CROMATOGRAFIA.

METODE CROMATOGRAFICE APLICATE IN

CONTROLUL MEDICAMENTELOR

CROMATOGRAFIA este una din ramurile vaste ale analizei (instrumentale) medicamentului, cu aplicatii
largi in separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si in analiza si controlul
medicamentelor in particular.
Conform FR X, cromatografia este o metoda fizico-chimica de separare a unor substante dintr-un
amestec, intr-un sistem constituit dintr-o faza stationara si o faza mobila care se deplaseaza intr-o directie
data.
Metoda cromatografica se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiata a substantelor din
amestecul respectiv, ca urmare a unor diferente de adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de vapori,
marimea moleculelor, etc.

Metoda cromatografică a fost descoperită de botanistul rus Mihail Tsvet în 1906 şi a fost folosită întâi
pentru separarea unor pigmenti vegetali (ex. Clorofilele si xantofilele). Un rol important in dezvoltarea
cromatografiei l-au avut Martin si Synge (Premiul Nobel in 1962), care au pus bazele cromatografiei de
repartitie, ceea ce a dus la descoperirea proceselor intime de separare, la stabilirea parametrilor
cromatografici si la dezvoltarea continua a performantelor de separare, detectie si dozare ale metodelor
cromatografice.
• Tehnicile cromatografice de analiza sunt in primul rand tehnici de separare, dintre cele mai
selective si eficiente, inclusiv pentru urme de substante si asociate cu metode de detectie, sunt capabile sa
sesizeze cantitati infime de substante, ceea ce le confera o mare sensibilitate, selectivitate si eficienta.
• Separarea diferitelor substanţe dintr-un amestec constituie una dintre cele mai importante
probleme ale chimiei analitice.
Se poate spune ca toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si o faza
mobila, iar componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un flux de faza
mobila, gazoasa sau lichida, cu viteze diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al separarii.
La baza tuturor metodelor cromatografice de separare, stau PATRU procese fundamentale:
• adsorbtia pe suporturi solide;
1
• repartitia intre faza stationara si cea mobila;
• schimbul ionic;
• excluderea, difuzia.
Principiul separarii poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice sunt aceleasi:
• pregatirea fazei stationare;
• fixarea initiala a analitilor, in capul coloanei, pe faza stationara, dupa introducerea solutiei de
proba;
• deplasarea selectiva, caracteristica a analitilor, antrenati de faza mobila, in cadrul procesului de
elutie, developare;
• identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si trec in
detector;
• inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor pic-urilor si a altor parametri si dozarea
analitilor corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a rezultatelor.
Este dificil de a realiza o clasificare atotcuprinzatoare a tehnicilor cromatografice, dar tinand cont de
natura fazelor stationare si a celor mobile se poate realiza o clasificare acceptabila si rezonabila a
metodelor cromatografice:
• Cromatografia in faza gazoasa
• Cromatografia in faza lichida
► Planara (sau de suprafata)
- pe hartie (CH)
- pe strat subtire (CSS)
► Pe coloana
- de adsorbtie solid-lichid
- de repartitie lichid-lichid
- de schimb ionic
- de excludere-difuzie
fiecare din acestea cu subclasificari.
Alegerea fazelor stationare se face in functie de masa moleculara a analitilor, de solubilitatea lor in
solventi organici si in apa, de caracterul lor (nepolar, polar sau ionic).
• In cromatografia de absorbtie, faza stationara este un suport solid (ex. Al2O3; SiO2), care are
proprietati absorbante.
• In cromatografia de repartitie, faza stationara este o pelicula de lichid fixata pe un suport solid
(SiO2), cele doua faze nefiind miscibile.
• In cromatografia de schimb ionic, faza stationara este un compus macromolecular, care contine
un numar mare de grupari functionale, acide sau bazice, capabile sa schimbe cationi bi- si trivalenti
(grupari acide) sau anioni (Cl¯; OH¯; grupari bazice), cu cationi si anioni mai grei si cu sarcina mai

2
mare. Aceste macromolecule schimbatoare de ioni, se mai numesc si rasini cationice sau cationiţi si
anionice sau anioniţi.
• In cromatografia de excludere sterica sau de excludere-difuzie, faza stationara este de regula un
gel, care se comporta ca o sita moleculara, fixand anumite molecule si eliminand altele, in functie de
marimea si masa lor moleculara.
In afara de aceste tipuri fundamentale de metode cromatografice, exista si unele procedee cromatografice
specifice, caracteristice unor specii chimice:
• Cromatografia chirala, de absorbtie sau de repartitie; se caracterizeaza prin structura chirala a
fazei stationare sau a fazei mobile, ceea ce permite separarea selectiva a analitilor chirali (respectiv a
enantiomerilor).
• Cromatografia cu lichide supercritice, care exploateaza solubilitatea analiţilor intr-un fluid
supercritic (ex: CO2), folosit ca atare sau modificat (in amestec cu metanol); metoda asigura extragerea
analiţilor din matrice si ulterior separarea cromatografica.
• Cromatografiade afinitate, care se bazeaza pe proprietatea unor adsorbanti macromoleculari de a
manifesta o afinitate specifica pentru anumiti analiţi.
• Electro-cromatografia capilara micelara, o tehnica hibrida, care imbina cromatografia cu
electroforeza.
In functie de procedeul practic utilizat:
• Cromatografie pe coloana, in care faza stationara este plasata intr- o coloana (tub de metal, sticla,
silice-silice topita).
• Cromatografie planara/de suprafata, pe hartie sau pe strat subtire.
In functie de migrarea fazei mobile, se disting:
• Cromatografie prin developare, in care analiţii raman pe faza staţionara sau sunt localizaţi pe
aceasta; in functie de directia de migrare, ascendenta sau descendenta.
• Cromatografie de eluţie, in care analiţii sunt eluaţi (spalaţi) pana la iesirea lor completa din
coloana, deci din faza staţionara, fiind posibila culegerea succesiva a fracţiunilor de analiţi si in acest caz
detectia se face in efluenţi.
Pentru intelegerea si pentru utilizarea corecta a proceselor cromatografice, trebuie precizati parametrii
sau marimile care definesc si explica procesele cromatografice de separatie.
Ex: o proba cu 2 analiţi. Pe coloana pregatita in prealabil se introduce un volum din proba, se adauga faza
mobila, putin cate putin, incepe developarea, adica migrarea analiţilor cu viteze diferite; continuand a
adauga faza mobila, se produce eluţia, adica extragerea din coloana a fiecarui analit, pana la iesirea din
coloana.
La aparatele moderne de cromatografie, efluentul se conduce direct la detector, in care se face detecţia
analiţilor separaţi.
Pentru un amestec de analiţi, este posibil sa se utilizeze un detector plasat cat mai aproape de iesirea
efluentului din coloana si care inregistreaza continuu semnalul analitic, semnal proporţional cu variatiile
concentratiilor analiţilor separati si eluaţi, care traverseaza coloana, obtinandu-se cromatograma
corespunzatoare, inregistrata de un inregistrator/recorder, care face parte din ansamblul instrumentului de
analiza cromatografica.
Fiecarui analit ii corespunde un “pic” pe cromatograma care se inregistreaza intr-un sistem de coordonate.
Se observa ca procesul de separare se produce treptat intre faza stationara si faza mobila existand un
3
echilibru – determinat de concentratiile fiecarui analit in cele 2 faze si a caror raport reprezenta
coeficientul de repartitie sau de distributie (k).

Parametrii/marimile de retenţie cromatografica sunt:

• timpul
• volumul
• distanţa
• factorul/raportul de retentie,
acestia fiind legati de coeficientul de distribuţie (k) intre faza stationara si cea mobila.
• Timpul de retenţie – tR = timpul scurs de la introducerea probei de analit in coloana si momentul
in care apare maximul pic-ului din coloana;
• t0 sau tm = timpul mort = timpul necesar ca faza mobila sa ajunga la detector si se datoreaza
parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spatiile fazei stationare;
• de regula, eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pic al detectorului, si din
acest moment, se masoara timpul de retentie al analitului, numit timp de retentie corectat. (tR’=tR-t0)
• Volumul de retentie – VR = reprezinta volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cu
concentratia sa maxima in detector.
• Similar timpului de retentie, volumul de retentie corectat. (VR’=VR-V0)
• Raportul de retentie (RR) - se exprima prin raportul dintre viteza medie de deplasare a analitului
si viteza medie de deplasare a fazei mobile.

4
Factorul de retentie se exprima prin raportul dintre cantitatea de analit care se gaseste in faza stationara
(Qs) si cantitatea de analit care se gaseste in faza mobila (Qm).
K= QS/QM
• Componenţii amestecului analizat, având coeficienţi de distribuţie diferiţi se vor deplasa în
procesul eluţiei cu diferite viteze şi vor avea un timp de reţinere diferit, în condiţiile date.
• Constanta de distribuţie este factorul principal, care determină separarea substanţelor pe coloana
cromatografică. Cu cât mai mare va fi diferenţa dintre valorile constantelor de distribuţie, cu atât mai
efectivă va fi separarea cromatografică în condiţiile date.
Cromatografia poate fi definită ca un proces dinamic bazat pe realizarea multiplă a actelor de echilibru la
distribuţia componenţilor amestecului în cele două faze nemescibile ce vin în contact.

CROMATOGRAFIA PE HARTIE (C.H.)

Realizeaza separarea sau distribuirea componentelor dintr-un amestec intre:
• faza stationara, constituita din hartia cromatografica (de regula celuloza 95-99%) impregnata cu
un solvent polar (apa, solutii tampon);
• o faza mobila, constituita dintr-un sistem de solventi de polaritate opusa (nepolari).
Procesul de separare are la baza in general un mecanism de repartitie, dar se pot intalni si
mecanisme de absorbtie, schimb ionic, reactii chimice.
Aparatura este dependenta de procedeul ales pentru developare.
In general se utilizeaza camere sau bac-uri cromatografice din sticla sau metal (de regula inox),
cu posibilitatea de inchidere etansa (cu vizoare), de forma cilindrica sau paralelipipedica, prevazute cu un
dispozitiv de fixare a hartiilor cromatografice si cu o cuva care in cazul tehnicii ascendente se fixeaza pe
fundul vasului cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente se fixeaza la partea superioara a vasului.
Benzile de hartie cromatografica sunt specificate in monografia respectiva; toate sorturile de
hartie cromatografica utilizate (Whatman, Munktel, Schleicher-Schűll, Toyo, etc) sunt caracterizate prin:
• viteza de migrare a solventului
• porozitate
• aspectul suprafetei (mata, lucioasa)
• grosime
si eventual, utilizarea ei, care deriva din pretratare (ex: hartia hidrofobizata, in scopul separarii
substantelor hidrofobe)
Tehnica de lucru
• Daca nu se prevede altfel, cu 24 h inainte de determinarea cromatografica, vasul cromatografic
se satureaza cu toate componentele fazei mobile (adica a developantului), introduse in cristalizoare la o
temperatura de 20-25 ºC.
• Tehnica cromatografica (ascendenta, descendenta), pregatirea benzilor de hartie cromatografica,
developantul, modul de preparare al solutiilor de aplicat (proba si etalonul), volumele aplicate si distanta
parcursa de developant sunt prevazute in monografia respectiva.

5
• Linia pe care se aplica solutiile - linia de start – trebuie sa fie situata la o distanta de 5-6 cm de
marginea benzii de hartie pentru tehnica ascendenta si de 10-12 cm pentru tehnica descendenta.
• Distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin 2,5 cm.
• Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, cu micropipete,
microseringi, in puncte circulare cu diametru de cel mult 6 mm. Daca este cazul, solutia se aplica in mod
repetat asteptand de fiecare data evaporarea solventului.
• Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, hartia cromatografica se scoate, se usuca si se
pun in evidenta petele conform prevederilor din monografie.
• Se trece la identificare, evaluare semi-cantitativa si dozare.
• Dozarea se mai poate efectua si dupa decuparea petei si eluarea acesteia cu un solvent potrivit
conform prevederilor.
Aplicatii ale cromatografiei pe hartie:
• metoda oficiala pentru determinarea puritatii radiochimice a substantelor radioactive;
• identificarea si dozarea fenobarbitalului din comprimate;
• identificarea si puritatea maleatului de ergometrina;

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE (C.S.S.)

• Este o metoda ce permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferentei lor de
deplasare de-a lungul unui strat absorbant care acopera o placa de sticla, metal sau polimer sub actiunea
unui sistem de solventi.
• Stratul absorbant constituie faza stationara si poate avea o grosime de 0,2-0,3 mm pentru scop
calitativ si 1-2 mm pentru scop cantitativ.
• Separarea evidentiaza un mecanism de adsorbtie, repartitie, schimb ionic, s.a.
• Cei mai uzuali adsorbanti ce alcatuiesc faza stationara, utilizati in C.S.S. sunt:
• silicagelul
• celuloza
• oxidul de Al
• kieselgur-ul

6
Tehnica de lucru: asemanatoare C.H., iar particularitatile sunt prevazute in monografia respectiva.
In C.H. sau C.S.S. zona de migrare este definita prin Rf , care reprezinta raportul dintre distantele de
migrare ale componentelor si frontul fazei mobile.
Pentru indentificarea substantelor se compara pe aceiasi cromatograma valoarea Rf, culoarea si
fluorescenta petei obtinute cu solutia probei, cu valoarea Rf, si culoarea si fluorescenta petei obtinute cu
solutia etalon.

• a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicate al solutiei pana la centrul petei (in
cm);
• b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei pana la frontul
developantului, trecand prin centrul petei (in cm).
• De obicei, punerea in evidenta a punctelor de pe cromatograma, se efectueaza prin examinarea
acestora ca atare, sau dupa tratarea cu reactivi potriviti, in lumina vizibila sau UV.
• Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza dupa razuirea petelor respective si
eluarea substantelor de pe absorbant cu un solvent potrivit prin spectrometrie.
• Compararea vizuala a dimensiunii petelor si a intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste
pt evaluarea semi-cantitativa a impuritatilor.
Aplicatii:
• identificarea teofilinei si papaverinei din supozitoare;
• identificarea fenacetinei, cofeinei, aspirinei din comprimate;
• determinarea puritatii palmitatului de cloramfenicol, care admite cel mult 2% cloramfenicol
neesterificat;
• determinarea impuritatilor din tetraciclina (epitetraciclina, anhidrotetraciclina,
epianhidrotetraciclina).
CROMATOGRAFIA DE GAZE (C.G.)

7
• Este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica, in care faza mobila este un gaz (gaz
purtator), iar faza stationara este un solid (CGS) sau un lichid (CGL) cu care este impregnat un suport
solid, inert, sau un lichid uniform repartizat pe peretii unei coloane capilare. Faza stationara se afla intr-o
coloana (inchisa) cromatografica, confectionata de obicei din sticla sau din otel inoxidabil. Faza mobila se
deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul purtator trece prin detector.
• C.G. se utilizeaza atat in determinari calitative cat si cantitative.
• Cromatografia de gaze/GAZ-CROMATOGRAFIA, este o varianta a cromatografiei pe coloana si
permite atat separarea substantelor volatile, cat si a celor care in urma unor reactii chimice pot fi
transformate in derivati volatili si stabili.
Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale:
• sursa de gaz
• camera de evaporare
• coloana cromatografica
• termostatul
• detectorul
• sistemul de inregistrare.

Schema de functionare a unui gaz-cromatograf

• Este cea mai utilizata tehnica cromatografica, deoarece prezinta o serie de avantaje care îi confera
o adaptabilitate deosebita la problemele care pot apare în timpul analizei amestecurilor complexe de
componente.
• Faza mobila este un gaz inert (heliu, neon, argon, H), numit si gaz vector sau purtatoar, care
antreneaza substantele de determinat; dupa separare componentele pot fi usor detectate deoarece faza
mobila nu interfera la detectie.
• Daca este cazul, componentele separate pot fi analizate suplimentar prin metode spectroscopice
cum ar fi spectrometria de masa sau spectrofotometria în IR.
Singurele limitari ale cromatografiei de gaze sunt determinate de volatilitatea prea scazuta sau
instabilitatea termica a componentelor analizate si aceste dezavantaje pot fi însa limitate, de exemplu, prin
transformarea compusilor respectivi în derivati care sa aiba volatilitate mai mare. Tehnica se numeste
derivatizare si este larg utilizata în cromatografia de gaze.
• Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba de
analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor.
• Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul coloanei este diferita, fapt ce duce la separarea
si la eluarea lor din coloana intr-o anumita ordine.
• Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori,
camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pentru a asigura o evaporare
rapida si fara a produce o degradare termica a probelor.
• Cu ajutorul termostatului in timpul determinarii, temperatura coloanei cromatografice este
mentinuta constanta.

8
• La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate
prin detector (care deosebeste proprietatile componentelor de cele ale gazului vector) si care emite un
semnal electric proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa, semnal care se inregistreaza.
● Se traseaza o curba in clopot analog unei curbe de distributie Gauss.
● Varful cromatografic sau pic-ul corespunde componentei separate, iar inaltimea lui este proportionala
cu concentratia componentului in faza gazoasa.
● Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare, iar rezultatele se prezinta sub forma unui grafic
semnal/timp.

Sensibilitatea detectorului
= reprezinta variatia marimii semnalului emis de detector în functie de cantitatea de solut si se exprima
prin valoarea pantei raspunsului detectorului pentru componenta respectiva. O sensibilitate mare a
detectorului va duce la un raspuns mai mare pentru aceeasi cantitate de solut analizata si deci va permite
analiza unor cantitati mici de proba, reprezintând o calitate importanta pentru un detector performant.
Limita de sensibilitate
= este un criteriu strâns legat de cel precedent, definindu-se prin cantitatea minima din componenta
respectiva pentru care se obtine un semnal de raspuns al detectorului de doua ori mai mare decât valoarea
medie a zgomotului (semnalului) de fond; cantitatea respectiva se numeste cantitate minima detectabila.
= Semnalul de fond reprezinta semnalul dat de detector în absenta vreunei componente injectate si
depinde de caracteristicile sale constructive.
Domeniul de raspuns liniar
= reprezinta intervalul în care semnalul de raspuns al detectorului este direct proportional cu cantitatea de
solut care ajunge în detector.
• Stabilirea acestei liniaritati se face prin etalonare, cu ajutorul unor etaloane pure ale compusilor
analizati. Asemenea etaloane pentru cromatografia de gaze sunt accesibile comercial, la o puritate foarte
avansata (în general peste 99,9 %).
Stabilirea domeniului de raspuns liniar este importanta mai ales pentru analiza cantitativa. În situatiile în
care raspunsul nu este liniar, caz întîlnit mai ales la detectoarele folosite în cromatografia de lichide dar si
la unele detectoare folosite în cromatografie de gaze, este necesara trasarea unor curbe de etalonare,
pentru a se putea efectua analiza cantitativa
Cuplarea cromatografului de gaze cu spectrometrul de masa (CG-MS)

9
• Atât cromatografia de gaze cât si spectrometria de masa (SM) sunt tehnici analitice de mare
utilitate pentru analiza compusilor organici.
• Combinarea lor într-un singur sistem duce însa la obtinerea unor rezultate care depasesc mult
ceea ce s-ar realiza prin simpla însumare a datelor oferite de cele doua tehnici.
• Sistemul ofera posibilitatea detectarii unui mare numar de compusi dintr-un amestec complex,
fiecare compus fiind identificat prin spectrul sau de masa, obtinut prin introducerea eluantului direct in
camera de ionizare a SM.
• Pentru a putea gestiona imensa cantitate de date oferita de un sistem GC-MS este neaparat
necesara utilizarea unui calculator echipat cu un program adecvat.
• Cuplarea cromatografiei de gaze cu spectrometria de masa ofera în primul rând posibilitatea
identificarii calitative a componentelor analizate, cu o probabilitate de eroare foarte mica.
Trecerea între cromatograf si spectrometru se realizeaza folosind niste dispozitive numite interfete.

Aplicatii ale cromatografiei de gaze

• C.G. se poate utiliza in analiza calitativa (identificare, decelare impuritati) si in analiza cantitativa
(cuantificarea impuritatilor si a principiilor active).
Determinari calitative
• Prin examinare vizuala, se compara gaz-cromatograma substantei de analizat cu gaz-
cromatograma substantei etalon.
• Prin compararea timpului de retentie (tR) sau a volumului de retentie (VR) a probei de analizat cu
cele ale etalonului.
• Cuplarea (CG-MS), ofera posibilitatea detectarii unui numar mare de compusi dintr-un amestec
complex, fiecare compus fiind identificat prin spectrul sau de masa obtinut, dupa introducerea eluatului
direct in camera de ionizare a spectrofotometrului de masa.
Determinari cantitative
La baza determinarilor cantitative sta relatia de proportionalitate intre aria de sub picul cromatografic si
cantitatea componentului eluat.
Se masoara aria si se coreleaza aria cu concentratia.

10
Masurarea ariei picului
• Prin metode manuale sau cu ajutorul unui integrator.
• In cazul picurilor simetrice, aria se masoara prin inmultirea inaltimii picului (h) cu latimea
picului determinata la jumatatea inaltimii picului (w½)
h · w½
b) Cand se considera picul un triunghi, (aria) A = (h · w)/2
c) Masurarea ariilor picurilor, este inlocuita uneori cu masurarea integrala a inaltimii picului (h) sau a
jumatatii ei (h/2)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)

• Cromatografia de lichide clasica (pe coloana, pe strat subtire, pe hartie) necesita o aparatura
simpla, dar este destul de lenta si cu o capacitate de separare relativ mica; detectia componetelor este
dificila, costisitoare si necesita cantitati mari de solvent si pregatiri tehnice laborioase.
• Cromatografia de gaze s-a impus ca o metoda rapida, sensibila si a cunoscut o mare extindere
prin cuplarea gaz-cromatografului cu spectrometrul de masa, limitele metodei, insa, fiind impuse de
conditia volatilizarii produsilor sau a transformarii lor in derivati volatili si stabili termic, aspecte ce fac
posibile determinari ale unui numar scazut de substante organice (aprox 15%).
• Cunostintele dobandite in gaz-cromatografie, transpuse in practica cromatografiei de lichide au
condus la o tehnica de inalta performanta, moderna, care se realizeaza cu o viteza mare si elimina
dezavantajele cromatografiei de gaze: HPLC (cromatografia de lichide la inalta performanta).
• Cromatografia de lichide la inalta performanta este o metoda fizico-chimica de separare
cromatografica in care faza mobila este un lichid, iar faza stationara continuta intr-o coloana, este
constituita dintr-un solid cu granulatie fina (CLS), sau un solid impregnat cu un lichid (CLL).

11
• Utilizand absorbanti cu o structura fina, se mareste rezistenta la curgere a fazei mobile si o data
cu scaderea vitezei de curgere, cresc timpii de retinere a componentelor pe coloana.
• In aceste conditii pentru realizarea unei separari eficiente, in timpi scurti de analiza, trebuie
realizate presiuni mari (cca. 400-600 barri) care, desi impun dificultati tehnice legate de o aparatura
adecvata, permit separari analitice, imposibil de realizat prin alte metode, rapide, eficiente, selective.
• Aceasta noua tehnica se numeste cromatografie de lichide la inalta performanta, sau la inalta
presiune, sau la inalta viteza, HPLC (HIGH PERFORMANCE-PRESSURE-LIQUID
CHROMATOGRAPHY); denumirea la inalta performanta se refera la viteza analizei, capacitatea de
separare, sensibilitatea metodei.
• In HPLC sunt necesare presiuni mari (de cateva sute de atmosfere) pentru a asigura debite
corespunzatoare ale fazei mobile; avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC-urile moderne
este foarte mica, (diametrul particulelor = 3 –10 μm) aparatura utilizata este mai complicata si foarte
scumpa.
• HPLC este o metoda rapida, eficienta, selectiva.

Avantaje HPLC (fata de CG):

• substantele de analizat nu trebuie sa fie volatile;
• majoritatea separarilor se pot efectua la temperatura obisnuita;
• timpi scurti de analiza;
• conditii de lucru simple pentru pregatirea probelor, efectuarea analizei si prelucrarea datelor;
• polaritatea fazei mobile si a fazei stationare poate fi variata.

In HPLC, separarea componentelor dintr-un amestec se bazeaza pe distribuirea lor intre doua faze, iar
mecanismele care stau la baza separarii definesc si tipurile de HPLC:
• HPLC de absorbtie
• HPLC cu faze inverse
• HPLC de repartitie
• HPLC prin schimb ionic
• HPLC prin excluziune moleculara

Substantele separate pe coloana sunt indicate de un sistem detector si inregistrate sub forma unei
cromatograme, care ofera posibilitatea evaluarii calitative si cantitative a probei de analizat.
Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de înalta performanta , este redata in figura alaturata.
Un sistem HPLC contine in principiu, un rezervor de eluent, o pompa de inalta presiune cu ajutorul careia
se realizeaza fluxul de faza mobila prin coloana, un injector pentru introducerea probei in fluxul fazei
mobile, o coloana din otel inoxidabil care are la interior faza stationara imobilizata , un detector si un
sistem de inregistrare. Sistemul poate fi controlat prin intermediul unui computer.

12
Tehnica de lucru: in fiecare monografie care utilizeaza tehnica HPLC sunt prevazute caracteristicile
coloanei cromatografice (tipuri, lungimea, diametrul interior, natura fazei stationare, dimensiunea
particulelor, etc) si conditiile de cromatografiere (concentratia solutiei de analizat, concentratia solutiei
standard, volumele de injectat din fiecare solutie, compozitia si debitul fazei mobile, temperatura, modul
de lucru, sistemul de detectare).
• Cu ajutorul solutiilor standard se regleaza aparatul si se determina volumul solutiilor de injectat
pentru a obtine un raspuns convenabil al detectorului.
• Se determina suprafata si inaltimea pic-urilor componentelor, iar din valorile obtinute se
calculeaza concentratia componentei/componentelor de determinat.
• Gradul de separare a doua substante intr-o cromatograma se defineste prin notiunea de rezolutie.
(Rs).
• Rezolutia (Rs) = reprezinta masura capacitatii efective de separare a doi compusi pe o coloana
specifica (avand o anumita lungime, raza, natura a fazei stationare, grosime, s.a.), in conditii bine
determinate (tº; natura si viteza fazei mobile, s.a. )

Aplicatii ale HPLC in controlul medicamentelor

Metoda ofera importante posibilitati de separare, detectie si cuantificare a speciilor chimice analizate,
avand largi aplicatii in analiza calitativa si cantitativa a medicamentelor:
• Decelarea impuritatilor si produsilor de degradare ale unor substante farmaceutice sau ale unor
produse farmaceutice.
• Studii de stabilitate ale unor produse farmaceutice.
• Izolarea si cuantificarea principiilor active din produse vegetale.
• In biofarmacie, pentru dozarea substantelor medicamentoase din lichide biologice.
• Analiza cantitativa si calitativa a preparatelor farmaceutice.
Identificare

13
O metoda uzuala de identificare a componentilor de analizat, bazata pe compararea parametrilor de
retentie a standardului cu cei ai componentului de identificat.
O alta metoda, este cuplarea lichid-cromatografului cu detectori specifici (ex. spectrometru de masa),
cuplare care furnizeaza date importante pe care analistul le poate utiliza pentru identificarea compusilor
separati.

Determinarea cantitativa
Se poate face realizand o serie de probe etalon de concentratii diferite (reaalizand astfel o curba de
dozare), sau folosind metoda standardului intern (o substanta de concentratie cunoscuta care elueaza
similar compusului care trebuie dozat).
• Metoda etalonarii externe
CX = AX/AE · CE
Formula se aplica cand domeniul de concentratie al analitului de interes in proba este cunoscut si
etalonul este o solutie a analitului de interes in stare pura la nivel de concentratie asemanator cu cel al
probei.
Cand nu se cunoaste domeniul de concentratie este necesara trasarea unei curbe de etalonare si prin
extrapolare se determina CX.
AX = aria picului corespunzator solutului de interes in cromatograma probei
AE = aria picului corespunzator solutului de interes in cromatograma etalonului
CE = concentratia solutului de interes din etalon
• Metoda etalonarii interne
Consta in adaugarea unui compus numit standard intern (de concentratie si puritate cunoscute) la
proba de analizat.
Standardul intern trebuie sa indeplineasca o serie de conditii:
• sa nu fie prezent in proba;
• sa fie bine separat de compusii de interes;
• sa fie stabil si sa nu reactioneze cu proba sau cu faza mobila;
• sa aiba puritate inalta;
• sa aiba un raspuns similar la detectie cu proba, pentru concentratiile utilizate;
• sa aiba un factor de retentie k similar cu al compusilor de separat.

14
Relatia prin care se determina concentratia procentuala % a analitului:
C% = AX/ASI . KX/KSI . mSI/m . 100
mSI = cantitatea de standard intern din proba injectata
m = cantitatea de proba injectata
KX, KSI = factor de raspuns pentru analitul de interes, respectiv pentru standardul intern
AX, ASI = aria picului solutului de interes, respectiv a standardului intern

15