA = indice de aciditate
-28.05 = numărul de miligrame de KOH corespunzător la 1 ml KOH 0.5
mol/l în alcool.

11
 Indice de iod = numărul de grame de iod fixat de 100 g probă
de analizat.

 Se calculează conform formulei:

(V1  V2 )  0.01269
II  .100
m

în care:
- II = indice de iod
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame)
- 0.01269 = numărul de grame de iod corespunzător la 1 ml Na2S2O3
0.1 mol/l.

12
 Indice de peroxid = numărul de mililitri de tiosulfat de sodiu
0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin
acţiunea peroxizilor din 1 g probă de analizat.

 Se calculează conform formulei:

10  (V2  V1 )
Ip 
m
în care:
- IP = indice de peroxid
- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului
(ml)
- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)
- m = masa probei luate în lucru (grame).

13
 DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIRE
 Punct de topire = temperatura la care o substanţă se topeşte
complet.
 Dacă substanţa se topeşte cu descompunere, se consideră punct de
topire sau punct de descompunere, temperatura la care substanţa
îşi schimbă aspectul (se brunifică sau apar bule de gaze).

 p.t. substanţe solide pulverizabile

 se efectuează în dispozitive speciale

sau într-un balon Kjeldahl cu
capacitatea de 150 - 250 ml, în care
se introduce un termometru potrivit.
 la termometru se ataşează, cu
ajutorul unui inel de cauciuc sau prin
aderenţă, un tub capilar din sticlă,
închis la un capăt.
 ca lichid de încălzire se foloseşte:
- apa distilată – p.t. < 700C
- parafina lichidă, acidul sulfuric sau
uleiul de silicon - p.t > 700C

14
 Determinare:
 proba de analizat pulverizată şi uscată se introduce în tubul capilar şi se tasează
pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm înălţime
 tubul capilar se ataşează la termometru
 incălzirea se efectuează astfel încât temperatura să se ridice cu 3 - 40C/minut.
 se citeşte temperatura la care substanţa se topeşte complet.
 În cazul substanţelor care se descompun prin încălzire prelungită, balonul se
încălzeşte, în prealabil, până la o temperatură cu aproximativ 100C sub punctul
de topire presupus, după care se ataşează capilarul cu substanţa şi se continuă
încălzirea astfel încât temperatura să se ridice cu 1 - 20C/minut.
 Dacă punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectuează, în
prealabil, o determinare orientativă.

15
 În unele cazuri, specificate în monografii, punctul de topire se determină
cu un microscop special prevăzut cu un dispozitiv de încălzire.

Termomicroscopie ( microscop Boetius ) 6

1 – sursă de lumină
2 – masă de probă încălzită
3 – termometru
4 – obiectiv
5
5 – sursă de lumină
6 – ocular
4
7 – mâner pentru poziţionarea probei
2

7 3
16
 DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ÎN ALCOOL
 se bazează pe distilarea alcoolului
 se determina densitatea sau indicele de refracţie a distilatului
hidroalcoolic.

 Determinare:
 se foloseşte un aparat de distilare cu alonjă care trebuie să pătrundă în
apă
 se distilă nu mai mult de 30 minute
 se determină densitatea relativă cu ajutorul picnometrului şi se citeste
concentraţia în alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.

 se calculează dupa formula:

în care:
- c = concentraţia în alcool a distilatului
corespunzătoare densităţii relative (% m/V)
- m = masa probei luate în lucru (g).
17
prin volatilizare cromatografice
- Distilare

METODE DE SEPARARE

prin extracţie:
- lichid-lichid
- solid-lichid
- in faza solida
- cu fluide supercritice
18
METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE
- DISTILAREA -

 Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si

purificare a lichidelor.
 Separarea se bazează pe diferenţele dintre presiunile de vapori
ale lichidelor care compun un amestec.
 Pe scurt, distilarea presupune încălzirea lichidelor, separând
vaporii si recondensându-i pentru a obţine un nou lichid care
va fi concentrat în compuşi mai volatili.

PARAMETRII DE LUCRU ŞI EFICIENŢĂ:

 echilibrul de distributie vapori-lichid
 volatilitatea relativa
 talerul teoretic

19
Curbe de distilare

20
 METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE

EXTRACŢIA LICHID – LICHID

 Extracţie = transferul unei substanţe dizolvate dintr-un solvent

în alt solvent nemiscibil cu primul.

 Distribuţia substanţei respective între cele două faze depinde de

solubilitatea acesteia în cei doi solvenţi.
 Componenţii supuşi distribuţiei interfazice manifestă preferinţe
pentru unul sau altul dintre solvenţi, participând selectiv la
procesul de transfer.

 Dacă la echilibru concentraţiile componenţilor sunt sensibil

diferite între cei doi solvenţi, procesul poate fi utilizat în scopul
separării lor.

21
 Etape in extracţia lichid – lichid:
1. formarea speciei extractibile şi punerea sa în contact cu
sistemul de solvenţi adecvaţi

2. sedimentarea

3. decantarea

4. determinarea cantitativă a componenţilor izolaţi

5. recuperarea solvenţilor

 Etapa cea mai importantă este cea de selecţionare a sistemului de

solvenţi şi stabilirea formei sub care este extrasă substanţa. Aceasta
se poate realiza prin cunoaşterea parametrilor procesului de extracţie
care sunt:
● constanta de repartiţie
● coeficientul de extracţie
● factorul de recuperare.
22
PROCEDEE DE EXTRACŢIE LICHID-LICHID

 După sensul de curgere al lichidului şi după principiul

de funcţionare al instalaţiei:

1. Extracţia simplă
2. Extracţia continuă
3. Distribuţia în contracurent.

23
 EXTRACŢIA SOLID-LICHID
Principii generale
 se aplică atunci cand este o fază solidă sau semi-solidă (material vegetal, pulberi
de forme farmaceutice solide etc.)
 implică operaţiile de extracţie de tip percolare, filtrare şi spălare.

 Are 2 etape, realizate în acelaşi aparat sau în aparate separate:

o contactul solventului cu materialul solid supus extracţiei şi transferul
constituientului solubil (solut) în solvent
o separarea sau spălarea soluţiei de reziduul solid

 Procesul complet include recuperarea solutului separat şi a solventului, prin

evaporare sau distilare.

APARATURA
 depinde de prima etapă
 termeni ce indicǎ tipul de aparat utilizat:
o “solid bed” sau “fixed bed” - se referă la orice operaţie în care prin materialul
solid fix trece solventul utilizat pentru extracţie
o “dispersed contact” - se referă la operaţiile în care particulele solide, suspendate
în fluid sunt în mişcare relativă unele faţă de altele şi faţă de solvent, în timpul
contactului solid-solvent.

24
 EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA
(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)

 este un proces de separare prin care compuşi dizolvaţi sau suspendaţi

într-un amestec lichid sunt separaţi de alti compusi din amestec în funcţie
de proprietăţile lor fizice şi chimice

poate fi folosită pentru a izola analiţii de interes dintr-o mare varietate de

matrici, inclusiv urină, sânge, apă, băuturi, sol, şi ţesuturi de origine
animală

 utilizează afinitatea substanţelor dizolvate sau suspendate într-un lichid

(faza mobilă), pentru un solid prin care proba este trecută (faza staţionară)
pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite şi nedorite

 rezultatul
 analiţii de interes doriţi sau impurităţile nedorite din proba sunt reţinute
pe faza staţionară
 partea care trece prin faza staţionară este colectată sau casată (daca
conţine analiţii doriţi sau impurităţile nedorite)
 in cazul în care porţiunea reţinută în faza staţionară include analiţii doriţi,
aceştia pot fi apoi separaţi din faza staţionară prin colectare printr-un
proces suplimentar, în care faza staţionară se spală cu un eluent
corespunzător.
25
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTĂ PERFORMANŢĂ
HIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
 Cromatografia de lichide de înaltă performanţă/înaltă presiune
(High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau
de înaltă viteză (High Speed Liquid Chromatography – HSLC) este
o tehnică:
 modernă şi rapidă care elimină unele dezavantaje ale
cromatografiei planare
 utilizată pentru separarea şi determinarea soluţilor organici şi
anorganici din orice probe, în special substanţe şi produse
farmaceutice, biologice, alimentare, industriale, de mediu etc.

Clasificare
În funcţie de mecanismele care stau la baza separării
componentelor, cromatografia de lichide se clasificǎ astfel:
 cromatografie prin adsorbţie
 cromatografie prin repartiţie
 cromatografie cu faze inverse
 cromatografie prin schimb ionic
 cromatografie prin excluziune moleculară.
26
 APARATURA
Schema unui cromatograf HPLC

-1-2 sau mai multe rezervoare cu solventi

- o pompă de înaltă presiune
- sistem de degazare
- injector pentru introducerea probei
- (precoloane) coloane cromatografice
- detectoare
- sistem de prelucrare a datelor
27
 APLICAŢIILE HPLC
ANALIZA CALITATIVA
 Separarea si identificarea substanţelor medicamentoase

Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa

cromatografiere prin:
 Metode cromatografice:
- Dupa marimile de retentie
- Metoda adaosului standard
- Metoda retentiei relative
 Metode spectrale
Alcaloizi din ergot
elimoclavina lisergol

CH2OH
H CH2OH

H
N CH N CH
3 3
H H

HN
HN

28
  Atenolol Condiţii:
 Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm
 Faza mobilǎ: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM
H2N
NH4OAc
O  Viteza de curgere: 1 ml/min;
O N  Detecţie: 254 nm
OH H  Timp de curgere = 16 min
 K’ = 4.41
 =1.13

Bupivacaina
Condiţii:
 Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d.

CH3  Faza mobilã:hexan-n-propanol-trietilamina

H H
N (80:20:0.1)
N  Viteza de curgere : 1 ml/min
O  Detecţie : 254 nm
CH3 CH3  Timp de curgere: 7-8 min
 K’ = 1.89
  = 1.25

29
  Efedrina
Condiţii:
CH3  Coloana: Chiral AGP
H C NH CH3  100 x 4.0 mm
H C OH  Precoloanã: Chiral AGP, 10 x 3.0 mm
 Faza mobilã: ac. octanoic 0.001 M în
tampon fosfat pH 7.0
 Detecţie: 225 nm

Ketoconazol Condiţii:
•Coloana: (S,S)Whelk-O 1
•10/100(FEC) 25 x 4.6 mm
N
•Faza mobilã: Diclormetan-hexan-
IPA + 0.011 M acetat de amoniu
N
O (46:46:8)
O
N N O
•Viteza de curgere: 1.5 m>/min
H3C
H
O
•Detecţie: 254 nm
Cl
Cl
•Timp de reţinere: 16 min
•K’ = 6.60
• = 1.19

30
  Analiza produşilor modificaţi chimic (prin derivatizare)

 este adesea necesară pentru a atinge o cromatografie

satisfăcătoare.
 se aplică pentru componentele de toate polarităţile şi greutăţile
moleculare şi este un avantaj al HPLC faţă de gaz-cromatografie.
 Este utilizată pentru a creşte sensibilitatea detecţiei cand
detectările utilizate nu sunt satisfăcătoare pentru componentele
nederivate.
 Absorbţia în UV şi fluorescenţa pot fi obţinute cu ajutorul unor
reactivi.
 UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazină şi 3,5-
dinitrobenzen (DNBC).
 derivaţii fluorescenţi pot fi formaţi cu agenţi de tipul: cloruri de
dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) şi cu unele
amine fluorescente.

31
  Detectarea imunologică

 Tehnica implică colectarea de solvent în fracţiuni mici (1 ml) şi prelevări

de medicament în fracţiuni.

 Necesitã mult timp, dar au reversibilitate şi selectivitate mai mare decat

detectările convenţionale.

 În multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct în coloană.

 HPLC cu detectare imunologică este utilizată pentru analiza

metaboliţilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracţie
(glucuronidele). Astfel de compuşi polari nu pot fi observaţi în concentraţii
mici prin detectări convenţionale, ele fiind mascate de componentele
endogene.

 Poate fi utilizată pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor,

lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.

32
ANALIZA CANTITATIVA
 Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria (inaltimea)
picului si concentratia componentului respectiv.

 Metodele de determinare constau in masurarea:

 Aria picului:
- metode manuale
- metode electronice
 Concentratia probei:
- metoda normarii ariilor
- calibrare cu standard extern
- metoda standardului intern
- metoda adausului standard

33
 Determinarea cantitativã a substanţelor farmaceutice

 Determinarea cantitativã a vitaminei B-12 din ser

Condiţii:
• HPLC/ICP-MS
• ICP = Inductively coupled plasma emission spectrometer
• HPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100,
Waitress’s LC
• Coloana:COSMOSIL, 5C18-AR
• Faza mobilã: apã-ac.acetic-isopropanol (90:1:9)
• Viteza de curgere: 10 ml/min

 Determinarea amitriptilinei şi perfenazinei

Condiţii:
• HPLC/Agilent 1000
• Coloana: cianopropil
• Faza mobilã: acetonitril-metanol-fosfat monopotasic
• Viteza de curgere 2.0 mL/min
• Detecţie: UV 215 nm

34
 Determinarea omapatrilatului din plasmã (inhibitor de
endopeptidazã)
Condiţii
S H •HPLC: Waters 510 HPLC pump,
O Waters automated gradient
HS
N •Coloana analiticã BDS Hypercil C8 (3
H O
COOH
m, 50 mm×2 mm ID) precedatã de
Hypercil C8.
•Faza mobilã: 62.5 % apã şi 37.5 %
acetonitril, cu acetat de amoniu 1
mmol/L la pH 5.5.
•Viteza de curgere: 0.2 mL/min,
•Volumul injectat 25 L.
 Alte determinǎri cantitative
• Determinarea activităţii antioxidante a capsaicinei;
• Determinarea cantitativă a aminoacizilor din lichidul
cefalorahidian;
• Determinarea cantitativǎ a cumarinei din extracte alcoolice.

35
 GAZ – CROMATOGRAFIA
GAS-CHROMATOGRAPHY (GC)
Definitie
Atunci când se foloseşte un gaz ca fază mobilă într-un sistem
cromatografic, tehnica este denumită gaz-cromatografie (GC,
cromatografie de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Această tehnică
se efectuează întotdeauna într-o coloană cromatografică deoarece faza
mobilă trebuie să curgă în mod continuu.

Clasificare
 cromatografia gaz-lichid (GLC):
- faza staţionară este un lichid
- fenomenul de separare are loc prin repartiţie cromatografică
 cromatografia gaz-solid (GSC)
- faza staţionară este o suprafaţă solidă
- fenomenul de separare are loc prin adsorbţie.

36
 APARATURA
Filters/Traps Data system
H

RESET

Regulators Syringe/Sampler

Inlets

Detectors
Gas Carrier
Hydrogen
Air

Column

37
APLICAŢIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI

1. Identificarea compuşilor medicamentoşi si cercetarea

impuritatilor

 se folosesc mărimile de reţinere VR şi tR

 identitatea timpului de reţinere al unui component cu acela al aceluiaşi
component pur oferă un indiciu că cei doi componenţi sunt identici
 timpii de reţinere sunt proporţionali cu punctele de fierbere ale
componenţilor care ies din coloană în ordinea acestora
 folosind diferite faze staţionare selective componenţii se pot separa chiar
dacă au aceleaşi puncte de fierbere
 timpul de retenţie depinde de diferiţi factori (lungimea coloanei, diametru,
temperatura). Din această cauză, în scopuri calitative se utilizează aşa-
numiţii timpi de retenţie relativi, trr, definiţi prin relaţia:

unde:
tA = timpul de retenţie al componentei A;
tet = timpul de retenţie al etalonului.
38
 Se practică adăugarea în amestecul de analizat a unei componente
pure. Dacă are loc creşterea pe cromatogramă a maximului ce
corespunde componentului adăugat, aceasta se consideră drept
dovadă a identităţii componentei - etalon.
 Operaţia se efectuează pentru aceeaşi probă de analizat pe mai
multe coloane cu diferiţi adsorbanţi.

2. Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu

posibilitatea identificarii produsilor de degradare.

3. Studii farmacocinetice – studii de biodisponibilitate

(determinarea concentratiei plasmatice).

39
4. Determinarea cantitativă a compuşilor medicamentoşi

 Principala problemă a analizei cantitative în gaz-cromatografie este

măsurarea ariei picurilor.
 Aria picurilor este proporţională cu cantitatea de substanţă ce se
găseşte în zona eluată.
 Aria maximului picului poate fi calculată prin mai multe metode:
- măsurarea înălţimii maximului simetric, considerându-l de forma
unui triunghi, când aria este proporţională cu înălţimea: metodă
destul de precisă, dar exactitatea ei depinde de măsura în care forma
maximului rămâne neschimbată dacă cantitatea de substanţă
variază.

- planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile

cu ajutorul dispozitivelor de integrare şi a computerelor.

 Prin metodele enumerate se măsoară aria sau cantitatea de

substanţă proporţională cu aria de sub pic. Aceste cantităţi trebuie
transformate în valori sau procente ale componenţilor analizaţi.

- Gaz-cromatografele moderne efectuează automat determinările

cantitative prin ataşarea la aparat a unui calculator adecvat.
40
 CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)
Definitie:

 Este o tehnica cromatografica in care faza staţionară este constituita din

compuşi în a căror structură se află grupări acide sau bazice ionizabile
capabile să reţină cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.

 Aceşti compuşi poartă numele de răşini schimbătoare de ioni.

 Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de alţi ioni fie din faza mobilă, fie din
probă, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.

Clasificare:

 cromatografie de schimb cationic:

 schimbătorul reţine ionii încărcaţi pozitiv, înlocuind ionul H+ al acestuia
 Ex: (-SO3H, -PO3H2)

cromatografie de schimb anionic:

 schimbătorul reţine ionii încărcaţi negativ, inlocuind ionul X- al acestuia
 Ex: (-RN+H3X-)
41
1 2 3 4

42
APARATURA

43
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvoltă în zilele noastre cu

aplicaţii în:
• analiza medicamentelor

• chimia anorganică

• chimia organică

44
 CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE
SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)

 Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) derivă din metodele

convenţionale ale cromatografiei de lichide, în special din HPLC şi din
gaz-cromatografie (GC), fiind o metodă de separare puternică şi
universală, atât la scară analitică, cât şi la scară preparativă.
 Relaţia celor trei tipuri de cromatografie este redatã ma jos:

45
46
 Caracterisiticile fluidelor supercritice

Densitate (Kg/m3) Vâscozitate (cP) Difuziune

(mm2/s)
Gaz 1 0.01 1-10
Lichid 1000 0.5-1.0 0.001
Fluid 100-800 0.05-0.1 0.01-0.1
supercritic

Lichid Gaz Fluid

supercritic
Densitate mare X X
Difuzibilitate mare X X
Vâscozitate scăzută X X
Compresibilitate mare X X

47
APARATURA

48
 APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

1. Determinarea unor sulfonamide

Condiţii:
o Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC
o Coloana: 250 x 4,6 mm cu fazã staţionarã cianopropil (mãrimea particulelor 5
mm)
o Temperatura: 50o C
o Sistem injecţie: Model 7125, 10 ml
o Faza mobilã: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, creştere liniarã
la 15% timp de 10 minute)
o Viteza de curgere: 2 ml, 21 minute
o Presiunea: 180 bari
o Detecţie: UV 230 nm

TIC

49
2. Analiza unor substanţe anticancerigene şi anti-HIV

Taxol, R = CH3

3. Separări chiralice
Albendazol sulfoxid (ABZSO) - antihelmintic

- Chiralpak AD, eluţie cu 2-propanol

- Chiralcel OD, eluţie cu metanol

50
5. Alte aplicatii

o Separări de vitamine liposolubile

o Separări de acizi graşi
o Separarea benzodiazepinelor din ser
o Purificǎri de substanţe farmaceutice

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales

pentru separarea:
o substantelor termolabile
o compusilor nevolatili
o unor macromolecule

51
CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE

Definiţie: Cromatografia de excludere sterică este o metodă prin

care moleculele se separă pe baza mărimii lor sau în termeni
tehnici, pe baza volumului hidrodinamic. În mod curent, se aplică
moleculelor mari sau complecşilor macromoleculari, cum ar fi
proteinele şi polimerii industriali.

Clasificare:
 cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration
Chromatography, GFC) - faza mobilă este o soluţie apoasă.
 cromatografie de permeaţie prin gel (Gel Permeation
Chromatography, GPC) - faza mobilă este de natură organică.
 cromatografia de excludere de mărime

52
Calibrare/
Echilibrare Introducerea probei

Eluţia

53
APARATURA

54
APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE
1. SEPARAREA MOLECULELOR

 Separarea moleculelor cu mărime diferită

 gelurile care exclud substanţele cu mase moleculare mai mari de 5.000
u.a.m. realizează o veritabilă desalefiere, deoarece ionii minerali care
difuzează liber pot fi eliminaţi în acest mod
 separarea iodului nefixat în cursul purificării unui trasor, după marcarea
unei proteine cu 131I.

 Analiza unui amestec de macromolecule

 purificarea fracţiunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau
reactivi de diagnostic
 analiza stabilităţii materialelor plastice (ambalaje)

 Separarea celulelor
 limfocitele izolate de monocite

 Fracţionarea moleculelor mici

 analiza peptidelor
 analiza coloranţilor

55
2. DETERMINAREA MASEI MOLECULARE
 etalonarea directă a coloanei cromatografice cu etaloane de masă
molară cunoscută
 etalonarea indirectă, plecând de la determinarea volumului
hidrodinamic
 determinarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme
farmceutice, presupunând că 90 % sunt sub formă de monomeri
şi 10 % sub formă de dimeri.

3. DETERMINAREA DISTRIBUŢIEI MASELOR MOLECULARE

 se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul
masei moleculare.

4. DETERMINAREA PURITĂŢII UNOR SUBSTANŢE

FARMACEUTICE
Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca
impuritati) in insulina.

56
Diagrama spectrului electromagnetic al luminii 57
 SPECTROMETRIA UV - VIS
 Regiunea spectrală:
UV - îndepărtat: 100 - 200 nm
UV - apropiat: 200 - 400 nm
VIS: 400 - 800 nm.

Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza prezentei cromoforilor.

 Cromofori (grupe cromofore)

 sunt grupe de atomi, care prezente într-o substanţă pot da naştere
la spectre electronice (de absorbţie).
 Grupă auxocromă
 este o grupă de atomi saturată care, ataşată unui cromofor,
modifică lungimea de undă (max) la care are loc absorbţia şi
intensitatea maximă de absorbţie.

58
Tipuri de tranziţii:
- tranziţii  - * (alcani)
- tranziţii  - * (alchene, compuşi carbonilici, alchine, azo compuşi)
- tranziţii n - * (oxigen, azot, sulf, compuşi halogenaţi)
- tranziţii n - * (compuşi carbonilici)
- tranziţii d – d* (metale)

59
Spectrometru UV-VIS cu monofascicul

Spectrometru UV-VIS cu fascicul dublu

60
Substante determinabile spectrometric

61
 SPECTROSCOPIA ÎN INFRAROŞU
INFRARED SPECTROSCOPY (IR)

 Grupeaza metode de identificare si dozare nedestructive bazate

pe absorbtia sau reflexia de catre probe a radiatiilor
electromagnetice cuprinse intre 0,75 - 1000 µm:

 Regiunea fundamentala 2,5 - 25 µm = regiunea IR analitic

62
63
64
 APARATURA
 Elementele constitutive ale unui spectrofotometru în IR:
- sursa de radiaţii
- monocromatorul
- cuva pentru proba
- detectorul
- amplificatorul
- dispozitivul de înregistrare.

65
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI ÎN IR
 nu există compuşi care să prezinte spectre IR identice.

domeniul frecvenţelor < 1500 cm-1 (regiunea amprentelor digitale) sunt

mult utilizate pentru stabilirea identităţii substanţelor analizate.

1. IDENTIFICAREA SUBSTANŢELOR MEDICAMENTOASE

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul obţinut în aceleaşi

condiţii cu substanţe etalon

 se compară spectrul substanţei de analizat cu spectrul etalon (din

cataloage sau monografii) la care s-au precizat valorile benzilor de absorbţie
caracteristice şi care trebuie să fie prezente şi în spectrul substanţei de
analizat.

Spectrul etalon = se obţine utilizând drept substanţe aşa - numitele

substanţe de referinţă pentru IR (s.r.i.r.) înscrise în capitolul Standarde al
farmacopeelor.

66
 Exemple:

 acetazolamidă, acid iopanoic, acid nalidixic

 p-aminobenzoat de etil, ampicilina sodică, trihidrat de
ampicilină, benzilpenicilina potasică, palmitat de
cloramfenicol, clordiazepoxid, acetat de clortestosteronă,
cloxacilina sodică
 clorhidrat de cocaină, acetat de cortizon, acetat de
dezoxicortizon, dexametazona, dextran 40 şi 70,
diazepam, ergocalciferol
 lactobionat de eritromicină, furosemid,
hidroclorotiazidă, hidrocortizonă, hidroxiprogesteronă

67
2. DECELAREA IMPURITĂŢILOR SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 Impurităţile substanţelor medicamentoase provenite din procesul

de obţinere, cât şi cele rezultate prin degradarea substanţei păstrate
în condiţii necorespunzătoare produc modificări vizibile atunci când
se efectuează o analiză atentă a spectrului înregistrat.

 Se observă:
 modificări ale benzilor de absorbţie care trebuie să caracterizeze
substanţa pură
 apariţia altor benzi caracteristice unor legături sau funcţii noi.

68
3. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A SUBSTANŢELOR
MEDICAMENTOASE

 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase ca atare

 determinarea cantitativă a substanţelor medicamentoase din
produsele farmaceutice.

 Probleme:
 realizarea unor condiţii standardizate
 respectarea legii Lambert-Beer.

 Exemplu: Alilestrenolul
- se foloseste solvent CCl4.
- maximele de absorbţie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1.
- legea Lambert-Beer se verifică folosind soluţii de concentraţii = 0,5-2
g% (m/v).
- se poate determina în aceste condiţii şi din diverse produse
farmaceutice.

69
Componentele unui spectrometru FT-IR

70
 Avantajele FT-IR

 Viteză:
 deoarece toate frecvenţele sunt măsurate simultan, majoritatea
determinărilor FT-IR sunt de ordinul secundelor

 Sensibilitate:
 sensibilitatea metodei este mult îmbunătăţită deoarece detectorii utilizaţi
sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult scăzut, iar scanarea rapidă
permite coadiţia mai multor scanări, reducând zgomotul măsurat
întâmplător la nivelul dorit (semnal mediu)

 Simplitatea aparaturii:
 oglinda mobilă a interferometrului este singura parte a aparatului care se
mişcă continuu, astfel încât este foarte puţin posibilă o defectare mecanică

 Calibrarea internă:
 aceste aparate utilizează ca standard de calibrare internă a lungimii de
undă, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare şi nu necesită o
calibrare de către utilizator.
71
 APLICAŢIILE FT-IR

 metodă utilizată pentru identificarea oricărei probe.

 sensibilitatea va face posibilă identificarea unei cantităţi foarte
mici de impurităţi, ceea ce demonstrează că analiza FT-IR este o
metodă valoroasă în controlul de calitate sau în aplicaţiile asigurării
calităţii.
 sensibilitatea şi precizia detectorilor FT-IR, la care se adaugă
gama largă de software de algoritm au crescut utilizarea practică a
metodei în analiza cantitativă.

Evaluare şi identificare:
 de compuşi organici, anorganici
 în formularea medicamentelor
 în determinarea omogenităţii materialelor
 în medicina legală.

72
 SPECTROSCOPIA ÎN IR APROPIAT
NEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)

 este o tehnică rapidă şi nedistructivă, capabilă de a furniza date despre

constituenţii oricărei matriţe
 acoperă lungimi de undă cuprinse de la mijlocul infraroşului până la
domeniul vizibil.
 13000-4000 cm-1 sau 800-2500 nm

73
 APARATURA

Spectrofotometru NIR:
 sursă de lumină
 monocromator
 suport care să ţină proba sau o suprafaţa pe care se pune proba
 detector prin intermediul căruia se fac măsurători de reflexie sau
transmitanţă.

74
Moduri de masurare NIR

75
 AVANTAJE NIR

 nu este necesara prepararea probei → reducere timp de analiza

 metoda nedistructiva
 cantitati mici de reactivi
 metoda excelenta pentru analiza probelor solide

 metoda neinvaziva

76
 SPECTROSCOPIA DE MASA - MASS
SPECTROSCOPY (MS)
Definitie:

Spectroscopia de masă este o metodă instrumentală de analiză care se

bazează pe fragmentarea moleculelor substanţelor organice sub acţiunea unor
radiaţii cu energii mari de până la 100 eV, iar din analiza
- numărului
- sarcinii
- masei fragmentelor rezultate - se obţin informaţii asupra
• structurii
• identităţii substanţelor cercetate.
Datorită acumulării de energie are loc fragmentarea moleculelor cu
ruperea unor legături interatomice, proces prin care rezultă :
- mai ales ioni pozitivi (rar negativi)
- radicali
- ioni radicali
- molecule neutre.
Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a structurii
moleculare.

77
 Reprezentarea spectrelor de masă:
a) spectrul de bare al metanolului;
b) spectrul de masă continuu al unei substanţe organice
oarecare
78
 Sistem de presiune inalta

Sursa Analizor Sistem

Injector de masa Detector date
de ioni

Diagrama unui spectrometru de masă

79
 Surse de ionizare

1. Ionizarea prin impact electronic (Electron ionisation

- EI)
2. Ionizarea chimicã (Chemical ionisation – CI)
3. Bombardarea cu atomi rapizi (Fast Atom/Ion
Bombardment – FAB)
4. Ionizarea prin desorbţie laser asistată de o matrice
(Matrix assisted laser desorption ionization -
MALDI)
5. Ionizarea la Presiune Atmosferică (Atmospheric
Pressure Chemical Ionization - APCI)
6. Ionizarea prin electrospray (Electrospray Ionization
- ESI)
80
APLICAŢIILE SPECTROSCOPIEI DE MASĂ
Interpretarea spectrelor

+
+
+
+ +

81
 Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS

Există spectroteci care corespund unor colecţii (biblioteci) de spectre de

masă ale substanţelor cunoscute, în care sunt incluse (codate) principalele picuri ale
acestora.
Utilizarea acestor spectroteci, în care se caută picurile care interesează,
implică următoarele etape:

-reducerea datelor, prin care spectrul substanţei care ne interesează este redus la
cel mult 16 picuri, acordând preferinţă picurilor mai grele, mai semnificative decât
picurilor uşoare; fiecare spectru este redus în bibliotecă la 8 picuri

-precercetarea, care constă în selecţionarea spectrelor reduse din spectrotecă, la

acelea care au picuri cu aceleaşi poziţii ca şi picurile din spectrul redus al substanţei
cercetate, chiar dacă intensitatea lor este diferită

- cercetarea principală, care constă în reluarea selecţiei precedente printr-un

algoritm mai subtil care include printre criteriile de alegere:
• intensitatea
• masa
• raritatea picului, afectând un indice de identitate de la 0 la 1000 fiecărui spectru,
prin aceasta realizându-se o clasare prin similaritatea descrescătoare.
Există numeroşi algoritmi de cercetare, iar prin modificarea criteriilor de
alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea şi alegerea între diverse
clasamente.
Cea mai importantă spectrotecă de masă este aceea a NIST (National
Institut of Standards and Technology), care includea peste 250000 de spectre la
nivelul anului 1996, iar în prezent numărul spectrelor este desigur mai mare.
82
Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de masă pot fi utilizate cu şanse mari de certitudine

pentru stabilirea formulei moleculare a unei substanţe, deoarece poziţia
fiecărui pic care provine din fragmentarea unui ion precedent (exceptând
cazul unor reamenajări) oferă informaţii care se pot utiliza pentru stabilirea
ionului în cauză. Exemplu:
- prezenţa unui pic cu (M-1)+ - ionul s-a format prin pierderea unui atom de
hidrogen
- prezenţa unui pic cu masa (M-15)+ - ionul provine din ionul M+ prin
pierderea foarte probabilă a unei grupe de metil (CH3 cu masa M=15)
- daca ionul M+ conduce la un ion cu masa (M-18)+ - ionul a pierdut o
moleculă de apă.

Trebuie să se ţină seama că, de regulă, procesul de fragmentare sau

cel de reamenajare a ionilor care se formează din ionul molecular trebuie să
conducă la radicali sau ioni mai stabili decât ionul din care provin.

83
84