UNIVERSITATEA BABEBOLYAI CLUJNAPOCA FACULTATEA DE FIZIC

LUCRARE DE DIPLOM

ANALIZA DROGURILOR PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLAT CU SPECTROMETRIE DE MAS

NDRUMTOR,

ABSOLVENT,

Lector dr. Culea Monica

Mari Grigori-Ioan

CUPRINS : I. CAPITOLUL 1.2 1. Analiza calitativ i cantitativ..2 II. CAPITOLUL 2.6 Spectrometria de mas...6 a. Elementele spectrometrului de mas....7 b. Sistemele de introducere...8 c. Surse de ioni.....9 d. Analizorul de mas.....12
e. Procesul de fragmentare molecular. Procesul de ionizare...14 f. Spectrul de mas.....15 g. Detecia ionilor. Sensibilitatea spectrometrului.....15 h. nregistrarea i achiziia datelor MS...16

1.

III. CAPITOLUL 3...18 1. CROMATOGRAFIA DE GAZE...18 a. Detecia...21 b. Metode de prelucrare a informaiei cromatografice...25 c. Lrgimea benzii cromatografice.26 d. Numrul de talere...30 e. Rezoluia ....31 IV. CAPITOLUL 4...33 1. Droguri...33 2. ANALIZA DROGURILOR CU AJUTORUL CUPLAJULUI GC-MS...38
3. Determinarea unor compui toxici din substane de abuz46

CONCLUZII.52 Bibliografie.54

CAPITOLUL 1
ANALIZA CALITATIV I CANTITATIV
Determinarea calitativ i cantitativ a unor compui prezeni n diferite medii biologice cum ar fi n organismele vii sau n diferite produse rezultate n urma unor tehnologii mai mult sau mai puin complicate, este un subiect de cercetare modern. Pentru a obine determinarea pn la nivel de nanograme sau picograme a unor compui de interes, este nevoie s se fac de mai multe ori analiza acelor probe. Domeniului de interes pot s i aparin compuii poluani din mediul nconjurtor, medicamentele din diferite matrici, compui organici de relevan biomedical din organismele vii, etc. Indiferent de compusul de interes de identificat, este nevoie s se parcurg dou etape la fel de importante: a) scoaterea compusului de interes din matrice, cu randament ridicat; b) aducerea compusului de interes la nivelul de sensibilitate al metodei de analiz abordate (mbogirea compusului de interes) printr-o procedur de extracie adecvat i determinarea sa cantitativ printr-o metod de analiz de ncredere. Metodele de analiz trebuie s fie validate, adic s li se demonstreze corectitudinea. Validarea metodei de analiz parcurge testarea unor parametrii de validare utiliznd probe etalon cu concentraii cunoscute ale compuilor de interes. De asemenea, metodele de analiz trebuie s fie precise i exacte, s beneficieze de un detector cu liniaritate de rspuns n domeniul de interes, s aib selectivitate, sensibilitate, specificitate, reproductibilitate, s permit automatizarea datelor, s permit standardizarea acestor date, adic prelucrarea datelor experimentale s fie posibil on-line. n general, orice metod de analiz cuprinde urmtoarele etape: Extracia. Analiii pot fi izolai prin diferite proceduri: extracia lichid-lichid (LLE = liquid-liquid extraction), extracia pe faz mobil(SPE = solid phase extraction), ultrasonicare (USE = ultrasonication extraction), extracia cu microunde (MWE=microwave extraction),

extracia la temperatur supercritic (SFE). Extraciile cu o cantitate mare de impuriti se purific cu alumin, florisil, silicagel. Analiza calitativ detecteaz prezena n prob a compusului de interes (analitului). Acesta va fi obinut n funcie de sensibilitatea detectorului aparatului, randamentul de extracie, a aa numitei limite de detecie a metodei de analiz. Deci analiza calitativ infirm sau confirm prezena compusului de interes n proba analizat. Analiza cantitativ. n acest scop, sunt necesare etaloane i amestecuri de etaloane n cantiti bine determinate - kituri, materiale de referin certificate (MRC), pentru testarea metodelor. Dac analiza calitativ confirm sau infirm existena compusului de analizat n prob, analiza cantitativ ne d cantitatea de compus aflat n prob. Aceast analiz este foarte complex cnd este vorba de a determina cantiti de ordinul microgramelor, nanogramelor i picogramelor de analit. De aceea este necesar ca limita de determinare cantitativ s ating nivelul de cantitate dorit. Importana analizei cantitative const n faptul c datele pe care le d aceasta sunt uneori elemente de baz n deciziile economice, juridice, criminalistice, medicale ce vor fi luate. Importana acestei metode este prezentat n capitolul Analiza drogurilor cu ajutorul GC-MS. Dac se urmrete evoluia cantitativ a unui analit n timp spunem c realizm monitorizarea lui, adic analiza cantitativ fizico-chimic n timp. Detecia. Se utilizeaz foarte multe tipuri de detectori. De exemplu, pentru cromatografia de gaze, cele mai comune sunt detectoarele cu ionizare n flacr, (FID - flame ionization detection), sau cazul ideal este detectorul spectrometru de mas (MS - mass spectrometry) care d sigurana lipsei suprapunerilor de componeni n cazul analitului studiat. Detecia se realizeaz cu un detector care este nglobat ntr-un instrument sau echipament de obicei foarte complex. Validarea metodelor de analiz. A valida o metod de analiz nseamn a demonstra c metoda este corect. Strategia validrii cuprinde scopul, caracteristicile, performanele, limitele de acceptan. Peste 90% din valoarea erorii statistice ce nsoesc o determinare analitic sunt produse din cauza efecturii necorespunztoare a etapelor premergtoare analizei adic: prelevarea i pregtirea probelor, dizolvarea i pretratarea lor pentru a le aduce

ntr-o form msurabil, adic la nivel de concentraie msurabil. Se examineaz parametrii metodei de analiz: liniaritatea de rspuns domeniul de interes precizia i reproductibilitatea de la o zi la alta exactitatea limita de detecie (LOD) i limita de determinare cantitativ (LOQ) randamentul de extracie specificitatea selectivitatea i robusteea

Liniaritatea de rspuns a unei metode de analiz reprezint capacitatea metodei de a evidenia o relaie de direct proporionalitate ntre semnalele analitice i concentraiile analiilor din probe pentru un domeniu dat al acestor concentraii. Ecuaia dreptei de regresie liniar y = ax + b, aplicat rezultatelor trebuie s aib ordonata n origine (intercept), b, apropiat de zero. Se calculeaz panta dreptei de regresie (slope), a, i coeficient3ul de regresie r, care pentru o bun liniaritate trebuie s tind la 1. Domeniul de liniaritate (interes) al metodei este intervalul de concentraii ntre nivelul minim i maxim. Precizia i reproductibilitatea de la o zi la alta caracterizeaz concordanele dintre rezultatele msurtorilor individuale sau a seriilor multiple de msurtori. Precizia este deci o eroare statistic. Reproductibilitatea de la o zi la alta se refer la repetarea determinrilor n cadrul unui laborator, ntr-un interval de mai multe zile (n =10), cu o siguran acceptabil. Exactitatea sau acurateea este concordana rezultatelor obinute prin metoda de analiz considerat i valoarea acceptat ca fiind adevrat. Randamentul se poate calcula dac dizolvm MRC (materiale de referin certificate) n matrice i n solvent pur i comparm rezultatele, calculnd procentele de analit care se extrag din matrice prin metoda de extracie aleas. Limita de detecie (LOD) este reprezentat de cantitatea cea mai mic de analit ce se poate detecta prin metoda considerat. Cantitatea de analit la limita de detecie trebuie s fie mai mare dect eroarea asociat msurtorii (raportul semnal-zgomot s fie 2 sau 3).

Limita de cantitate (LOQ) este reprezentat de cantitatea cea mai mic de analit care d msurtori precise, cu un raport semnal/zgomot = 10. Specificitatea este caracteristica unei metode de analiz care d rspuns pentru un singur analit. Selectivitatea este caracteristica unei metode care permite msurarea cu exactitate a unui anumit analit n prezena unor compui de interferen. Sensibilitatea. Dac se consider funcia de rspuns a unui analit y=f(c), unde y este rspunsul analitic iar c este concentraia analitului, atunci panta curbei este chiar sensibilitatea. Robusteea se refer la efectul condiiilor de lucru asupra rezultatelor obinute. O metod este cu att mai robust cu ct acest efect este mai sczut.

CAPITOLUL 2
SPECTROMETRIA DE MAS
Spectrometria de mas este una dintre cele mai importante metode fizice de analiz. Ea se bazeaz pe ionizarea i fragmentarea moleculelor, ca urmare a unei acumulri de energie ce provoac ruperea legturilor interatomice. Fragmentele care se formeaz (ionii), sunt accelerate n interiorul unui cmp care le separ n funcie de raportul lor m/z (mas/sarcin electric). Ionii astfel separai ajung la un detector, unde sunt transformai n semnale electrice proporionale cu numrul de ioni de fiecare fel, permind nregistrarea spectrului de mas caracteristic fiecrei substane organice. Aplicaiile analitice ale spectrometriei de mas sunt foarte generale: analize structurale complexe, studiul cilor de fragmentare, analize calitative i cantitative de mare precizie la cantiti n urme, identificarea i analiza cantitativ a compuilor unui amestec. Tehnic de analiz ce aplic legile fizicii pentru caracterizarea materiei, spectrometria de mas s-a nscut la nceputul secolului nostru i a deservit n primele decenii fizica: determinri de mas exact a atomilor, poteniale de ionizare, msurtori izotopice. Termenul de spectrometrie de mas a aprut n anul 1920, cnd F. W. Aston a raportat prima dat masa atomic exact a neonului-20 i a neonului-22. Dezvoltarea spectroscopiei UV, IR, RMN, a defavorizat spectrometria de mas, care era mai complex, mai scump i mai dificil de mnuit. Acurateea i sensibilitatea ridicat a spectrometriei de mas au fcut ca aceasta s fie utilizat n analize cantitative de urme i n determinarea izotopilor stabili. Dup anul 1950 s-a nceput analiza unor compui cu greuti moleculare mai mari. Inventarea cromatografului de gaze pentru separarea amestecurilor i n special cuplajul cromatograf de gaze - spectrometru de mas, (GC/MS), tehnic modern de analiz calitativ i cantitativ, sensibil i selectiv, i-a gsit un numr foarte mare de aplicaii n ultimele decenii. Computerizarea a permis o important diminuare a costurilor analizelor i a aezat tehnica GC/MS printre tehnicile de vrf cu aplicaii n foarte multe domenii.

Un aspect foarte important al spectrometriei de mas este cantitatea mic de prob necesar pentru obinerea spectrului de mas i putem spune c aceast tehnic d cea mai mare cantitate de informaii specifice per microgram comparativ cu alte metode experimentale. Un alt aspect deosebit al spectrometriei de mas este relaia bine conturat structur spectru de mas, nct putem spune c spectrul de mas este o amprent a substanei. Metoda pune n eviden prile constituente ale moleculei. Este o metod unic pentru c poate preciza cum se leag gruprile funcionale ale moleculei.

Elementele spectrometrului de mas

Prob

Sistem de introducere

Sursa de ioni

Analizor

Detector

Calculator
Pompe de vid Pompe de vid Pompe de vid

Fig.1 Schema de principiu a unui spectrometru de mas

Spectru de mas

Prile componente ale unui spectrometru de mas sunt: sistemul de introducere al probei, unde proba este introdus n forma i cantitatea potrivit; sursa de ioni, unde se produce un fascicul de ioni din substana de analizat adus sub form de vapori; analizorul, care separ ionii n funcie de mas (m/z); detectorul, care nregistreaz abundena relativ sau intensitatea n funcie de mas. Trebuie remarcat faptul c att n sistemul de introducere, ct i n sursa de ioni, i n analizor trebuie creat vid pentru ca procesul de analiz al probei s nu fie influenat de

prezena moleculelor din aer, n situaia n care unii din compuii analizai se afl n concentraii extrem de mici (de ordinul nanogramelor).

Sistemele de introducere
Spectrometria de mas este o metod fizic de analiz strict legat de practic. Fenomenele fizice care stau la baza spectrometriei de mas sunt: - interaciunea particulelor ncrcate cu substana poliatomic; - deviaia n cmp a ionilor ncrcai. Sistemul de producere a ionilor moleculari i a ionilor fragment este urmtorul: n cazul spectrometrelor de mas cu bombardament electronic, compuii n stare de vapori care sunt admii n camera de ionizare a spectrometrului sunt bombardai cu electroni care, avnd energie suficient, ciocnesc substana, n urma acestei interaciuni substana se ionizeaz, se supraexcit i disociaz, formnd ioni moleculari i ioni fragment. Spectrul de mas este reprezentarea abundenei relative a ionilor n funcie de masa lor. Sistemul de introducere este partea instrumentului care conine rezervorul, cile de introducere a probei i pompele de vid necesare pentru ndeprtarea probei din rezervor dup analiz. Exist diferite sisteme de introducere: sisteme de introducere pentru gaze i sisteme de introducere pentru lichide care se folosesc pentru introducerea indirect a probei. Sistemul de introducere pentru lichide se folosete la introducerea probelor de referin, de aceea se mai numesc i sisteme de referin. Mai exist i sisteme de introducere pentru solide, sisteme folosite la introducerea direct a probei. Sistemele de introducere pentru gaze utilizeaz rezervoare de capacitate de civa litri, nclzite sau reci, iar proba trece n spectrometru printr-o duz, gazele putnd fi determinate cantitativ prin msurarea presiunii prin msurarea presiunii.

Fig.2 Sistem de introducere

unde (a) reprezint locul de introducerea probei, (b) robinetele, (c) rezervorul, (d) orificiu, (e) manometru.

Surse de ioni
Ionizarea prin impact electronic (EI) Cea mai veche metod de ionizare a moleculelor organice este cea prin bombardament electronic. Aceast metod are sensibilitate i stabilitate bun i continu s fie important n special n scopuri de identificare de componeni. Proba adus n stare gazoas difuzeaz n camera de ionizare n care exist un vid de 10-6 torr. Aici ea este supus aciunii unui fascicul subire de electroni generai de un catod nclzit sub vid i care este strbtut de un curent de 50-200A. Electronii emii de filament sunt accelerai la o diferen de potenial catod-anod avnd energia de 70 eV. Ei traverseaz camera de ionizare i intr n coliziune cu moleculele din fluxul gazos al probei de analizat. Impactul dintre un electron i o molecul determin ionizarea moleculei prin expulzarea unui electron: M + e- => M+ + 2e Pentru a mpiedica ciocnirile dintre ioni i molecule, camera de ionizare, analizorul i colectorul se menin la un vid de10-6 torri cu un sistem de pompe.

10

Fig 3 Schema de principiu a sursei de ioni cu impact electronic:

(1) filament (2) trap (3) surs de ioni inut la un potenial pozitiv ridicat pentru extracie de ioni pozitivi (sau tensiune negativ pentru extracie de ioni negativi) (4) "repeller" (5) regiunea de ionizare (6) plci de extracie (7) fant de focalizare (8) plci de deflexie (9) fanta sursei (10) fascicul de ioni.

Ionizarea chimic Energia mare la care sunt supuse moleculele n ionizarea EI produce adesea abunden de ioni de fragmentare i rearanjare. Ionizarea chimic s-a dezvoltat pentru a produce ioni cu transfer de energie redus, dnd ioni moleculari mai stabili. Se utilizeaz pentru determinarea masei moleculare, mai ales n cazul compuilor care nu prezint ion molecular n spectrul de mas EI. Principiul ionizrii chimice const n introducerea probei n amestec cu un gaz n camera de ionizare. Amestecul este bombardat cu un fascicul de electroni. Deoarece proporia probei de analizat este foarte mic fa de cea a gazului reactiv, practic numai moleculele acestuia din urm vor fi ionizate i fragmentate. Fragmentele gazului reactiv sunt deosebit de reactive i vor reaciona cu moleculele probei producnd ionizarea acestora. Ionizarea chimic este utilizat pentru obinerea de informaii asupra masei moleculare i n analiza cantitativ unde specificitatea ionului este dublat i de o mai mare sensibilitate i stabilitate. Ionizarea chimic negativ (NCI) Ionii negativi se aplic cu succes n studii de interes biochimic i toxicologic. Exist diferite metode de producere a ionilor negativi, cele mai importante modaliti sunt: -captur de electroni -reacii ioni-molecul.

11

Pentru detecia ionilor negativi este necesar s se inverseze curentul prin magnet. Ionizarea EI nu este favorabil producerii de ioni negativi care sunt cu mai multe ordine de mrime mai puini dect ionii pozitivi. n tabelul de mai jos sunt prezentate metodele de ionizare i sistemele de introducere corespunztoare acestora. Sistem de introducere Introducere direct Rezervor GC Cromatografie de lichide HPLC Tija cu emiter Tija DCI Tija int FAB Tij LD Folie aluminiu Metoda de ionizare EI, CI EI, CI si FI EI, CI i FI supercritic EI, CI EI, CI, TSP, FAB FD CI FAB LD PD Observaii Probe cu un singur compus, MS/MS amestec Gaze, lichide Amestecuri volatile, aplicaii biochimice Compui labili termic Amestecuri fr derivai, aplicaii biochimice Compui polari, labili Probe nevolatile Probe polare, labile Volatile Molecule mari

Tabel 1 Sisteme de introducere i metoda de ionizare utilizate n spectrometria de mas

unde: EI impact electronic; CI- ionizare chimic; FD- ionizare n cmp; TSP- termospray; FAB- ionizare cu atomi rapizi; DCI- iomizare chimic cu desorbie; LD- desorbie laser; PDdesorbie n plasm. Alte metode de ionizare cu aplicaii speciale sunt: - ionizarea cu bombardament de ioni (util n studiul suprafeelor); (SIMS -spectrometrie de mas cu ioni secundari); - ionizarea prin bombardament de atomi rapizi (FAB), utilizat n analiza biomoleculelor; - termoionizarea (evaporarea sub form de ioni de pe un filament metalic nclzit) permite msurarea rapoartelor izotopice la elementele solide (metale). - ionizarea ntr-o descrcare n plasm la presiune nalt cuplat inductiv (ICP) pentru analiza de solide; - ionizarea ntr-o descrcare electric n scnteie sau cu o descrcare luminiscent pentru analiza de solide; - fotoionizare (cu laser) pentru analize de amestecuri.

12

Analizorul de mas
Separarea maselor are la baz fenomenul deviaiei traiectoriei ionilor n cmpuri magnetice i electrice. Fenomenul trebuie s aib loc n absena ciocnirii ionilor cu ali atomi sau molecule i din acest motiv spectrometrele de mas funcioneaz n condiii de vid nalt (10-6-10-9 torr). Cele mai comune i cu aplicaii mai generale sunt analizoarele de mas magnetice i cuadrupolare. Analizorul de mas n cazul instrumentelor cu timp de zbor i transformat Fourier este utilizat n aplicaii speciale. Se utilizeaz diferite tipuri de analizoare de ioni, denumite dup principiul care st la baza separrii: analizor magnetic analizor electric analizor cu timp de zbor analizor cu radiofrecven (cuadrupolare) analizor cu focalizare cicloidal. n timp ce radicalii i moleculele neutre sau ncrcate negativ sunt eliminate de pompele de vid, ionii pozitivi sunt accelerai de o diferen de potenial V ctre analizor. Acest lucru se realizeaz prin punerea sursei de ioni la un potenial ridicat (3kV) i meninerea restului aparatului la potenial zero. Energia potenial a unui ion de sarcin e, eV, va fi egal cu energia cinetic a ionului dup accelerare. eV = mv 2 2

Deflexia n cmp magnetic a maselor ncrcate este dat de mrimea tensiunii de accelerare V i a cmpului magnetic B: Bev=mv2/r Pentru a focaliza un ion la detector trebuie satisfcute ecuaia general: m/r=B2r2/2V unde r este raza magnetului r2= 2mV B 2e

13

Separarea maselor are loc prin aciunea cmpului asupra unui fascicul de ioni obinut prin delimitare de ctre o fant la ieirea din sursa de ioni. Cmpul magnetic realizeaz imaginea acestei fante n vecintatea colectorului unde trece printr-o a doua fant. Din jocul celor dou fante se pot obine diferite forme de pic, pentru fante de limi comparabile se obine pic triunghiular, iar pentru cazul n care lrgimea unei fante este sensibil mai mare dect cealalt se obine pic trapezoidal. Exist i spectrometre de mas cu dubl focalizare. La acestea, ionii care ies din camera de ionizare, dup ce trec prin fanta de ieire a acestuia, vor trece printr-un analizor electrostatic, i apoi printr-unul magnetic i de abia apoi vor ajunge pe colector n care intr trecnd prin fanta colectorului. Schema de principiu a spectrometrului de mas cu dubl focalizare este prezentat mai jos.

Fig.4 Spectrometru de mas cu dubl focalizare

Separarea ionilor se poate realiza i fr utilizarea cmpului magnetic i anume prin supunerea ionilor la oscilaiile unui cmp electric cuadrupolar de nalt frecven. n acest caz ionii se deplaseaz ntre 4 bare metalice, paralele cu acest cmp. Pe cte dou bare opuse se aplic poteniale electrice de acelai semn dar decalate cu 180. Acest analizor se numete analizor cuadrupolar.

14

Fig.5 Focalizarea n cuadrupol

Peste aceast tensiune se aplic un cmp de nalt frecven. Cele 4 bare sunt de fapt electrozi, de unde i denumirea de cuadrupol a sistemului format de acetia. Datorit cmpului de nalt frecven, ionii vor oscila pe axa Oz. Numai ionii cu un raport m/z bine determinat vor putea ajunge la fanta de ieire, ceilali cznd pe electrozi. Avantajele folosirii focalizrii n cuadrupol sunt: cost mai sczut, greutate redus, lipsa de histerezis, posibilitate de control prin computer. Aceste instrumente sunt potrivite aplicaiilor n modul de lucru monitorizare de ion selectat (SIM).

Procesul de fragmentare molecular. Procesul de ionizare.

Sub aciunea fasciculului de electroni n camera de ionizare se va produce transformarea moleculelor din prob n diverse specii de ioni care vor apare n spectrul de mas, dup ce vor fi separai i colectai pe specii, sub forma unor linii aezate n funcie de raportul m/z. Aceste transformri depind de energia cu care sunt bombardate moleculele probei. Valoarea energiei de ionizare ale moleculelor este de 7-15 eV. Dac aceast energie nu este suficient de mare, spectrul de mas nu se mai obine, din cauz c electronii nu mai pot s produc modificri n structura moleculelor din prob. Cnd o molecul este

15

bombardat de electroni de energie moderat, dar mai mare dect energia de ionizare a moleculei, sunt posibile urmtoarele procese: 1) M + e- M+ + 2e2) M + e- Mn+ + (n+1)e3) M + e- MProcesul cel mai frecvent este 1), i de aceea el are cea mai mare importan n obinerea spectrului de mas. Dac se mrete energia electronilor, se ajunge la limita la care ncepe fragmentarea moleculelor. Tensiunea de accelerare la care ncepe fragmentarea ionilor se numete potenial de apariie a ionilor fragmentai.

Spectrul de mas
Spectrul de mas se reprezint n literatur sau n coleciile de spectre de mas de referin fie normat fa de picul de baz, fie grafic sub form de spectre de linii cu intensitate relativ n ordonat i numr de mas n abscis. Spectrele de mas sunt adevrate amprente ale moleculelor fiind folosite la identificarea acestora. Interpretarea spectrelor este foarte dificil din cauz c apar prea multe linii n spectru. Din aceast cauz utilizarea computerului este foarte important pentru c liniile se pot deosebi mai bine, i pentru c se poate folosi o banc de spectre de referin, cu care sunt comparate spectrele obinute n urma analizei.

Detecia ionilor. Sensibilitatea spectrometrului

Intensitatea curenilor de ioni se situeaz n intervalul 10-9-10-16 A i msurarea acestora necesit amplificatoare electromagnetice corespunztoare. Colectorul se poate realiza sub form de cuc Faraday, iar pentru analize izotopice precise se utilizeaz doi colectori pentru nregistrarea simultan a curenilor de ioni i msurarea direct a raportului. Ca detectori se pot utiliza : placa fotografic cuca Faraday

16

multiplicator de electroni electrometre Detectorul cel mai uzual la spectrometre de mas este multiplicatorul de electroni

secundar (secondary electron multipler SEM), care detecteaz cureni de 10 -10-10-18 A, i-i amplific cu un ctig de aproximativ 106. Eficiena utilizrii probei n operaiile GC-MS este de importan practic n obinerea sensibilitii maxime. Sensibilitatea spectrometrului de mas este funcie de numrul de ioni care lovesc detectorul fa de masa substanei introduse n sursa de ioni i factorul de amplificare al detectorului. Doar un ion ajunge la detector din 106 molecule introduse n sursa de ioni la rezoluie joas.

nregistrarea i achiziia datelor MS

Spectrul de mas reprezint nregistrarea abundenei ionilor unui compus n funcie de mas (m/z) i este specific substanei, caracteriznd-o. Spectrometrul de mas reprezint un detector ideal pentru compuii separai prin cromatografie de gaze. Spectrul de mas poate fi utilizat pentru identificarea unui compus necunoscut. Spectrul compusului necunoscut se compar cu spectrul de mas al unor compui cunoscui. Picurile spectrului de mas ale compusului necunoscut se pot utiliza pentru determinarea structural a acestuia. Prin corelarea structurii moleculare cu configuraia spectrului de mas, spectrometria de mas d informaii privind natura i numrul atomilor care compun molecula, existena unor grupri funcionale i modul n care sunt acestea aezate n structura moleculei. Spectrele EI conin alturi de ionul molecular [M]+, ioni fragment, care pot fi explicai logic prin pierderi de grupri funcionale din ionul molecular. Studiul cilor de fragmentare ale compusului utiliznd tehnicile de msurare ale maselor exacte n nalt rezoluie i msurarea ionilor metastabili, dau informaii i mai precise asupra structurii, mecanismelor de formare i fragmentare a ionilor, triei legturilor compusului de analizat. Una dintre cele mai importante informaii pe care le ofer spectrul de mas este masa molecular, dar nu toate moleculele au ion molecular. Majoritatea spectrelor de mas dau informaia legat de masa molecular prin prezena ionului fragment M-15 (m/z 15 reprezint CH3, prezent n majoritatea moleculelor organice).

17

Ordinea descreterii stabilitii ionului molecular n spectrele de mas este urmtoarea: compui aromatici - olefine conjugate - compui ciclici sulfuri - hidrocarburi neramificate mercaptani cetone amine esteri eteri acizi carboxilici hidrocarburi ramificate alcooli. Pentru achiziia datelor se folosete un computer care controleaz baleiajul i optimizeaz condiiile n sursa de ioni. n cazul n care nu exist un computer, se utilizeaz nregistratorul pe hrtie pentru nregistrarea spectrelor probelor introduse prin introducerea de gaze, lichide i solide i un oscilograf pentru nregistrarea spectrelor de mas n cuplajul GC/MS. Biblioteca de spectre este utilizat pentru identificarea componenilor prin comparaie cu spectrele de mas a unor componeni cunoscui. Identificarea unui component necunoscut poate fi asistat de msurtori de mas exact, msurtori metastabile, utilizarea unor derivatizri, ncorporare de izotopi stabili, metode de ionizare alternative, MS/MS, etc. Spectrometria de mas cunoate o continu dezvoltare cu un larg numr de aplicaii: determinri de mase exacte determinri de ci de fragmentare determinri structurale complexe msurtori izotopice determinri cantitative precise Aceste aplicaii sunt de un real folos mai ales fizicienilor i chimitilor care desfoar o activitate de cercetare .

18

CAPITOLUL 3
CROMATOGRAFIA DE GAZE
Cromatografia grupeaz o variat i important grup de metode care permit cercettorului s separe compui foarte asemntori din amestecuri complexe. n toate separrile cromatografice, proba este dizolvat ntr-o faz mobil: gaz, lichid sau fluid supercritic. Aceast faz este frecvent numit eluent, iar dup ce trece de captul coloanei se numete eluat. Metoda cromatografic a fost descoperit de botanistul rus Mihail Tsvet n 1906, i a fost folosit mai nti pentru separarea unor substane colorate pe coloan, sau ca eluate colorate. Dac substanele sunt incolore, prezena lor pe coloan sau n eluate se recunoate prin alte metode. Metodele cromatografice sunt bazate pe absorbia amestecului de substane (solidlichid, lichid-lichid, lichid-gaz), pe un material absorbant, urmat de dezabsorbia succesiv (cu ajutorul unui dizolvant adecvat-eluant) a componentelor din amestec. Coloana de absorbant poate fi nlocuit n unele variante i cu o foaie de hrtie poroas preparat n mod special (cromatografia pe hrtie), sau cu un strat subire de absorbant fixat pe o plac de sticl cu ajutorul unui liant (cromatografia pe strat subire). Spectrometria de mas, i n special spectrometria de mas cuplat cu cromatografia de gaze (GC/MS), este o tehnic modern de analiz cantitativ i calitativ, sensibil i selectiv, care i-a gsit un numr mare de aplicaii n ultimele decenii. Computerizarea a permis o important diminuare a costurilor analizelor i a aezat tehnica GC/MS printre tehnicile de vrf cu aplicaii n foarte multe domenii: fizic, chimie, biologie, medicin, farmacie, geologie, ecologie, toxicologie, criminalistic, arheologie, etc. Tehnicile de marcare a compuilor cu izotopi stabili au permis utilizarea trasorilor izotopici i analiza lor a cerut o tehnic capabil s msoare concentraii ct mai mici. Tehnica GC/MS permite analiza concentraiilor de ordinul pg/ml i chiar mai puin. Separarea compusului de analizat de potenialele interferene este unul din paii eseniali n analiza chimic. Cromatografia este una dintre cele mai utilizate metode de a

19

realiza aceste separri analitice. Aplicaiile cromatografiei cresc exponenial cu timpul, n mare parte datorit faptului c ea i gsete aplicaii n toate ramurile tiinei. O analiz cromatografic se rezum n general la urmtoarele concepte fundamentale: proba este dizolvat n starea mobil; faza staionar este cel mai adesea un lichid absorbit la suprafaa unor particule de solid utilizate pentru a mpacheta coloana; faza mobil este trecut peste faza staionar nemiscibil; aceasta se numete eluie; solutul care are o mare afinitate fa de faza mobil se va mica prin coloan foarte ncet; componenii probei se vor separa n benzi discrete vizibile la detector de la care rezult cromatograma. Cromatografia a devenit principalul instrument pentru separarea speciilor asemntoare. Ea poate fi utilizat de asemenea n determinri cantitative i calitative ale speciilor separate. n termeni de informaii chimice calitative, cromatograma furnizeaz timpul de reinere al speciilor sau poziiile acestora pe faza staionar dup un timp de eluie specific. Cromatografia poate fi extrem de util pentru recunoaterea prezenei sau absenei unor componeni ntr-un amestec ce conine un numr redus de specii cunoscute. Confirmarea identitii servete i pentru alte investigaii, i nu n ultimul rnd cromatografia servete ca precursor pentru alte analize calitative sau pentru analize spectroscopice. Informaia cantitativ este principalul motiv pentru care cromatografia are o att de larg folosin. Ea se bazeaz pe compararea mai multor nlimi sau suprafee ale picurilor analitice cu etaloane. Analiza bazat pe aria picurilor, care este independent de efectele de deformare, este mult mai precis i de aceea mult mai comun. Oricum toate datele cantitative sunt dependente de prepararea standardelor i calibrrile succesive ale coloanei, folosind acele standarde. Fr o calibrare exact i precis a datelor, nici o dat cromatografic nu poate fi considerat exact. Sunt 5 categorii de cromatografii: de absorbie; de partiie; cu schimb de ioni; prin excluziune molecular; de afinitate.

20

Metodele cromatografice pot fi de asemenea clasificate n dou moduri: cromatografia planar si cromatografia pe coloan. Ele sunt bazate pe interaciunea fizic, ceea ce nseamn c faza staionar i faza mobil sunt n contact. n cromatografia pe coloan, faza staionar este introdus n interiorul unui tub ngust i faza mobil este introdus n tub cu ajutorul presiunii sau a greutii proprii. n contrast, cromatografia plan folosete o faz staionar care este depus pe o suprafa plan sau n hrtie. Faza mobil se deplaseaz prin faza staionar datorit aciunii capilare sau a greutii. Cromatografia de lichide, gaze i de fluide supercritice sunt 3 clase generale bazate att pe tipurile de faze mobile i staionare ct i pe tipurile de echilibre implicate n transferul solutului ntre faze. Fazele mobile sunt gaze, lichide i fluide supercritice. Fazele staionare variaz, i tipul de echilibru este dependent de alegerea acestei faze. Cromatografia de absorbie utilizeaz o faz staionar solid i o faz mobil care este un lichid sau un gaz. Solutul poate fi absorbit la suprafaa particulelor solide, unde echilibrul dintre starea absorbit i soluie produce separarea moleculelor solutului. n cromatografia de partiie, faza staionar este un film subire pe suprafaa unui suport solid. Solutul stabilete un echilibru ntre lichidul staionar i faza mobil (lichid sau gazoas). n cromatografia cu schimb ionic, anionii sau cationii sunt legai covalent de o faz staionar solid, frecvent o rin sau o faz solid tare i amorf. Este utilizat o faz mobil lichid. Ionii solutului de sarcin opus sunt atrai de faza stationar datorit forelor electrostatice. Cromatografia de excluziune molecular este mai comun denumit de gel permeabil sau de filtrare cu gel. Aceast tehnic separ moleculele dup mrime, i moleculele mari trec cu o vitez mai mare dect moleculele mici. Nu exist interaciuni active. Faza mobil gazoas sau lichid este trecut printr-un gel poros, care exclude moleculele mari, dar nu i pe cele mici. Moleculele mari curg peste, fr a intra n gel, i ele elueaz primele. Cromatografia de afinitate este bazat pe interaciunea ntre un tip de molecule de solut i un al doilea tip, acestea legate covalent de faza staionar. Cnd amestecul este trecut prin coloan, doar un tip de molecule de solut reacioneaz cu moleculele legate i formeaz legturi la rin. Moleculele de solut dorite sunt dislocate apoi de moleculele legate variind pH-ul sau tria ionic a solventului. Mai sunt i alte categorii de cromatografie cum ar fi:

21

cromatografia de gaze cu detecia cu ionizarea n flacr (FID) i cromatografia de gaze cu detecie cu captur de electroni (ECD).

Cromatografia de gaze, lichide i pe strat subire

n cromatografia de gaze (GC) lichidul volatil este injectat folosind o sering adecvat. Un gaz inert purttor, poart proba prin coloana ce conine faza staionar. Gazul purttor deservete faza mobil. Dup traversarea coloanei, particulele separate de solut intr ntr-un detector. Rspunsul este afiat pe un calculator ca funcie de timp. n figura 8 este redat schema principalelor etape n cromatografia de gaze. Prepararea probei Injectarea n coloan Separarea componenilor Detectarea componenilor din prob Identificare i msurare
Fig.6 Etape n cromatografia de gaze

n figura 7 este ilustrat structura coloanei de separare, ntr-o perspectiv din seciune. Figura 8 prezint construcia unei coloane de separare.

22

Fig. 7 Structura coloanei de separare, ntr-o perspectiv din seciune

Fig.8 Coloana capilar de rezoluie ridicat (lungime mare)

Figura 9 ilustreaz asamblarea prilor componente ale unei instalaii de cromatografie de gaze. Prile componente ale unei instalaii de cromatografie de gaze sunt: butelia cu gaz purttor, gaz care este de obicei heliu, aflat ntr-un recipient sub presiune, regulatoarele de presiune i debit care au rolul de a regla presiunea i volumul gazului purttor, cromatograful de gaze propriuzis care are ca pri componente sistemul de injectare, coloana de separare, cuptorul cu posibilitate de nclzire programat. detectorul i staia de achiziie date care este de obicei un computer care controleaz procesul de analiz a fazei.

23

Fig. 9 Asamblarea prilor componente ale unei instalaii de cromatografie de gaze.

n cromatografia pe strat subire (TLC), un spot de prob este aplicat peste o bucat de hrtie sau sticl, avnd faza staionar impregnat. Captul suprafeei de hrtie sau sticl este apoi scufundat ntr-o cantitate de solvent, care servete ca faz mobil. Solventul migreaz de-a lungul fazei staionare, separnd componenii probei n lungul drumului su. Cnd solventul ajunge n vecintatea prii superioare, este nlturat cantitatea suplimentar de solvent i este lsat s se usuce. Civa dintre componenii probei sunt vizibili n acest moment. Alte msurtori sunt n mod curent efectuate pentru a detecta toi componenii probei. Cromatografia de lichide de nalta performan (HPLC), se refer la noile proceduri de cromatografie de lichide bazate pe o instrumentaie sofisticat. Acestea sunt cele mai mult folosite metode dintre toate metodele de separare. n cadrul acestei metode se disting: HPLC cu detecie de fluorescen, HPLC cu detecie electrochimic i HPLC cu detecie n ultraviolet. La fel ca i n cromatografia de gaze cuplat cu spectrometria de gaze, n cromatografia de lichide de nalt performan exist cinci etape care trebuie urmate pentru ca o analiz s fie efectuat.

24

Aceste etape sunt: Prepararea probei Injectarea n coloan Eluarea cu faza mobil Detectarea componenilor din prob Identificare i msurare
Fig. 10 Principalele etape n HPLC

Fig. 11 Schema bloc a unei instalaii HPLC

Detecia
Foarte multe detectoare sunt angajate n separrile cromatografice. Detecia absorbanei moleculare UV-VIS este cea mai comun. Detectorul ideal este necesar s aib: sensibilitate adecvat; bun stabilitate i reproductibilitate; rspuns liniar la diferitele ordine de concentraie; timp de rspuns scurt;

25

stabilitate pe un larg domeniu de temperatur; durat lung de via; uurin n utilizare. Monocromatorul este adesea o component a instrumentului UV-VIS. El permite

scanri spectrale, ceea ce nseamn capacitatea de a varia lungimea de und a radiaiei n mod continuu ntr-un domeniu larg. Fantele monocromatorului joac un rol important. Fanta de intrare servete ca surs de radiaie. Fantele largi sunt tipic utilizate pentru determinri cantitative n care detaliul spectral este important, n comparaie cu analiza calitativ.

Metode de prelucrare a informaiei cromatografice

Dintre toate metodele de prelucrare a informaiei cromatografice, metoda standardului intern furnizeaz cea mai mare precizie pentru cromatografia cantitativ, deoarece ea elimin incertitudinile introduse de simpla injecie. n aceast metod, o cantitate exact msurat de substan este adugat fiecrui standard sau probe. Standardul intern trebuie s fie ales astfel nct el s se separe foarte bine de celelalte picuri componente ale probei. De asemenea, picul de standard intern trebuie s fie aproape de picul analitic. Cantitatea de substan din picul de standard intern servete apoi ca parametru analitic. Metoda normalizrii ariilor este o alt aproximare utilizat pentru eliminarea incertitudinilor asociate cu simpla injecie. n aceast metod, aria tuturor picurilor complet eluate este calculat. Concentraia analitic este gsit ca raport al ariei de pic la aria total a tuturor picurilor.

Lrgimea benzii cromatografice

O cromatogram: ilustreaz rspunsul detectorului la un compus de analizat din prob la ieirea acestuia din coloana ca funcie de timp sau de volum de faz mobil adugat; este util att pentru determinrile cantitative ct i cele calitative;

26

furnizeaz o serie de picuri, unde aria sub picuri furnizeaz informaia cantitativ despre cantitatea de component, iar poziia picului servete pentru identificarea compusului din prob.

Cteva probe de band pe cromatogram este posibil s se desprind de concentraia compusului de analizat n fazele mobil i staionar i de comportamentul fiecrui compus n parte. (fig. 12)

Fig. 12 Tipuri de picuri

Un pic Gaussian este ideal (a). Mai mult, oricum picurile pot avea o cretere progresiv urmat de o cdere abrupt datorata suprancrcrii coloanei (b), sau o form cu coad care rezult din faptul c unele lcauri ale coloanei rein solutul mai mult dect altele (c). Lrgimea benzii poate fi explicat din punct de vedere cantitativ. O particul individual suport multe transformri n timpul migrrii, n consecin, timpul de staionare n coloan este extrem de diferit precum i migrarea particulelor de-a lungul coloanei este neregulat. Odat cu creterea timpului, limea benzii crete n timp ce se parcurge coloana, timpul de staionare n coloan va fi mai mare, iar viteza de curgere a fazei mobile scade.

Fig. 13 Elementele unei cromatograme.

27

Exist patru parametri care caracterizeaz n general viteza de migrare: timpul de reinere, coeficientul de partiie, factorul de capacitate i factorul de separare. Aceti parametrii descriu echilibrul de distribuie care exist i implicit transferul soluiei n cele dou faze (fig 12). Timpul tR la care apare maximul unui pic, msurat din momentul introducerii probei se numete timp de reinere i este o caracteristic calitativ a componentului respectiv. nlimea picului h sau aria lui, A, sunt caracteristici cantitative, proporionale cu cantitatea componentului din prob. Se noteaz cu tM timpul n care eluentul si componentele care nu interacioneaz cu faza staionar parcurg distana pn la detector. Astfel, putem explica viteza componentului din faza staionar (v) i a eluentului (u) prin urmtoarele ecuaii: v= i L u = tM Coeficientul de partiie (2) L tR (1)

K reprezint raportul dintre concentraia molar (cS) a

substanei n faza staionar i concentraia n faza mobil (cM): cS K = cM (3)

Fraciunea din timpul de reinere n care o molecul se gsete n faza mobil se noteaz cu R i reprezint probabilitatea ca molecula s se gseasc n faza mobil, respectiv fraciunea din totalul moleculelor care se afl n faza mobil. 1-R reprezint restul moleculelor care se gsesc n faza staionar. La echilibru putem scrie: c V R = M M 1 R c S VS unde VM si VS reprezint volumul fazei mobile, respectiv staionare. Factorul de capacitate Din relaia (3) si (4) se obine: (4)

28

R= unde k= KVS VM

VM 1 = VM + KVS 1 + k

(5)

reprezint raportul dintre cantitatea total de substan aflat n faza staionar i cantitatea total de substan aflat n faza mobil i se numete factor de capacitate. Din (5) este clar c componentele amestecului de separat vor iei din coloan cu viteze diferite: R= Din (5) si (6) rezult: u v = 1 + K VS VM K AVS t R t M = VM tM (7) v tM = u tR (6)

Pentru o specie A aflat n amestec, factorul de capacitate kA va fi: kA = (8)

Factorul de capacitate k este o funcie de parametrii de solubilitate, n cazul cromatografiei de separaie lichid-lichid. Experimental, n vederea obinerii unei rezoluii maxime pe unitatea de timp, valoarea lui k trebuie s fie cuprins ntre 2 i 5. d)Factorul de separare pentru o anumit coloan de separare este un parametru utilizat pentru descrierea diferenelor ce apar ntre vitezele de migrare a componenilor. Se definete ca fiind raportul dintre factorii de capacitate kA si kB ai componentului B (care trece mai greu prin coloan) si A (componentul care se elueaz mai repede) aflai n amestec. tR( B ) tM tR( A) tM

kB K = B kA K A

(9)

Numrul de talere i nlimea talerului

Una dintre cele mai importante caracteristici ale unui sistem cromatografic este eficiena sau numrul de talere teoretice. Cu ct o coloan va avea mai multe talere pe

29

unitatea de lungime cu att eficacitatea ei de separare va fi mai bun. Numrul de talere poate fi definit din cromatograma unui singur pic (fig. 12) astfel: tR N= t
2 tR tR =16 =5.54 W W 1/ 2 2 2

(10)

unde tR este timpul de reinere, 2t este dispersia aceleiai benzi n uniti de timp iar W este valoarea segmentului pe abscis rezultat din intersecia celor doua tangente prin punctele de inflexiune ale picului. N este un numr adimensional. Aceeai valoare a lui N poate fi obinut din volumul de reinere VR si dispersia 2V exprimata n uniti de volum: VR N = V L =
2 2

(11)

Numrul de talere N este o msur a eficientei ntregului suport la coloanei. O alt msur a eficienei coloanei este dat de nlimea unui taler H (nlimea echivalent a unui taler teoretic): H= L 2 = N L (12)

unde L este lungimea coloanei cu umplutur. Relaia ntre cele dou mrimi este: LW 2 H= 2 16t R (13)

Este bine cunoscut faptul c zona ngust i compact a componentului de la nceputul coloanei (la introducerea probei) se va lrgi astfel nct concentraia pe unitatea de volum de coloan se va micora. Aceast lrgire a zonei este rezultatul urmtoarelor procese: difuziunea longitudinal a componentului n eluent; timpul finit de stabilire a echilibrului moleculelor componentului ntre cele dou faze i fluctuaiile vitezei eluentului n diferite puncte ale coloanei, fluctuaii determinate de structura geometriei interne a coloanei. Lrgirea zonei acioneaz n sensul micorrii separrii ducnd la o reamestecare a componentelor, respectiv la o suprapunere a picurilor cromatografice.

30

Rezoluia
Rezoluia este o caracteristic foarte important a unui aparat, i reprezint puterea sau abilitatea de a separa diferii componeni. Pentru caracterizarea separabilitii a celor doi componeni, s-a introdus noiunea de rezoluie, notat cu RS. n expresia rezoluiei s-a cutat s se lege mrimile care caracterizeaz proprietile termodinamice ale fazelor i componenilor, precum i mrimile care caracterizeaz dinamica proceselor din coloan. Rezoluia este o noiune mai cuprinztoare, coninnd i mrimile care caracterizeaz eficacitatea precum i selectivitatea coloanei. RS= 2t R ( B ) 2t R ( A ) WA + WB = 2 t R WA + WB (14)

Dac cele doua picuri sunt apropiate avnd suprafeele egale i simetrice, atunci i W1=W2=W. Ecuaia de mai sus se poate scrie astfel: RS= t R W (15)

Este evident c dac diferena dintre coeficienii de repartiie a componenilor crete, atunci selectivitatea coloanei s-a mbuntit. Aceasta se realizeaz prin alegerea corespunztoare a fazelor staionar i mobil. Un alt mod de mrire a rezoluiei este acela de a aciona n sensul reducerii lrgimii zonei, adic de a realiza coloane mai eficace, cu un numr de talere mai mare pe unitatea de lungime. Evident, rezoluia este influenat att de proprietile termodinamice ale sistemului, prin intermediul coeficienilor de capacitate, respectiv de repartiie, precum i de eficacitatea de separare a coloanei, prin intermediul termenilor N i H. Cu ajutorul ecuaiilor 10, 11 i 15 rezult: RS N L H (16)

Cele mai utilizate noiuni n cromatografia de gaze i relaiile dintre ele sunt prezentate n tabelul urmtor.

31

Numele Viteza n faza staionar (elut) Viteza eluentului (fazei mobile) Factor de Capacitate Coeficientul de Partiie Factorul de Separare Rezoluie Numr de talere

Simbol V U K K

Ecuaia, uniti de msur v= L/tR (cm/s) u=L/tM (cm/s) k=(tR-tM)/tM K=cS/cM

Ecuaia de legtur cu diferite mrimi

k=KVS/VM=(tR-tM)/tM K=kVM/VS

=
RS N R=

t R( B ) t M t R( A) t M W A + WB
2

kB K B = kA K A

2t R ( B ) 2t R ( A )

RS=

kB k A N * 1 + kB 4

nlimea talerului H Teoretic

t N=16 R W L H= N

Tabel 2. Cele mai importante noiuni i relaii utilizate n cromatografie

32

CAPITOLUL 4
Drogurile
Drogurile sunt substane halucinogene care conin alcaloizi, produc obinuin i distrug sistemul nervos. Opiul este cel mai cunoscut drog, obinut din latexul capsulelor de mac (papaver somniferum). Foarte utilizat de mult timp n medicin, opiul a fost folosit i pentru plcere. Abuzul de opiu i de derivai ai acestuia a stat la originea primelor eforturi internaionale de control a stupefiantelor. Opiul este rezina obinut din latexul capsulelor de mac i conine o gam de alcaloizi, printre care i morfina, n proporie de 10-17%. Doza toxic este de 1,5-3mg, copiii prezentnd sensibilitate mrit. Compusul cel mai activ al opiului este morfina, obinut fie din opiu, fie din paiele de mac; i aceast substan este folosit n medicin pentru calmarea temporar a durerilor de dup operaiile chirurgicale, a celor produse de fracturi sau arsuri i n ultimele faze ale bolilor incurabile.
OH
A b u n d a n c e 2 8 5 # 1 6 6 0 5 5 : M o r p h in e $ $ M o r p h in a n - 3 , 6 - d io l, 7 , 8 - d id e h y d r o - 4 , 5 - e ( * )

O OH N
9 0 0 0 8 0 0 0 7 0 0 0 6 0 0 0

Fig. 14

Morfina M=285

5 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 3 1 1 0 0 0 0 m / z --> 9 4 1 1 5 1 4 5 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 1 8 4 2 5 9 7 0 1 2 4 1 7 4 1 9 7 2 0 0 2 2 0 1 6 2 2 1 5 2 6 8 2 1 6 2 4 2 2 4 0 2 5 6 2 6 0 2 8 0

33

S c a n 9 8 ( 5 . 8 1 0 m in ) : A L K D E M O . D A b u n d a n c e

O O OH N

9 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 4 2 5 9 7 0 8 1 9 4 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 4 1 1 5 1 4 6 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 7 5 1 8 0 2 0 0 2 2 0 1 6 2 2 2 9 1 8 8 2 1 4 2 4 2 2 8 2 2 5 62 7 0 2 6 0 2 8 0

2 9 9

Fig. 15

1 0 0 0 0 0 0 m / z -->

Codeina(metil morfina) M=299

2 4 0

3 0 0

# 2 2 1 2 9 6 : H e r o in $ $ M o r p h in a n - 3 , 6 - d io l, 7 , 8 - d id e h y d r o - 4 , 5 - e p o (* ) A b un da n c e 327

95 00 90 00

O O O O N

85 00 80 00 75 00 70 00 65 00 60 00 369

55 00 50 00 45 00 40 00 35 00 43 30 00 215 2 04 31 0 268

Fig 16

25 00 20 00 15 00 10 00 500 m / z --> 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 28 0 300 320 340 70 81 146 162 94 12 4 174 22 6 253 28 5 355 360

Heroina M=369

S c a n 3 3 ( 5 . 2 8 9 m in ) : A L K D E M O . D A b u n d a n c e 1 8 2 1 4 0 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 8 2

O H H O O O

1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0

9 4 3 0 3

Fig. 17

3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 m / z -->

Cocaina M=303

4 2 1 2 2 6 8 6 0 8 0 1 0 0 1 2 4 1 2 0 1 5 21 6 6

1 9 8 2 7 2 5 1

2 0 7 2 2 2 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0

2 4 4 2 5 9 2 4 0 2 6 0

2 8 8 2 8 0 3 0 0

4 0

34

A b u n d a n c e

# 1 6 7 1 6 5 : 3 - P R O P Y L - . D E L T A . 9 - T E T R A H Y D R O C A N N A B I N O L $ $ 6 H - D ib e n z ( * ) 4 1

9 0 0 0 8 0 0 0 7 0 0 0

OH

6 0 0 0 5 0 0 0 4 0 0 0 3 0 0 0 6 7 2 0 0 0 1 0 0 0 0 m / z --> 8 1 9 1 1 1 5 1 2 8 1 4 1 1 6 5 1 6 1 1 8 9 4 3

2 0 3

2 7 1 2 4 3 2 8 6

Fig. 18

Marijuana (Tetrahidrocanabinol) M=286

2 1 5 2 2 9 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0

2 6 7 2 6 0 2 8 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

n figurile de mai sus sunt reprezentate cele mai periculoase droguri (formula chimic i m/z a acestora n funcie de abunden). 1.1 Morfina este principalul alcaloid din opiu. Ea induce morfinomania, una din cele mai periculoase toxicomanii, dup 5-15 doze. Tratamentul se face prin suprimarea morfinei i administrare de insulin n doze optimizate individual. Doza letal este de 100 mg parenteral. n afar de efectele sociale dezastruoase, morfinomanii se expun la dou mari pericole: administrarea din greeal a unei supradoze i riscul mbolnvirii cu SIDA, datorit lipsei de igien n folosirea acelor i siringilor cu care i administreaz drogul. 2.1 Codeina. Este obinut mai ales din morfin i este utilizat de asemenea n medicin, pentru calmarea durerilor . 3.1 Heroina. Heroina, diacetilmorfina, este obinut din morfin prin acetilare i dintre toate drogurile cunoscute este cea care produce cel mai uor dependena, toxicomania. Toate opiaceele naturale sau sintetice, au n general un efect sedativ sau analgezic; prima reacie este dezagreabil, dar este urmat de o impresie de calm care, n funcie de doz, se poate transforma n com i duce la moartea prin asfixie. Intoxicaia poate fi recunoscut prin: pupile contractate, calm, neatenie, somnolen, ncetinire a pulsului i a respiraiei. Este cel mai puternic dintre derivaii morfinei. Doza letal la adult este de 100mg. Efectul euforizant este mai puternic, pericolul supradozrii fiind i mai mare ca la morfin. n

35

Suedia, prima cauz de deces a tinerilor ntre 18 i 35 ani este supradoza cu heroin. Sindromul de abstinen este deosebit de grav. 4.1 Cannabis. Produsele plantei Cannabis Sativa L pot fi fumate sau dizolvate n buturi; constituenii intoxicani se gsesc n flori. Cannabisul, marijuana, haiul, desemneaz diferite forme de canabis preparat. n doze infime, canabisul poate duce la o anume acutizare a percepiei i a senzaiilor de plcere. Dozele sporite duc la incoeren n comportare, pierderea memoriei, alterarea noiunilor de timp i spaiu, ilaritate, etc. Drogurile obinute din cnep (canabis sativa indica) sunt haiul (din vrfurile de floare ale cnepii) se fumeaz n pipe; marihuana (obinut din flori i frunze) se fumeaz n igri. Substana activ este tetrahidrocanabinolul, care afecteaz sistemul nervos central. Doza halucinogen este de 3060mg. In prima faz apare o senzaie de mulumire, bucurie, rs nestpnit, gndire dezordonat, reflexe ntrziate, halucinaii, iluzia de persoan dubl, delir, com. 5.1 Cocaina. Coca (Erythroxilon Coca) este un arbust care crete n America de Sud, frunzele sale fiind mestecate de secole de ctre locuitorii platourilor nalte, pentru anestezie local. Cocaina este principalul alcaloid extras din aceste frunze. Este o pudr alb i inodor, sub form de cristale, i poate fi consumat pe cale oral sau intravenos. Luat pe cale oral, cocaina neal foamea, alung oboseala i este uor euforizant. Prin injectare, aceasta are un efect net asupra psihicului, provoac halucinaii i manifestri paranoice. Sub aciunea repetat a dozelor de cocain, individul devine anormal de agitat, are ticuri i micri convulsive, pupilele i se dilat. Euforiei i impresiei de for muscular i urmeaz o perioad de depresiune. Induce dependen psihic. In timp apar tulburri digestive, respiratorii, cardiovasculare, halucinaii, delir, crize de furie, i diminuarea facultilor intelectuale, sfrind cu o decdere total fizic i intelectual. n doze ridicate, apare starea de nencredere, halucinaiile, uneori comportamentul agresiv i antisocial, iar o doz prea mare poate duce la convulsii i chiar la moarte. 2. Halucinogenele. Termenul se aplic unor substane foarte diferite, aparinnd unor grupuri chimice i farmacologice diverse.

36

2.1 LSD. Cea mai cunoscut substan halucinogen este LSD, abreviere a sintagmei germane Lyserg Saure Diethylamid acid lisergic dietilamid. Este un compus semisintetic obinut din alcaloizii coninui de cornul de secar.. Pentru prepararea unei doze sunt suficiente 100 250 micrograme, sub form de soluie diluat. Doza halucinogen este de 50g. Altereaz profund psihicul, produce decdere 2.2 Mescalina. Este un alcaloid coninut de un mic cactus, Lophophora Williamsii, cunoscut popular sub numele de peyotl i care crete n zonele secetoase din Mexic i Sud-Vestul SUA. 2.3 Alte halucinogene. Psilocybina i psilocina sunt extrase din ciuperca halucinogen Psilocybe mexicana. DMT i DET sunt abrevierile de la dimetiltriptamin i dietiltriptamin, cu efecte halucinogene puternice. STP, sau dimetoximetamfetamina, este un produs sintetic apropiat de amfetamine, cu efecte mai durabile dect LSD. Toate acestea produc halucinaii, euforie sau depresiune, putnd sta la originea unor grave tulburri psihice, precum impulsurile ucigae sau sinucigae. Au de asemenea posibilitatea de a produce o schimbare radical a personalitii, cu o conduit iraional. Doze infime de LSD sunt suficiente pentru a produce halucinaii care dureaz zile ntregi sau tulburri psihotropice prelungite pe mai multe luni. S-a demonstrat de asemenea c apar tulburri ale sistemului cromozomial, ceea ce afecteaz deseori generaia urmtoare a toxicomanului. 3. Substanele stimulante. Cele mai importante dintre aceste substane sunt amfetaminele, termen ce nglobeaz aminele sintetice, analoge sub multe aspecte adrenalinei secretate de corpul uman. Amfetaminele au fost larg folosite da ctre studenii care se pregteau pentru examene dificile sau de atleii care voiau s-i depeasc performanele i sunt adeseori folosite n combinaie cu alte droguri.

37

ANALIZA DROGURILOR CU AJUTORUL CUPLAJULUI CROMATOGRAFIE DE GAZE-SPECTROMETRIE DE MAS (GC/MS)

Introducere
Majoritatea articolelor tiinifice din literatura de specialitate din ultimii ani care au ca scop analiza drogurilor utilizeaz pentru analiza cantitativ cuplajul GC/MS i mai nou GC/MS/MS , alturi de tehnici imunologice, mai scumpe i mai laborioase. Subiectul este tratat n special de toxicologie i criminalistic, dar i n studii de metabolism. Extracia din mediu biologic presupune o preconcentrare a compuilor din mediul biologic ales, snge, urin, transpiraie, pr. Se utilizeaz tot mai mult tehnici moderne de preconcentrare, cum sunt extracia pe faz solid (SPE) utiliznd cartuuri i microextracie pe faz solid (SPME), microseringi cu silicagel C-18 sau se utilizeaz extracia cu fluid supercritic (SFE). n cele ce urmeaz fac o trecere n revist a unor articole recente care au ca scop analiza cantitativ a unor droguri de abuz i care utilizeaz n special analiza cantitativ prin GC/MS sau GC/MS/MS. Gaillard si Pepin dezvolt o metod nou de extracie rapid pe faza solid (SPE) cu o singur eluie, din fire de pr. Extracia s-a facut dup o decontaminare a probelor cu soluii de fosfat i diclormetan, mrunire a firelor de pr ntr-o moar cu bile, adugare de standard intern deuterat, hidroliz acid la cald i SPE. Metoda a fost validat (D.S.R < 9% pentru concentraia de 4ng/mg). Acurateea s-a studiat fa de un material de referin de la NIST. Limita de detecie a fost 0,1 - 0,3 ng/mg. Metoda s-a aplicat n criminalistic pentru cazuri de intoxicare cu cocain i opiacee. S-au determinat concentraii de 0.9 -242.0 ng/mg (cocaine), 0.3 -71.3 ng/mg (benzoylecgonine), 0.0 -9.8 ng/mg (methylecgonine ester), 0.0 -2.9 ng/mg (cocaethylene), 0.1 -11.5 ng/mg (codeine), 0.4 -44.6 ng/mg (morfin) i 0.7 -131.2 ng/mg (6acetylmorphine). Korte i autorii compar metode rapide test cu rezultate obinute cu EMIT i prin GC/MS. Autorii constat deficiene ale metodelor rapide prin reacii suprapuse pentru mai

38

muli compui sau metabolii (RapiTest MOP reacioneaz i la codeine i etilmorfin, i RapiTest MET i la amfetamin). Underwood determin urmtoarele limite de detecie n laboratorul de criminalistic prin cromatografie de gaze: LOD: 11-nor-delta 9-tetrahidrocanabinol-9-carboxilic acid, 2 ng/mL; benzoilecgonin, 5 ng/mL; fenciclidin, 2.5 ng/mL; amfetamin, 150 ng/mL; metamfetamin, 100 ng/mL; codein, 500 ng/mL; i morfin, 1000 ng/mL. Gracioso studiaz efectul toxic al unor infuzii de plante utilizate n medicina popular pentru tratarea unor boli. Autorii constat lipsa toxicitii orale a extractului i explic efectul antiinflamator prin interferena cu procesul inflamator. Chasin i Midio valideaz o metod de analiz cantitativ a cocainei i metaboliilor si: benzoilecgonin (BE), ecgonin-metilester (EME) i 'biomarkeri' interaciunii, etilencocaina (CE) n snge, n cazuri post mortem, utiliznd un spectrometru de mas cu trap ionic. Autorii subliniaz c n cazul coingerrii cocainei i a etanolului crete pericolul de moarte, prin formarea cocaetilenei, compus chiar mai toxic dect cocaina. Ei studiaz rolul etanolului n cazuri de intoxicare letal cu cocain. S-au utilizat standarde interne deuterate, extracia s-a facut pe coloane Bond Elut Certify i residuul s-a evaporat i derivatizat cu N-metil-N-t-butildimetilsililtrifluoroacetamid (MTBSTFA). Ionizarea s-a fcut cu impact electronic. Ionii monitorizai au fost m/z 82/85 pentru EME-tertbutildimetilsilil (TBDMS)/EME-d3-TBDMS; m/z 182/185 pentru COC/COC-d3; m/z 196/199 pentru CE/CE-d3 si m/z 282/285 pentru BE-TBDMS/BE-d3-TBDMS. Limitele de detecie si cuantificare determinate au fost 25 ng pentru COC si 50 ng /ml pentru CE, si 50 si 100 ng /ml pentru BE si EME. Toennes i autorii au elaborat o metod de testare a persoanelor care ingereaz cocain prin fumat prin analiza cantitativ din snge. Produsul de piroliz al metilecgonidinei (AEME), produs care apare la fumatul cocainei, este un marcher al acestui tip de drogare. Analitul s-a derivatizat prin tert.-butildimetilsililare. Au fost analizate 13 persoane i s-au determinat valori de AEME ntre 3 si 34 ng/ml. Huestis i autorii au elaborat un nou dispozitiv pentru colectat transpiraie, timp de 30 minute, din palm, abdomen, torace. Acest dispozitiv colecteaz transpiraia pentru a determina nivelul concentraiei de codein si cocain din corpul uman. Extracia probei se face cu soluie de acetat de sodiu, urmat de extracie pe faz solid i derivatizare. Analiza

39

cantitativ s-a fcut prin GC/MS i s-au determinat 33-3579 ng/plasture i 11 -1123 ng/ plasture, de cocain i respectiv codein. Aceast metod este o modalitate neinvaziv pentru a determina drogul la 4,5-48 ore de la ingerare. Hall i autorii au elaborat o metod de analiz a benzoilecgoninei n urin prin derivatizare i solid phase microextraction (SPME). S-a extras 1 mL urin prin sonicare timp de 3 min cu 12 L cloroformiat de hexil i 70 L de amestec acetonitril: apa: hexanol: 2-dimetilaminopiridina (5:2:2:1 v/v), coninnd benzoilecgonina hexil ester (BHE) ca produs. Dup 3 minute, un aliquotde 250 L a fost transferat ntr-o fiol pentru SPME. 100 microni polidimetilsiloxan fibla SPME este transferat n GC-MS pentru separare i analiz cu un spectrometru de mas cuadrupolar. Metoda a fost liniar n domeniul de 0.10 -20.0 g/mL (r2 = 0.999) de benzoilecgonina n urin utiliznd benzoilecgonina-d3 ca i standard intern (1.5 g/mL). Precizia a dat RSD 8.8 si 6.8% pentru 0.30 g/mL i respectiv 17 g/mL etaloane de benzilecgonin n urin (n = 6). Precizia de la o zi la alta a dat RSD (n = 3) < sau = 3.3%. Limita de detecie a fost 0.03 g/mL (S/N = 3) , fcnd astfel posibil ca SPME s fie o alternativ a SPE pentru probe confirmate prin test EMIT (limita de detecie 0,3g/ml) benzoilecgonina. Ohshima i Takayasu au pus la punct o metod de analiz cantitativ a cocainei i a unor anestezice prin extracie pe faz solid i GC/MS din snge si urin. Limita de detecie a fost de 100ng/ml. Segura i autorii au analizat droguri din fire de pr splate cu diclormetan, 10 mg tiate, incubate cu metanol -acid trifluoroacetic (9:1) la 37oC, peste noapte. Apoi s-au derivatizat i analizat prin dou metode, analiz prin imunoabsorbie de enzime legate (enzyme-linked immunosorbent assay ) EMIT i monitorizare de ion selectat SIM /GC/MS. Pichini i autorii analizeaz droguri tot din fire de pr, tiate fin i incubate n metanol la 56oC, timp de 18ore. Cocaina, morfina si etilencocaina au fost derivatizate prin trimetilsililare. Metoda de analiz prin GC/MS/MS s-a dovedit foarte sensibil pentru astfel de compui. elSohly a sintetizat m-Hydroxibenzoilecgonina (m-OH-BE) si d3-mhydroxibenzoilecgonina (d3-m-OH-BE)i a dezvoltat o metod de analiz prin GC/MS cu d3-m-OH-BE ca i standard intern pentru a determina aceti marcheri n urina persoanelor dependente.

40

Segura face o monografie a metodelor GC/MS pentru analiza unor medicamente, droguri de abuz i substane de dopaj. Scderea preului analizoarelor n spectrometria de mas a condus la un numr foarte mare de aplicaii al acestor metode mai ales n toxicologie. Probele sunt derivatizate de mai multe ori nainte de analiz. Eser i autorii compar metode de extracie n ap sau solveni organici a compuilor din fire de pr tiate mrunt sau sub form de pudr. Concluzia studiului este ca probele nu sunt omogene i creterea prului este un factor care influeneaz printre muli alii. Solventul indicat pentru droguri este metanolul i rezultatele sunt mai precise dac extracia se face din fire de par aduse sub form de pudr. M.Uhl consider ca analiza din fire de pr a drogurilor de abuz i a substantelor de dopaj este extrem de important. GC/MS/MS ofer o bun sensibilitate n acest sens. Mieczkowski i autorii compar probe de pr ale aceleai persoane analizate prin dou metode, radioimunoanaliza (RIA) si GC/MS. Rezultatele sunt foarte apropiate, dar analiza GC/MS ofer o precizie mai mare i limita de detecie atinge valori mai mici. Prima analiz prin GC a compusilor din Cannabis sativa (marihuana) a fost fcut n 1961 de ctre Kingstone si Kirk care au separat rini produse de plant pe o coloan cromatografic cu faza 2% SE 30. Analize pe extracte n benzen de frunze i flori cu detector cu 90Sr cu ionizare cu radiaie beta i un catarometru n serie, colectare de fraciuni ( Davis i autorii, 1963) au artat prezena compuilor: canabidiol, canabinol, tetrahidrocanabinol, acid canabidiol (decarboxilat n GC la canabidiol), pirahexil. Analizele au artat diferene importante ntre constituenii plantei din diferite regiuni care depind de diferii factori climatici, soare, temperatur, ploi. Analiza GC a uleiului esenial de marihuana, care conine compuii volatili, (Nigam i autorii) a condus la determinarea urmtorilor compusi: alfapinen, camfen, beta-pinen, mircen, alfa-terpinen, limonen, beta-felandren, gama-terpinen, para-cimen, linalool oxid, linalool, sabinen hidrat, alfa-bergamoten, terpinen-4-ol, cariofilen, bata-farnesen, alfa-terpineol, beta-humulene, alfa-selinen, curcumene, cariofilen-oxide. Aceti constitueni sunt constitueni de arom care intr n compoziia multor plante. Allen i autorii compar dou metode de extracie a morfinei din snge, extracia pe faz solid (SPE) i extracia cu lichid supercritic (SFE). Rezultatele cantitative sunt comparabile, dar SFE este o metod mai rapid, mai curat, cu randament de extracie mai bun, dar este mai scump.

41

Dempsey i autori determin timpului de njumtire la eliminarea cocainei i benzoilecgoninei (BZE) la nou nscut. Analiza cantitativ s-a fcut prin GC/MS. Metoda de extracie s-a dezvoltat pentru probe de snge i urin de 0,1 ml. S-a determinat un timp de njumtire pentru cocain de 11,6 h; pentru BZE s-a determinat n prima zi de via 16h (bazat pe probe de snge); n prima sptmn de via 11,2 h, (bazat pe probe de urin); Metoda nou de extracie din volume mici de probe se poate aplica i pentru alte medicamente. Se tie c n rile occidentale i mai ales n SUA se utilizeaz analiza unor lichide organice n laboratoarele de toxicologie ale unor instituii cum ar fi poliia, centrele de dezintoxicare, spitale i mai ales n centrele de medicin legal. Prezint n continuare un control doping pentru metenolon utiliznd analiza prului uman cu ajutorul cuplajului GC/MS. Printre alte metode utilizate n analiza substanelor halucinogene din corpul uman (HPLC, EMIT) GC/MS este o tehnic puin mai simpl dar totodat la fel de performant ca i celelalte. Probele de pr au fost prelevate de la doi culturiti ce au fost arestai de ctre poliia francez fiind acuzai de trafic de substane halucinogene. Prepararea probelor Proba de pr (100 mg), este n prima faz decontaminat cu clorur de metilen. Aceast prob este introdus n 1ml (1M) de NaOH timp de 15 minute la o temperatur de 95C, n prezena a 1 g de testosteron-d3,(cu concentraia final de 10 pg/mg) folosit ca i standard intern. Dup cum se vede, metoda de analiz este metoda standardului intern. Produsul omogen obinut este neutralizat cu 1ml 1M HCl, pentru ca substanele din pr i mai precis keratina s se descompun, i extras utiliznd consecutiv faza solid i extracia lichid-lichid. Reziduul urmat n urma acestor operaii este derivatizat prin adugarea a 50l MSTFA-NH4I-2-mercaptoetanol, (N-Metil-N-trimetilsililtriforacetamin) apoi este incubat la o temperatur de 60C timp de 20 de minute. Din ntreg extractul derivatizat, doar 1,5 l este introdus n coloana spectrometrului.

42

Aparatura Pentru efectuarea acestei analize s-a folosit un aparat Hewlett-Packard cu caracteristicile urmtoare: coloana capilar compus din 5% fenil-95% metilsiloxan, de dimensiune 30m/0.25mm i de grosime 0.25 m. Metenolonul a fost identificat prin ionul printe cu m/z=446 i ionii cu m/z=208 i m/z=195 cu un detector Finnigan TSQ 700 MS-MS. Prin aceast metod i utiliznd GC/MS ca i aparat de analiz acesta poate s detecteze 1 pg/mg de metenolon n condiiile n care au fost procesate doar 100 mg de pr. Rezultate i discuii Liniaritatea a fost observat atunci cnd concentraia merge de la 2 la 100 pg/mg avnd un coeficient de corelaie de 0,965 -0,981. Aceast analiza relev prezena metenolonului n corpul acestor doi sportivi n concentraie de 7,3 si 8,8 pg/ml. Folosirea NaOH presupune o complet descompunere a prului, dar nu afecteaz analiii a cror stabilitate n condiii alcaline a fost demonstrat n timpul analizei. n condiii cromatografice nu a avut loc nici o interferen ntre analii i materialele extractabile endogene prezente n pr. Pentru a obine un grad optim de selectivitate care este de o mare importan n controlul anti-doping, a fost aplicat tehnica SRM (selectare monitorizat a reaciilor). Este de preferat s se produc un semnal ionic intens, caracteristic pentru compusul analizat. Selectivitatea i sensibilitatea sunt mrite foarte mult prin micorarea zgomotului. O cromatogram obinut de la un calibrator la 5 pg/mg este artat n figura 19 Ionii selectai i timpii de reinere ai metenolonului sunt trecui n tabelul 3. Ionul printe al metenolonului corespunde ionului molecular (m/z 446), cei doi ioni secundari (m/z 208 i 195) au fost alei pe baza criteriului de specificitate i abunden. Liniaritatea se observ ntre 2-100 pg/mg. Mai jos sunt prezentai timpii de reinere ai metenolonului i ai testosteronului, care a fost folosit ca i standard intern i ionii corespunztori timpilor de reinere. Metenolonul are doi ioni printe, unul cu m/z 195 i unul cu m/z 208. Analitul Metenolon Testosteron d3 Timpul de reinere (minute) 10,84 10,54 Ionii (m/z) 446-195 i 208 209

43

Tabel 3. Timpii de reinere i ionii selectai ai metenolonului i testosteronului-d3.

Fig. 19 Cromatogramele obinute dup extracie: prima cromatogram indic primul ion al metenolonului m/z=195; cromatograma a doua indic al doilea ion al metenolonului m/z=208

44

45

Fig 20 Cromatograma de sus reprezint testosteronul d3 cu ionul principal la m/z=209, iar cromatograma de jos reprezint metenolonul

n urma a trei calibrri independente, coeficienii de corelaie au variat ntre 0.965 i 0.981. Din materialul introdus n coloan, s-a recuperat un procent de 97%. Limita de detecie a metenolonului a fost de 1pg/mg. Limita de cuantificarea fost primul punct al curbei de calibrare (2pg/mg). Procedeele cromatografice extensive: (dou faze de purificare, una prin faza solid i o extracie lichid-lichid) au fost premisele analitice pentru identificarea metenolonului din pr datorit concentraiei mici din proba analizat. Analiza firelor de pr obinute de la doi culturiti relev prezena metenolonului n corpul acestora n concentraie de 7.3 respectiv 8.8 pg/mg. Figura 19 reprezint cromatograma obinut prin selectarea monitorizat a reaciei (SRM) primului atlet. Aceste rezultate nu au fost contestate de ctre subieci. Literatura de specialitate este foarte srac n lucrri care s trateze identificarea metenolonului din pr. n 1999, Deng i autorii au testat steroizii anabolici din firele de pr de la 7 persoane care abuzau de steroizi. Oricum, la o limit de detecie de 20 pg/mg i o recuperare la 24%, autorii lucrrii nu au reuit s diagnosticheze pozitiv nici un subiect suspect. Prepararea probelor de pr pentru determinarea coninutului de metenolon implic o puternic hidroliz alcalin pentru a mri recuperarea urmelor de metenolon din pr. Substanele omogene din pr au fost extrase conform tehnicii propuse de Comitetul Internaional Olimpic pentru urin care au fost adaptate pentru analiza prului. Cnd se utilizeaz analiza prului n cazul unui subiect suspectat de dopaj, n mod special n cazul n care substana fost identificat n urin iar n pr nu, apare problema dac procedura a avut acurateea necesar. Dac n probele de pr sunt gsite urme de substane anabolizante, iar n urin nu sunt detectate, cazul respectiv de dopaj devine ambiguu, neputndu-se ajunge la o concluzie unanim, riscndu-se o eroare n acel caz. Pn cnd laboratoarele care se ocup cu astfel de analize nu vor deine o aparatur adecvat i n acelai timp destul de performant pentru a analiza cele dou tipuri de probe, compararea rezultatelor obinute n cele dou cazuri nu este indicat. Pentru ca steroizii

46

anabolici s aib un efect vizibil n mbuntirea performanelor unui sportiv, trebuie s fie administrate regulat, spre deosebire de cocain sau amfetamin, care au un efect imediat. O mai mare rezisten a corpului uman la efort este dat de administrarea unor substane active. Aceste substane sunt denumite steroizi anabolici i sunt componente structurale aparinnd testosteronului, hormonul brbtesc. Metenolonul, drog folosit de asemenea pentru dopajul sportivilor de performan, pe lng stanozolol sau nandrolon, este ambalat n tablete pentru administrare oral sub denumirea de accelereaz dezvoltarea muchilor printr-un efect anabolic Termenul lung de meninere n corpul uman a unor substane anabolizante a fost tot timpul o provocare pentru laboratoarele care se ocup cu controlul anti-doping. n controlul anti-doping, steroizii anabolici sunt detectai n urin folosind tandemul GC-MS, tehnica HPLC sau EMIT. Abuzul de steroizi anabolici este foarte greu de detectat n urin datorit faptului ca acetia sunt administrai pe o perioad bine determinat de timp, ntre 4 si 18 luni, dup care urmeaz o pauz de la o lun pn la un an, aceste perioade alternnd tot timpul. Efectele care apar n urma administrrii acestor steroizi anabolici, cum ar fi severe disfuncii cardio-vasculare, au fost depistate la tinerii care abuzeaz de aceste droguri n perioada administrrii acestora. Efecte mai grave, cum ar fi tumori hepatice sau tulburri neuronale, se depisteaz dup acea perioad de administrare n care sportivul a fcut abuz de acest drog. Mai mult dect att, abuzul de anabolizante n general are efect asupra metabolismului, funciilor organelor vitale, i n special al inimii i ficatului, ducnd frecvent la infarct miocardic sau insuficien renal. Analiza prului n vederea obinerii unor informaii n legtur cu administrarea unor droguri, a fost introdusa de 20 de ani n practic, toxicologia fiind de departe ramura care se ocup amnunit cu aceast metod. Studiile clinice i criminalistice indic folosirea acestei metode pe scar larg, metod foarte precis de detectare a drogurilor si steroizilor prezeni n corpul uman. Analiza urinei nu d informaiile scontate din cauz c drogurile pot fi administrate cu mult naintea controlului doping, i informaia din snge se pierde mai repede dect cea din pr. De aceea, cu ajutorul analizelor de pr rezultatele sunt satisfctoare i duc Primobolan, i pentru administrare intravenoas n fiole, sub denumirea de Primobolan-Depot. Acest drog

47

ntotdeauna la confirmarea sau infirmarea existenei acestor droguri n snge. Locul i rolul analizei prului n controlul anti-doping este pe larg descris n revistele de specialitate.

Determinarea unor compui toxici din substane de abuz

Componenii aromatici volatili, cum sunt benzenul, toluenul, etil benzenul i xilenul sunt foarte toxici. Expunerea la astfel de componeni este n mare msur datorat traficului autovehiculelor n aerul din mediu, iar n spaiile nchise se datoreaz n mare msur fumatului, dar i unor substane ca: vopsele, lacuri, adezivi. Prepararea probelor Probele de aer au fost adsorbite pe crbune activ, cca 250mg, aezat n cartuuri, cu un debit de 60 ml/min. Extracia s-a fcut cu clorur de metilen, agitnd 2 min, apoi, dup centrifugare i adugare a piridinei, standardul intern, 3 l s-au injectat n cromatograful de gaze. Aparatura S-a utilizat spectrometrul de mas cuadrupolar DSQ Thermo Finnigan cuplat cu cromatograful de gaze Trace GC . Coloana cromatografic utilizat a fost o coloan capilar Rtx-5MS, 15 m x 0.25 mm, 0.25m grosime film, ntr-un program de temperatur de 9 min , de la 30 oC (2min), 10 oC/min la 70oC, apoi 30oC/min la 220oC n modul de lucru monitorizare pe ion selectat (SIM), precum i n modul de lucru SCAN. Condiiile de lucru au fost: linia de transfer 250oC, temperatura injectorului:200 oC; a sursei de ioni 250 oC; Splitter: 10:1. Energia electronilor a fost de 70eV iar curentul de emisie al filamentului de 100A. n modul SIM s-au utilizat urmtorii ioni: m/z 78 pentru benzen, m/z 91 i 92 pentru toluen, m/z 91 i 106 pentru etilbenzen i xilen i m/z 52 i 79 pentru standardul intern. Rezultate i discuii Concentraiile de benzen, toluen, etil-benzen i xilen n diferite probe sunt prezentate n tabelul 4. Dup cum se vede, toate cele 4 substane se afl n aurolac i prenandez, de aici ne putem da seama de periculozitatea inhalrii acestora. Se vede c n prenadez i n aurolac, concentraia toluenului este foarte ridicat. Probele cu prenadez s-au prelevat i dintr-un

48

atelier de reparaii nclminte. Pentru toate aceste probe s-a folosit aceeai metod de prelevare, adic folosind o pomp special cu ajutorul creia se pompeaz 60 ml/min aer poluat ntr-un cartu n care se afl crbune activ, pe care aceste substane se adsorb. n tabelul urmtor sunt prezentate concentraiile BTEX din probele analizate mai sus.

Component B T E X

Aurolac 38,81 41,31 0,55 1,79

Prenadez 60,15 157,86 2,56

Atelier reparaii nclminte 21,43 95,85 1,5 0,7

Parc auto 0,024 0,001 -

Tabel 4. Concentraia (BTEX, n=2) n diferite probe

R T:0 .0 0 - 1 3 .6 7 100 80 60 40 2 .4 6 20 0 100 80 Relative Abundance 60 40 20 1 .3 0 1 .0 8 1 .5 8 1 .3 1 2 .6 6 80 60 40 20 0 0 1 2 3 2 .7 1 3 .0 4 4 .2 2 3 .5 3 4 .6 2 4 5 1 .4 1 2 .4 6 1 .0 6 1 .3 0 2 .1 6 2 .9 8 3 .3 4 4 .1 9 4 .5 8 5 .1 6 6 .8 1 7 .1 4 7 .9 3

NL : 4 .0 6 E 7 T IC M S P re n 1 l

2 .1 3

NL : 7 .0 2 E 7 T IC M S p a p u ci 1 p y1 mg

0 100

2 .9 8 3 .5 9 4 .1 9 4 .6 0 5 .2 9

6 .3 1 7 .0 5

7 .8 5
NL : 4 .2 1 E 8 T IC M S p re n 2 -2 0

5 .8 3 6 .3 5 6

7 .3 1 8

8 .5 3 9 .0 1 9

9 .9 5 10

1 1 .2 1 1 1 .9 1 11 12

1 3 .6 6 13

7 Tim e (m in )

49

Fig. 21 Cromatogramele SIM i SCAN pentru componenii extrai dintr-un litru de aer

(din atelierul

de reperaii nclminte i din aerul din apropierea unei sticle deschise de prenandez); (Benzenul, 1,30 min; toluenul, 2,46 min; piridina, standard intern, 2,16 min); Primul ion monitorizat este ionul benzenului, dup cum se vede i din cromatogram.
R T0 : .0 0 - 1 5 .6 2 100 90 80 70 60 Relative Abundance 50 40 30 20 10 0 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2 3 1 .3 1 2 .1 22 .5 0 1 0 .8 0 4 .0 74 .7 45 .3 1 6 .3 2 7 .5 38 .4 48 .6 4 1 0 .3 1 0 .4 5 1 1 .7 8 1 3 .1 3 1 4 .6 9 1 5 .2 7 4 5 6 7 8 9 T im e (m in ) 10 11 12 13 14 15 1 .0 7 1 .3 0 1 .0 6 1 .6 1 2 .4 6 2 .9 8 4 .0 34 .1 94 .7 4 6 .3 47 .0 5 7 .8 8 N L: 3 .5 3 E 8 T IC M S a u ro 1 s c a n _04030319 5726 2 .1 3 N L: 4 .1 1 E 7 T IC M S A u ro 1 l

Fig 21. Cromatogramele SIM i SCAN pentru componenii extrai dintr-un litru de aer

(din apropierea unei sticle deschise de aurolac) (Benzenul, 1,30 min; toluenul, 2,46 min; piridina, standard intern, 2,16 min);

50

51

Nr.ctr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Component Ciclohexan Benzen 3-metil hexan Dimetilciclopentan Heptan Metilciclohexan Toluen Octan Etilciclohexan Etil benzen (m+p)-xilen o-xilen Nonan Izopropilciclohexan Decan Undecan Etilbenzoat Benzylbromid Butil benzoat Difenileter Tetradecan Hexadecan Diizobutilftalat Nonadecan Benzil benzoat Dibutilftalat

tR 1.08 1.34 1.41 1.48 1.63 1.88 2.66 3.04 3.53 4.07 4.22 4.62 4.75 5.22 6.38 7.30 7.86 8.49 8.95 9.01 9.45 9.84 9.95 10.23 10.62 11.21

M 84 78 100 98 100 98 92 114 112 106 106 106 128 126 142 156 150 184 178 170 198 226 278 268 212 278

52

Tabel 5 Componenii identificai n prenadez, timpii de reinere i masele lor moleculare.

Tabel 6 Componenii identificai n aurolac, timpii de reinere i masele lor moleculare.

n tabelul 6 sunt prezentai componenii identificai n aurolac, timpii de reinere i

Nr.crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Component Benzen acetaldehida dietilacetal Octan Tetracloretan (impuritate din solvent) etil benzen (m+p)-xilen o-xilen Nonan Izopropilciclohexan trimetil benzen metilpropil ciclohexan Decan Undecan Butil izooctil ftalat Diizobutilftalat Diizooctil ftalat tR(min) 1.34 2.12 3.04 3.16 4.07 4.22 4.62 4.75 5.22 5.92 6.11 6.38 7.30 8.64 9.53 10.45 M 78 118 114 166 106 106 106 128 126 120 140 142 156 334 278 390

masele lor moleculare. La fel ca i n prenadez, se pot observa aproape aceiai componeni i

53

n aurolac. Aproape toi aceti componeni identificai n aceste probe sunt toxici, i inhalarea acestor substane este foarte periculoas pentru sntatea oamenilor. Din aceste dou tabele se poate trage o concluzie foarte important: metoda GC-MS este foarte sensibil i selectiv pentru analize de cantiti n urme. n tabelul 7 sunt prezentate limitele de detecie a celor mai des folosite droguri, alturi de metoda de detecie. Drog/matrice biologica Limita de determinare cantitativ 0,1-0,3ng/mg 2 ng/ml 5 ng/ml 2.5 ng/ml 150 ng/ml 100 ng/ml 500 ng/ml 1000 ng/ml 25ng/ml 50ng/ml 50ng.ml 100ng/ml 0.03g/ml 0.3g/ml 100ng/ml Preconcentrare/Metod Referin

Cocaina, opiacee/pr Tetrahidrocanabinol-9carboxilic acid/sange Benzoilecgonina; Fenciclidina, Amfetamina, Metamfetamina, Codeina, Morfina, Cocaina Etilencocaina Benzoilecgonina Ecgonin-metilester Benzoilecgonina/urin Cocaina/sange,urina

SPE; GC/MS SPE; GC/MS

Gaillard i Pepin Underwood

GC/MS (ITD)

Chasin Midio Hall

SPME;GC/MS EMIT GC/MS

Ohshima i Takayasu

Tabel 7 Limita de detecie cantitativ a celor mai importante droguri

54

CONCLUZII
n rile dezvoltate, analiza diferitelor substane cu ajutorul metodei GC-MS ocup un loc foarte important n special n toxicologie i criminalistic. Dezvoltarea tehnicii de analiz cantitativ duce la o dezvoltare a industriei farmaceutice, ajut foarte mult n special criminalitii i toxicologii n determinarea unor anumite substane aflate n corpul uman. Datorit sensibilitii foarte ridicate a acestor aparate, acestea sunt capabile s gseasc n corpul uman anumite substane care au fost administrate cu mult naintea efecturii analizei. Din pcate, n ara noastr tehnica de analiz cu ajutorul GC-MS este foarte puin dezvoltat, din cauza costurilor prea ridicate a aparatelor, a substanelor necesare efecturii analizelor, i din cauza existenei insuficiente de specialiti n domeniu. Introducerea unui astfel de sistem de analiz ar face mai uoar munca farmacitilor, a toxicologilor, a criminalitilor, pentru c, dup cum se tie, doar la Institutul de Medicin Legal din Bucureti se fac astfel de analize. n general aceste instituii sunt dotate doar cu spectrometre de mas pe strat subire, cum de altfel exist si la Institutul de Medicin Legal din Cluj-Napoca, care nu poate exprima cantitativ nivelul unor substane, doar confirm sau infirm existena acestor substane n organism. Analizarea probelor prelevate de la sportivii de performan este de asemenea important, i dup cum am amintit mai sus, aceste analize se fac doar la Institutul de Medicin Legal din Bucureti. Existena a mai multor Centre de Medicin Legal dotate cu astfel de sisteme de analiz este foarte important mai ales pentru sportul de performan n general. Analizele de alcoolemie a unor produi biologici prelevai de la conductorii auto surprini in stare de ebrietate, este de asemenea important pentru stabilirea alcoolemiei. Inspectoratele de poliie ar trebui s fie dotate i ele cu astfel de aparatur, pentru uurarea procedurii pe care trebuie s o fac organele de poliie. n rile dezvoltate, n mai toate centrele regionale de poliie exist astfel de aparate, care pot s analizeze probele biologice recoltate de la conductorii auto. La o astfel de analiz pot s apar i surprize, dac persoana investigat a consumat i droguri. Un control de rutin al alcoolemiei nu este suficient, mai ales dac persoana a mai consumat i droguri.

55

Substanele de abuz cum sunt n care se ncadreaz i aurolacul sau prenadezul, conin componeni toxici, printre care toluenul i benzenul sunt n cantitate foarte mare i reprezint solvenii utilizai n substanele respective. Metoda GC-MS este rapid, precis i specific pentru analiza unor compui de interes pentru toxicologie i criminalistic. Sistemul de analiz cromatografie de gaze cuplat cu spectrometrie de mas poate fi utilizat, n ecologie la determinarea de poluani organici, poluani BTEX (benzen, toluen, etil-benzen, xilen), dup cum se poate vedea i din analizele efectuate n capitolul 4, hidrocarburi din aer, sol, alimente, metale n urme, control alimente; n farmacie la determinarea de parametrii farmacocinetici, puriti ale medicamentelor, studii de bioechivalen; n medicin pentru tratament, diagnosticare, pentru c, aceast metod este foarte eficient mai ales cnd este vorba de diagnosticarea disfunciilor hepatice; n nutriie, n studii de metabolism; n geologie, chimie, fizic, biofizic, agricultur pentru determinarea poluanilor din sol, pentru determinarea calitii solului, etc. Datorit unei defeciuni la aparatul de analiz, nu am mai putut s analizez i unele probe prelevate de la indivizi care au consumat droguri, aflai sub supraveghere clinic la Secia Clinic de Psihiatrie III din Cluj-Napoca. Analizarea acestor probe ddea un neles mai profund acestei lucrri i oferea rezultate care puteau fi folosite de ctre medicii care i in sub supraveghere pe aceti consumatori, dar putea fi i un material de referin pentru cercettorii din acest domeniu, pentru c pe acest domeniu nu s-a pus pn acum un accent deosebit.

56

Bibliografie
1. M. Culea, E. Culea, Metode fizice de analiz; Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2004. 2. Y.Gaillard, G.Pepin, Simultaneous solid-phase extraction on C18 cartridges of opiates and cocainics for an improved quantitation in human hair by GC-MS one year of forensic applications, Forensic Sci. Int. 86(1-2):49-59, 1997. 3. T.Korte, J.Pykalainen, P.Lillsunde, T.Seppala, Comparison of RapiTest with Emit d.a.u. and GC-MS for the analysis of drugs in urine , J Anal Toxicol. 21(1):49-53, 1997.
4.

P.J.Underwood. G.E.Kananen, E.K.Armitage, A practical approach to determination of laboratory GC-MS limits of detection J Anal Toxicol. 21(1):12-6, 1997. J.S.Gracioso, M.Q. Paulo, C.A. Hiruma Lima, A.R.Souza Brito, Antinociceptive effect in mice of a hydroalcoholic extract of Neurolaena lobata (L.) R. Br. and its organic fractions J Pharm Pharmacol. 50(12):1425-9, 1998. A.A.Chasin, A.F.Midio, Validation of an ion-trap gas chromatographic-mass spectrometric method for the determination of cocaine and metabolites and cocaethylene in post mortem whole blood, Forensic Sci Int. 109(1):1-13, 2000. S.W.Toennes, A.S.Fandino, G.Kauert. Gas chromatographic-mass spectrometric detection of anhydroecgonine methyl ester (methylecgonidine) in human serum as evidence of recent smoking of crack J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 735(1):12732, 1999. M.A.Huestis, J.M.Oyler, E.J.Cone, A.T.Wstadik, D.Schoendorfer, R.E.Joseph Jr., Sweat testing for cocaine, codeine and metabolites by gas chromatography-mass spectrometry [Review] [54 refs], J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 733(1-2):24764, 1999. B.J.Hall, A.R.Parikh, J.S.Brodbelt, Aqueous phase hexylchloroformate derivatization and solid phase microextraction: determination of benzoylecgonine in urine by gas chromatography-quadrupole ion trap mass spectrometry J Forensic Sci. 44(3):527-34, 1999. T.Ohshima, T.Takayasu, Simultaneous determination of local anesthetics including ester-type anesthetics in human plasma and urine by gas chromatographymass spectrometry with solid-phase extraction, J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 726(1-2):185-94, 1999.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

57

11.

J. Segura, C.Stramesi, A.Redon, M.Ventura, C.J.Sanchez, G.Gonzalez, L.San, M.Montagna, Immunological screening of drugs of abuse and gas chromatographic-mass spectrometric confirmation of opiates and cocaine in hair J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 724(1):9-21, 1999. S.Pichini, R.Pacifici, I.Altieri, M.Pellegrini, P.Zuccaro, Determination of opiates and cocaine in hair as trimethylsilyl derivatives using gas chromatographytandem mass spectrometry, J Anal Toxicol. 23(5):343-8, 1999. M.A.elSohly, W.J.Kopycki, S.Feng, T.P.Murphy, B.J.Lukey GC/MS analysis of m-hydroxybenzoylecgonine in urine. Forensic implication in cocaine use Clin Lab Med. 18(4):699-704, ix, 1998. J.Segura, R.Ventura, C.Jurado,Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectrometric determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents. [Review] [281 refs] J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 713(1):61-90, 1998. H.P.Eser, L.Potsch, G.Skopp, M.R.Moeller, Influence of sample preparation on analytical results: drug analysis [GC/MS] on hair snippets versus hair powder using various extraction methods Forensic Sci Int. 84(1-3):271-9, 1997.

12.

13.

14.

15.

16. M.Uhl Determination of drugs in hair using GC/MS/MS, Forensic Sci Int. 84(13):281-94, 1997.
17.

T. Mieczkowski, R.Mumm, H.Connick, A research note: an analysis of RIA and GC/MS split hair samples from the New Orleans Pretrial Diversion Program, Forensic Sci Int. 84(1-3):67-73, 1997.

18. B.J.Gudzinowicz , Gas Chromatographic Analysis of Drugs and Pesticides, Edward Arnold ltd., London, Marcel Dekker,Inc., New York, 1967. 19. D.L. Allen, K.S. Scott, J.S. Oliver, Comparison of solid-phase extraction and supercritical fluid extraction for the analysis of morphine in whole blood, J.Anal. Toxicol., 23(3);216-218, 1999. 20. D.Dempsey, P. Jacob, J.C. Partridge, R.T. Jones, K. Panganiban, M.C. Rowbatham, Cocaine metabolite kinetics in the newborn, J.Anal. Toxicol., 23(1);24-8, 1999. 21. G. Guiochon, C. Pommier, La chromatography en phase gaseuse, Chimie inorganique ,1971. 22. 23. Robert L. Grob, Modern practice of gass chromatography, 1977. M.A. Frankle, J. Payne, G.J. Cicero, J.Am. Med. Assoc. 252 (1984) 482;

58

24. S.B. Karsch, in: S.B. Karsch (Ed.), The Pathoogy of Drugs Abuse, 2nd ed., CRCPress, FL,1996, p.409. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. R. Hausmann, S. Hammer, P.Betz, Int. J. Leg. Med. 111, (1998) 261. B. Madea, W. Grellner, F. Musshoff, R. Dettmeyer, J. Clin.Forensic Med.5 (1998) 1. P. Kintz, Toxicol. Lett. 102-103 (1998), 109. L. Rivier, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 309. P. Kintz, V. Cirimele, B. Ludes, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 325. F. Pragst, M. Rothe, K. Spiegel, F.Sporkert, Forensic Sci. Rev.10 (1998) 81. R. Wennig, Forensic Sci. Int. 107 (2000), 5.

32. Y. Nakahara, in: T. Mieczkowiski (Ed.), Drug Testing Technology, CRC Press, Boca Raton, FL. 1999, p. 49. 33. 34. X.-S. Deng, A. Kurosu, D.J. Pounder, J. Forensic Sci. 44 1999, 343. D. Thieme, J. Grosse, H. Sachs, R.K. Mueller, Forensic Sci. Int. 107 (2000) 335.

35. Loi No. 99-223 from March 23, 1999 and Decret No. 2001-35 from 11 january2001, Ministere de le Jeunesse et des Sports. 36. D. Paul Buddha, C. Dreka, S. Eric Knight, M. Smith Gas chromatographic/Mass Spectrometric Detection of Narcotine, Papaverine,and Thebaine in seedsof Papaver Somniferum, Division of Forensic Toxicology, Armed Forces Institute of Pathology (1998). 37. M. ElSholy, A.B. Jones, Handbook of Workplace Drug Testing, (1995) p.225-237.

38. Department of Health and Human Services, Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs,Part IV. 11970-11988. 39. K. Pfleger, H. Maurer, A. Weber, Mass Spectral and GC Data of Drugs, Poison and Their Metabolites, Part II, VCH, Weinheim, (1985).

59