CURS- ANALIZA MEDICAMENTULUI

Cromatografia in analiza si
controlul medicamentului
 INTRODUCERE

• Cromatografia este una dintre ramurile mari ale analizei

instrumentale cu aplicatii largi in separarea, detectia si
determinarea substantelor chimice in general si in
analiza si controlul medicamentelor in particular.
• Tehnicile cromatografice de analiza sunt tehnici de
separare selective si eficiente putand sa fie folosite
inclusiv pentru urme de substante.
• Tehnicile cromatografice de analiza sunt metode
instrumentale performante caracterizate prin
urmatoarele avantaje:
 INTRODUCERE- continuare

1) rapiditate
2) eficienta
3) forta (in ceea ce priveste selectivitatea, sensibilitatea,
automatizarea, miniaturizarea senzorilor si altor
componente, tratarea datelor analitice).
Tehnicile cromatografice au ca elemente comune o “faza
stationara” si o “faza mobila” iar componentii unui
amestec analizat sunt antrenati in lungul coloanei de un
flux de faza mobila (gazoasa sau lichida), cu viteze
diferite, ceea ce constituie procesul fundamental al
separarii.
 INTRODUCERE- continuare
La baza tuturor proceselor cromatografice de
separare stau 4 procese fundamentale:
1) adsorbtia pe suporturi solide
2) repartitia intre faza stationara si cea mobila
3) schimbul ionic
4) excluderea- difuzia
Chiar daca principiul separarii poate sa fie
diferit, etapele analizei cromatografice sunt
aceleasi si anume:
1) pregatirea fazei stationare;
2) fixarea initiala a analitilor in capul coloanei;
 INTRODUCERE- continuare

3) deplasarea selectiva- caracteristica analitilor, care sunt

antrenati de catre faza mobila, in cadrul procesului de
elutie (developare);
4) identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies
din coloana separatoare si trec in detector;
5) inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor
picurilor si a altor parametrii si dozarea analitilor
corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a
rezultatelor.
 INTRODUCERE- continuare

In functie de procesele care stau la baza separarilor

cromatografice exista:
1) Cromatografie de adsorbtie, faza stationara este un
suport solid care are proprietati adsorbante.
2) Cromatografie de repartitie, in care faza stationara este
o pelicula de lichid fixata pe un suport solid, faza
stationara lichida nefiind miscibila cu faza mobila.
3) Cromatografie de schimb ionic, in care faza stationara
este un compus macromolecular reticulat, care contine un
numar mare de grupari functionale acide sau bazice,
capabile sa schimbe protoni sau ioni alcalini cu cationi
 INTRODUCERE- continuare

bi si trivalenti sau anioni precum hidroxil sau clorura cu

anioni mai grei si cu sarcina mai mare (gruparile bazice);
schimbatorii de ioni se mai numesc si rasini cationice (sau
cationiti) sau anionice (sau anioniti).
4) Cromatografie de excludere sterica sau de excludere-
difuzie, in care faza stationara este de regula un gel, care
se comporta ca o sita moleculara fixand anumite molecule
si eliminand altele in functie de marimea, respectiv masa
lor moleculara.
 INTRODUCERE- continuare

 Se poate face o clasificare a metodelor cromatografice si

in functie de procedeul practic utilizat si anume:
1) Cromatografie pe coloana, in care faza stationara este
plasata intr-o coloana (tub) de metal sau de sticla, sau
de silice topita.
2) Cromatografie planara sau de suprafata pe hartie sau
pe strat subtire.
 CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

 In functie de migrarea fazei mobile se disting:

1) Cromatografia prin developare in care analitii raman
pe faza stationara sau sunt localizati pe aceasta in
functie de directia de migrare; exista developare
ascendenta sau descendenta, monodimensionala sau
bidimensionala (migrari in directii perpendiculare).
2) Cromatografia de elutie, in care analitii sunt eluati
pana la iesirea lor completa din coloana, deci din faza
stationara, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor
de analiti; in acest caz detectia se face in efluenti.
 BAZELE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI

 Exista o serie de notiuni teoretice general valabile ,

referitoare la procesele de separare cromatografica,
notiuni care se pot transforma (adapta) tuturor metodelor
cromatografice.
 Daca se analizeaza un amestec de analiti (diferiti) care
trebuie sa fie separati (acesta fiind scopul principal al
cromatografiei) indiferent de tehnica aleasa, metodele au
urmatoarele aspecte comune:
a) analitii din amestec se repartizeaza intre faza stationara
si faza mobila, care sunt nemiscibile (sau foarte putin
solubile una in alta); intre cantitatile de analiti repartizati
 BAZELE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI

in cele doua faze exista un echilibru ce depinde de

insusirile fiecarui analit fata de cele doua faze.
b) adaugand continuu faza mobila “noua sau proaspata”
are loc deplasarea echilibrului de repartitie, antrenand
migrarea analitilor de-a lungul fazei stationare, cu viteze
diferite.
c) separarea consta in eluarea continua a analitilor care
migrand cu viteza caracteristica fiecaruia, parasesc
succesiv coloana.
 FAZA STATIONARA

 Este formata din particule fine solide, sferice (sau aproape sferice) pe
suprafata carora se produc interactiile cu analitii (ex. In cromatografia de
adsorbtie);
 Este formata din particule fine solide, care sunt suportul pe care se
fixeaza faza stationara lichida ca in cromatografia de repartitie;
 In coloanele capilare utilizate in cromatografia de gaze, faza stationara
este fixata in stare omogena, sub forma unui film (pelicula) pe peretii
interiori ai acestora;
 Particulele de faza stationarase caracterizeaza prin cativa parametri
intre care diametrul lor mediu, omogenitatea marimii lor si suprafata
specifica.
APLICATIILE METODELOR CROMATOGRAFICE

Metodele cromatografice au devenit in prezent unele

dintre cele mai selective metode de separare cu
larga aplicabilitate in toate domeniile analizei.
Cromatografia are aplicatii largi in analiza calitativa
care inseamna separare si identificare.
Cromatografia are aplicatii importante si in analiza
cantitativa.
 CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA

 Sub aceasta denumire sunt descrise principalele metode

moderne de analiza cromatografica bazate pe repartitia lichid-
lichid, pe adsorbtia lichid-solid, pe schimbatori de ioni si pe
procesele de excludere-difuzie.
 Cromatografia de lichide de inalta performanta se poate practica
pe coloana sau pe o suprafata plana, de exemplu pe straturi
subtiri de faza stationara, de unde si denumirea de
cromatografie planara. Aceasta tehnica se noteaza prescurtat
TLC (thin layer chromatography), iar tehnica de inalta
performanta HPTLC (high performance thin layer
chromatography).
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA

 In cromatografia de lichide de inalta performanta sunt

necesare presiuni mari de cateva sute de atmosfere
pentru a asigura debite corespunzatoare ale fazei mobile,
avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC
este mica, diametrul particulelor fiind de 3-10 μm; din
acest motiv aparatura utilizata este mai complicata si deci
mai scumpa.
 CROMATOGRAFIA HPLC PE COLOANA

 Este tehnica cea mai utilizata in prezent pentru

separari, detectii si mai ales pentru determinari
cantitative.
 In cadrul acestei metode se inscriu:
Cromatografia HPLC de adsorbtie
Cromatografia HPLC de repartitie
 CROMATOGRAFIA HPLC DE ADSORBTIE

 Aceasta tehnica se practica pe faze stationare de silicagel si

alumina (singurele care se utilizeaza in aceasta tehnica). Dintre
aceste doua faze stationare se utilizeaza mai ales silicagelul
deoarece poate fi folosit intr-o varietate mai mare de conditionare.
 Ca faza mobila se utilizeaza un solvent organic sau un amestec de
2 sau mai multi astfel de solventi.
 Cromatografia HPLC de adsorbtie se aplica la separarea unor
substante organice relativ nepolare datorita capacitatii metodei de a
fractiona amestecul de izomeri de pozitie. (ex. Derivatii disubstituiti
in meta si para ai nucleului aromatic).
 CROMATOGRAFIA HPLC DE REPARTITIE

 Este cea mai utilizata dintre tehnicile cromatografice in faza lichida si se

poate practica sub forma cromatografiei HPLC lichid-lichid si HPLC lichid-
faza grefata (legata).
 In cromatografia HPLC de repartitie se disting doua procedee in functie de
polaritatea fazelor stationara si mobila:
1) Cromatografia pe “faza stationara normala“, foarte polara; ca faza mobila
se utilizeaza un solvent practic nepolar (sau foarte slab polar).
2) Cromatografia pe “faza inversa” in care faza stationara este nepolara, iar
faza mobila este relativ polara.
CROMATOGRAFIA HPLC DE REPARTITIE- continuare

 Regula de alegere a fazei mobile pentru cromatografia de

repartitie este urmatoarea:
- faza mobila trebuie sa aiba o putere mare de dizolvare dar
sa nu interactioneze chimic cu analitii din probe (deci sa fie
inerta fata de acestia);
- sa fie compatibila cu sistemul de detectie;
- sa nu dizolve faza stationara si sa nu interactioneze chimic
cu aceasta (deci sa fie inerta chimic fata de ea).
 CROMATOGRAFIA HPLC DE REPARTITIE-
continuare

• In cromatografia pe faza inversa, faza stationara este

nepolara, iar faza mobila este polara, fiinf formata din apa,
metanol, acetonitril sau din amestecuri in diferite proportii
ale acestora.
 Introducere in CSS

 Rezultatele spectaculoase
obţinute în domeniul chimiei
în ultimele decenii, atât în
cadrul cercetării cât şi al
multiplelor şi variatelor
aplicaţii ale acesteia, se
datoresc într-o măsură
considerabilă folosirii
tehnicilor experimentale şi
bagajului teoretic pe care
fizica le-a pus la dispoziţie.
 Introducere in CSS(2)
 În această direcţie aplicarea metodelor fizice
în analiza chimică, proces început de la
constituirea acesteia ca disciplină ştiinţifică,
a condus la elaborarea unor valoroase tehnici
de laborator, cu mare potenţialitate, printre
care se înscrie şi metoda cromatografică cu
diferitele sale variante.
 Cromatografia în strat subţire este una din
vechile şi din noile metode de analiză, care
alături de celelalte metode cromatografice şi
fizico-chimice în general, contribuie la
studiul şi identificarea substanţelor chimice
naturale şi de sinteză.
Generalităţi despre cromatografia în strat subţire
 Cromatografia în strat subţire = metoda fizico-chimică de
separare a substanţelor dintr-un amestec, pe baza capacităţii
deosebite de distribuţie între o fază staţionară şi una mobilă.

 Metoda cromatografică se bazează pe un proces de migrare

dinamică diferenţiată a substanţelor din amestecul respectiv ca
urmare a unor diferenţe în adsorbţie, repartiţie, solubilitate,
presiune de vapori, mărimea moleculei etc.
 Principiul cromatografiei în strat subţire

Un analit migrează în susul Compuşii amestecului sunt

repartizaţi între un adsorbant (faza
sau de-a latul unui strat de staţionară, de obicei, gel de siliciu,
fază staţionară (de obicei SiO2) şi un solvent (faza mobilă)
silicagel), sub influenţa unei care se deplasează prin faza
faze mobile (de obicei un staţionară prin efect capilar.
amestec de solvenţi organici)
care se deplasează prin faza
staţionară prin efect capilar.
Distanţa parcursă de un
analit este determinată de
afinitatea sa relativă pentru
faza staţionară versus faza
mobilă.
 Importanţa cromatografie în strat subţire în
analiza medicamentului
 Determinarea
impurităţilor în produsele
farmaceutice din materiile
prime sau produse
preparate.
 Folosită adesea ca metodă
de bază pentru verificarea
materiilor prime
farmaceutice.
 Poate fi folosită pentru
validarea curăţirii, o
treaptă în fabricarea
produselor farmaceutice.
Aparat tipic pentru cromatografia în
strat subţire
• În figură apare o
diagramă tipică a
unei plăci de
cromatografie în
strat subţire după
ce a fost
dezvoltată şi
pulverizată pentru
localizarea
analitului.
 Aparatura utilizată în C.S.S.

Aspectul plăcilor şi al spoturilor

la vizualizare: în lumină UV
(stânga); în lumină vizibilă
(dreapta)
Aparatul Linomat: aplică probele în
formă de benzi pe straturile subţiri
 
Cromatogramă C.S.S. simplă cu
silicagel ca fază staţionară

În figură
compusul A
este mai puţin
polar decât
compusul B
şi parcurge o
distanţă mai
mare o dată
cu faza
lichidă.
 Aplicaţii ale cromatografiei în analiza
medicamentului
Cromatografia în strat subţire (C.S.S.) a
devenit o tehnică foarte sofisticată
pentru identificarea compuşilor şi pentru
determinarea prezenţei impurităţilor.
Complexitatea ei derivă din vasta gamă
de faze staţionare şi faze mobile ce pot
fi folosite cât şi din marele număr de
reactivi de pulverizare ce pot fi utilizaţi
pentru vizualizarea cromatogramei.
 Analiza calitativă

 Principala metodă de identificare

prin cromatografia pe strat subţire
constă în localizarea zonelor
diferiţilor componenţi separaţi şi
prin măsurarea valorilor Rf
corespunzătoare. Rf (o
prescurtare de la termenul din lb.
engl.: retardation factor).
Acesta se calculează astfel:
 Rf = (Distanţa parcursă de
componentul dat) / (Distanţa Valoarea Rf dată de raportul dintre
parcursă de frontul solventului). distanţa de la linia de start până în
centrul petei componentului separat şi
 Rf = b/a distanţa de la linia de start la frontul
fazei mobile
 Analiza calitativă
 Tot în scopul
realizării analizei
calitative se poate
practica şi
cromatografia
bidimensională.
Placa se
vizualizează şi se
compară cu o placă
etalon - pe care
avem un amestec
similar dar
cunoscut.

Modul de executare al cromatografiei bidimensionale

 Teste calitative de identitate
 C.S.S. se foloseşte adesea de monografiile BP ca parte
a unui număr de teste de identitate efectuate pe
substanţe pure. Pentru confirmarea suplimentară a
identităţii se folosesc mai multe sisteme de solvenţi şi
de asemeni diferite tipuri de reactivi spray.
 Compuşi a căror identitate a fost verificată prin C.S.S.
Tabelul prezintă diferite analize ale unor substanţe medicamentoase

Substanţa Faza staţionară Faza mobilă Reactivul de Comentarii

examinată vizualizare
Framitsetina sulfat Silicagel+carbome 10 % g/v KH2PO4 Naftalen-diol Valoarea Rf şi culoarea sunt
r /H2SO4 comparate cu un etalon pur.
Se
verifică rezoluţia analitului
din
streptomicină
Metilprednisolon Silicagel GF254 Eter/toluen/ Lumină UV 254 nm Sunt comparate valorile Rf şi
1-butanol saturat apoi acid sulfuric culorile probei şi ale
cu apă (85:10:5) etanolic(20%) etalonului.
+ încălzire la 1200C
Aprotinina Silicagel Tampon acetat Ninhidrină spray Rf şi culoarea spotului de
analit sunt comparate cu
etalonul.
Levamisol Silicagel H cu Toluen/acetonă Lumină UV 254 nm Rf şi demensiunea spotului
indicator 13.5 obişnut sunt comparate cu
M amoniac cele ale unui etalon.
( 60:40:1)
Pentagastrină Silicagel G Analitul este 4-dimetil- Se determină valoarea Rf a
examinat cu aminobenzaldehidă analitului în trei faze mobile
C.S.S.în trei faze în metanol/HCl diferite iar culoarea spotului
mobile diferite. se
compară cu cea a etalonului.
 Când structura impurităţii este cunoscută
Test limită C.S.S. pentru hidrocortizonul
 Un test limită se bazează pe
comparaţia între o soluţie din hidrocortizon acetat
concentrată a analitului şi o soluţie
diluată a unei impurităţi. O
cantitate mică de hidrocortizon
impuritate se poate vedea coborând
sub spotul mare produs de
hidrocortizonul acetat, care este
componenta principală a probei. În
linie cu poziţia unde a fost aplicat
spotul de hidrocortizon acetat se
observă un spot foarte mic. În acest
caz, spotul produs de impuritatea
hidrocortizonului din probă apare
mai intens (mai mare) decât spotul
produs de etalonul de
hidrocortizon 0.01% g/v şi deci
proba nu a trecut testul limită.
 Când structura impurităţii este necunoscută
Trei probe de codeină sunt analizate cum s-a
 Un tip asociat de test descris, ceea ce arată dacă testele limită de mai jos au
limită C.S.S. se face fost trecute sau ratate. Soluţiile 1-3 apar în ordine
când identitatea numerică de la stânga la dreapta.
impurităţilor nu este
pe deplin cunoscută.
Acest tip de test se
face, de exemplu, pe
compuşi de origine
naturală sau parţial
naturală care pot
conţine o gamă de
compuşi cu structuri
asociate cu a i -Trece deoarece nici un spot din cromatograma soluţiei 1 nu este
substanţei de test şi mai intens decât spotul produs de soluţia 2
care sunt co-extraşi ii -Nu trece deoarece spotul de la origine este mai intens decât cel
produs de Soluţia 2.
odată cu materialul iii -Trece deoarece deşi un spot de deasupra codeinei este mai
brut. intens decât spotul soluţiei 3, nu există nici un spot mai intens ca
cel al soluţiei 2.
 Teste în care se folosesc atât etaloane cunoscute cât şi
necunoscute
Tabelul prezintă câteva teste din monografiile farmacopeice de la teste simple pentru o
impuritate cunoscută până la teste în care limitele sunt fixate pentru mai mult de o
impuritate cunoscută plus orice impuritate necunoscută care ar putea fi prezentă.
Soluţia analit Test limită Test limită Test limită
(Soluţia 1) (Soluţia 2) (Soluţia 3) (soluţia 4)

10 % g/v Nici un spot secundar > - -

Procaină.HCl 0.005% g/v acid p-
1% g/v aminobenzoic

Cloramfenicol Nici un spot secundar > Nici un alt spot > 0.01% -
acetonidă 0.02% g/v triamcinolon g/v triamcinolon
acetonidă acetonidă.

2% g/v Niciun spot secundar > Nici un alt spot >0.01% -

Prometazină.HCl 0.02%g/v g/v prometazină.HCl
1% g/v izoprometazină.HCl

Cloramfenicol Nici un spot cu aceeaşi Nici un spot cu aceeaşi Nici un alt spot >
palmitat valoare Rf > 0.02% g/v valoare Rf > 0.02% g/v 0.005% g/v
cloramfenicol palmitat cloramfenicol dipalmitat cloramfenicol
izomer palmitat
 Aplicaţii ale HPLTC

 HPTLC pentru rifampicină

 Multe teste (R), isoniazid (I) şi pirazinamidă
farmaceutice
limită curente ar
putea fi efectuate
cu un grad mai
mare de acurateţe
dacă s-ar folosi
metodele
HPTLC.
 Sensibilitate în cromatografia în strat subţire
Tehnica C.S.S. a fost utilizată pe scară largă în domeniul
farmaceutic pentru a analiza o varietate de aplicaţii
specifice şi utile, de exemplu:
 pentru a identifica prezenţa nedorită a unor compuşi
organici, ce prezintă impurităţi într-un număr de
substanţe farmaceutice: morfină în clorhidratul de
apomorfină; hidrazină în carbidopa; 3-aminopropan în
dexampanthenol;
 substanţe înrudite prezente în medicamente oficiale, şi
anume: substanţele aferente prezente într-un număr
mare de substanţe farmaceutice: aminofilina;
 alcaloizi străini prezenţi în medicamente alcaloide:
sulfatul de atropină; codeina;
 steroizi străini prezenţi în medicamente steroidiene.
Introducere in HPLC

Cromatografia de
lichide de înaltă
performanţă (HPLC)
acoperă astăzi, în
proporţie de
aproximativ 80%,
analiza substanţelor
moleculare.
Introducere in HPLC (2)
HPLC reprezintă evoluţia unei
metode mai vechi, cromatografia
pe coloană clasică, care servea în
primul rând la izolarea
preparativă a compuşilor naturali.
Prin introducerea pompelor şi
în consecinţă, lucrându-se la
presiuni tot mai ridicate (200
atm.), dezvoltarea unor faze
staţionare performante, de
dimensiuni tot mai mici, în
coloane tot mai scurte (3-10 cm)
s-a ajuns la configuraţia actuală.
Generalități cu privire la Cromatografia
de înaltă performanță HPLC
Cromatografia de lichide de
înaltă performanță este o
metodă fizico-chimică de
separare cromatografică în
care faza mobilă este un
lichid, iar faza staţionară,
conținută într-o coloană, este
constituită dintr-un solid cu
granulație fină sau un solid
impregnat cu un lichid sau un
solid pe care sunt grefate
grupări organice.
Generalități cu privire la Cromatografia
de înaltă presiune HPLC (2)
HPLC este o metodă ce prezintă
următoarele avantaje:

Ușor de controlat cu o precizie
cantitativă asigurată prin introducerea
exactă a probei;

HPLC este tehnica cromatografică ce a
cunoscut cea mai puternică dezvoltare în
anii recenți, ducând la îmbunătățirea
coloanelor, a detectorilor și a soft-urilor
de control;
 Varietatea coloanelor și a detectorilor

face ca selectivitatea metodei să poată fi

ușor ajustată.
 Metodele cromatografice pot fi clasificate
în funcție de mai multe criterii :

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o

gamă extinsă de sisteme cromatografice care au în comun faptul că
utilizează o fază mobilă lichidă.
În funcție de mecanismele de separare:

cromatografia de lichide

cromatografia de gaze

cromatografia cu fluide supracritice


În funcție de tehnica utilizată:
 cromatogafia pe hârtie

cromatografia pe strat subţire
 cromatografia pe strat subţire de înaltă performanţă
 Cromatograma în HPLC
În orice tip de cromatografie detectorul dă un
semnal proporţional, uneori cu concentraţia, alteori cu
masa componentului aflat în celula de măsură, semnal ce
poate fi înregistrat în funcţie de timp. Diagrama semnal,
funcţie de timp sau de volumul de eluent se numeşte
cromatogramă.
 Elementele de bază ale
cromatogramei HPLC:
 Picurile cromatografice - acestea sunt semnalele
valorificabile în analiza calitativă şi cantitativă, în toate
metodele cromatografice.
 Timpul mort, tM - este timpul în care un component,
complet nereţinut de către faza staţionară, parcurge
coloana şi tuburile de legătură până la detector.
 Timpul de retenţie, tR - o mărime caracteristică pentru
fiecare component al amestecului separat de coloană -
reprezintă timpul scurs de la injectarea probei şi apariţia
maximului de concentraţie în detector.
 Elementele de bază ale
cromatogramei HPLC (2)
 Volumul de retenţie, VR este volumul de eluent
corespunzător timpului de retenţie

 Timpul de retenţie ajustat, tR'- introdus în

cromatografie pentru a se putea compara timpii
măsuraţi pe coloane diferite

 Volum de retenţie ajustat, reprezintă volumul

golurilor din coloană plus volumul tuburilor de
legătură de la coloană la detector.
PRINCIPALELE ETAPE ÎN
HPLC
APARATURA DIN CARE ESTE
ALCĂTUIT SISTEMUL HPLC

Sistem HPLC tipic,

reglat la un debit de 1
ml/min indicând o
presiune a coloanei de
1265 psi și conectat la
un detector UV/vizibil
care este reglat să
monitorizeze efluentul
coloanei la 260 nm.
Analiza tabletelor de paracetamol și aspirină
(A)Un extract de tablete
conținând paracetamol și
aspirină rulat la un pH de
3.7 în 0.05 M acetat de
sodiu/ acetonitrit (85:15)
(coloană ODS 150 nm x
4.6 nm, debit 1ml/ min).
(B) Extractul de tablete rulat
la pH 4.4 în 0.05 M acetat
de sodiu tampon/
acetonitril (85:15). Coloană
ODS 150 nm x 4.6 nm,
debit 1 ml/ min. Detecție
UV la 243 nm.
Analiza cremei cu hidrocortizon față de un
etalon intern
Cromatograma în urma
analizei cremei cu
hidrocortizon folosindu-se
betametazonă ca standard
intern pe o coloană ODS (25
cm x 4.6 nm) cu metanol/ apă
(70:30) ca fază mobilă.

(A) Etalonul de calibrare (Soluția 1)

(B) Extract de cremă + etalonul
intern(Soluția 3)
(C) Extract de cremă fără adăugare
de etalon intern (Soluția 2).
 Cromatografia de lichide de
înaltă performanță, grupează o
variată și importantă gamă de
metode care permit
cercetătorului să separe compuși
foarte asemănători din
amestecuri complexe.
Cromatografia HPLC este o
tehnică de un uriaș potențial și
care are avantajul că furnizează
atât informații calitative cât și
cantitative.
 Majoritatea aplicațiilor HPLC sunt folosite
în analizele farmaceutice pentru determinarea
calitativă și cantitativă a substanțelor utilizate
în formulări. Cu astfel de analize nu se pierde
mult timp pentru pregătirea fazelor mobile și
selecționarea coloanelor sau a detectorilor
potriviți în cazul amestecurilor complexe.
• Unele dintre cele mai dificile şi frustrante probleme în
domeniul analizei medicamentului sunt de separare
simultană, identificare şi mai presus de toate analiză
cantitativă a uneia sau mai multor substanţe dintr-un
amestec complex al unui produs farmaceutic.
• Creşterea exponenţială a cromatografiei de
gaze poate fi atribuită potenţialului
incomparabil de a soluţiona problema
separării componentelor dintr-un amestec
complex.
• Cromatografia de gaze este o metodă fizico-chimică de
separare cromatografică în care faza mobilă este un gaz (gaz
purtător), iar faza staţionară este un solid sau un lichid cu care
este impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat
uniform pe pereţii unei coloane capilare.
• Faza staţionară se află într-o coloană cromatografică,
confecţionată, de obicei, din sticlă sau din oţel inoxidabil.
• Faza mobilă se deplasează continuu prin coloană, iar la ieşire,
gazul-purtător trece prin detector.
• Constă în distribuţia inegală a componentelor unui amestec între
faza mobilă şi faza staţionară.
• Amestecul străbate sistemul cromatografic, fiind antrenat de către
faza mobilă.
• sunt introduse în coloană prin injectare cu microseringi,
după ce au fost dizolvate într-un solvent adecvat.
• Reprezentarea grafică a semnalului detectorilor în funcţie
de timp, obţinută cu ajutorul înregistratorului, se numeşte
cromatogramă
• Timp de retenţie, tR este timpul la care apare maxiumul
unui pic, măsurat din momentul introducerii probei, şi
constituie caracteristica calitativă a componentului
respectiv.
• Înălţimea picului, h, sau aria suprafeţei lui, A, constituie
parametrul cantitativ, proporţional cu cantitatea de
component.
• tM este timpul în care eluentul şi componentele care nu
interacţionează cu faza staţionară parcurg distanţa până
la detector.
• caracterizarea uleiurilor volatile (care pot fi folosite ca excipienți în
formulări), brevetarea amestecurilor complexe pentru tuse, a
tonicelor și a acizilor grași în uleiurile stabile,
• teste de limită pentru reziduri de solvent și alte impurități volatile în
substanțele medicamentoase,
• caracterizarea unor medicamente neformulate în particular în ceea
ce priveşte procesul de detectare a impurităţilor,
• cuantificarea medicamentelor în formulări, în particular dacă
medicamentul nu are un cromofor.
• Primele analize de medicamente au început cu steroizii
anabolizanţi.
• Folosirea abuzivă a medicamentelor analgezice, narcotice şi
halucinante a impus analiza lor calitativă şi cantitativă într-un timp
cât mai scurt, pentru a putea interveni la timp cu antidotul cel mai
potrivit.
• O categorie importantă de medicamente o reprezintă substanţele
folosite în tratarea bolilor vasculare. Pentru clonidină, detectorul cu
captură de electroni a permis măsurarea unei concentraţii de 100
pg clonidină într-un ml de plasmă.
• O aplicație tipică a GC în analiza unui medicament în
plasmă este determinarea medicamentului antiepileptic
acid valproic după extragerea fazei solide prin GC cu
ionizare cu flacără.
• În această procedură s-a folosit ca etalon intern acid
caprilic care este izomeric cu acidul valproic.
• Picăturile oculare cu atropină sunt folosite pentru
a dilata pupila înainte de operațiile de cataractă.
• Metoda implică extragerea atropinei și a unui
etalon intern de homatropină din faza apoasă.
• Dimetilanilina este atât o impuritate de fabricație
în bupivacaină cât și un posibil produs de
descompunere în soluţiile injectabile.
 Atât cromatografia de gaze cât şi spectrometria de masă sunt
tehnici analitice de mare utilitate pentru analiza compuşilor
organici.

 Combinarea lor într-un

singur sistem duce la
obţinerea unor rezultate
care depăşesc mult ceea
ce s-ar realiza prin
simpla însumare a
datelor oferite de cele
două tehnici.
• fixarea spectrometrului de masă la o anumită valoare m/z
caracteristică doar pentru o anumită componentă care ne
interesează, el funcţionând în acest caz ca un detector
foarte specific,
• parcurgerea (scanarea) întregului domeniu de masă într-
un interval de timp redus, ceea ce înseamnă că se obţin
sute sau chiar mii de spectre pentru fiecare analiză. Toate
aceste spectre sunt stocate în memoria calculatorului
ataşat instrumentului.
• o metodă de mare utilitate în
diagnosticarea, urmărirea evoluţiei şi
tratamentului unor boli, în special
determinând constituenţii volatili de masă
moleculară mică ai fluidelor biologice
(metaboliţi biologici volatili din urină, ser,
plasmă şi fluid cerebrospinal).
• Cromatografia de gaze cu coloane capilare s-a dovedit a fi
foarte folositoare în identificarea şi dozarea rapidă a
medicamentelor din ţesuturi şi lichide biologice.
• Cromatografia gaz-lichid, numită de multe ori şi
cromatografie în fază gazoasă, se foloseşte pentru
separarea de substanţe volatile.
• Având acest domeniu larg de aplicaţii, cromatografia de
gaze şi vapori a înlocuit multe metode chimice şi fizico-
chimice de analiză. Pe lângă aspectele analitice (identificări,
dozări, controlul purităţii unor substanţe, caracterizări
diverse), metoda se poate aplica şi în scopul preparării unor
componenţi de înaltă puritate (cromatografic puri).
Avantajele acestei tehnici:
• timpul de analiză redus,
• specificitatate,
• procedee simple de izolare a probelor.
Limitările acestei tehnici:
• pot fi analizați doar compuși stabili termic și volatili,
• proba poate să necesite derivatizarea pentru a fi transformată într-o
formă volatilă,
• introducerea unei probe cantitative este mai dificilă datorită volumului
mic a probei injectate,
• soluțiile apoase și saline nu pot fi injectate în instrument.