Metode cromatografice

Prezentare general
Curs 12 - 13

OBIECTIVE GENERALE
Prezentarea principiilor fundamentale
ale metodelor cromatografice
Prezentarea generala a tipurilor de
metode cromatografice:
CSS
GC
HPLC

Principii fundamentale

Cromatografia reprezint un set de

metode analitice care s-au dezvoltat
iniial ca i tehnici de separare.

Principii fundamentale
n toate variantele, separarea precede
analiza (calitativ i cantitativ a
compuilor separai)
separarea se realizeaz prin repetarea, de
un numr mare de ori, a echilibrului de
distribuie ntre dou faze:
faz staionar (fixa) aflata ntr-un tub numit
coloan sau in plan
faza mobil (eluent) - aflat n micare, se
deplaseaz prin golurile primei faze.
4

Analiza chimic cromatografic

1901, botanistul rus
Tvet a separat pigmenti
vegetali pe o coloana
umpluta cu carbonat de
calciu, eluent eterul de
petrol.

chromos = culoare,
graphos = scriere

Clasificarea metodelor cromatografice

Criterii diferite:
A - Clasificarea n functie de mecanismul separarii
B - Clasificarea n functie de natura fazelor cromatografice
C - Clasificarea n functie de configuratia sistemului
cromatografic

A-

Clasificarea n functie de mecanismul separarii

Cromatografie de adsorbtie
Cromatografie de repartitie
Cromatografie de schimb ionic
Cromatografie de excluziune

1.
2.
3.
4.

B - Clasificarea n functie de natura fazelor

cromatografice
Faza mobila:
gazoasa
lichida.

Faza stationara:
Solida
lichida -care trebuie fixata pe un suport solid
corespunzator, n general un material poros

Tipuri de metode cromatografice in

functie de natura fazelor
1. Cromatografie de gaze
1.1.
1.2.

Gaz-lichid (GLC)
Gaz-solid (GSC)

2. Cromatografie de lichide
2.1.
2.2.

Lichid-lichid (LLC)
Lichid-solid (LSC)

ACTIVITATE INDEPENDENTA
Denumiti faza mobila si fixa ale
metodelor mentionate pe slide-ul
anterior

10

C - Clasificarea n functie de configuratia

sistemului cromatografic
1. Cromatografie pe coloana - faza fixa este
depusa intr-o coloana verticala
1.1. Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutura)
1.2. Cromatografie pe coloane capilare
OBS: Diametru coloana 1.1 >>>> 1.2

2. Cromatografie planara - faza fixa este depusa

pe o suprafata plana)
2.1.
2.2.

Cromatografie n strat subtire

Cromatografie pe hrtie

11

FAZELE procedeelor cromatografice

Procedeele cromatografice includ urmtoarele faze, indiferent de tipul
metodei:

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

prepararea fazei staionare (in coloana sau pe placa)

introducerea probei
trecerea probei (dizolvata sau sub forma de gaz) peste
faza staionar
separarea componentelor pe faza stationara
colectarea componenilor amestecului prin eluare
(preluare) cu solventi (gaz sau lichid) potriviti
analiza calitativ
analiza cantitativ

12

Schema de principiu a unui cromatograf

13

14

Dinamica procesului cromatografic

15

 Faza solid este introdus ntr-un tub cilindric nchis la

partea de jos printr-un dop de vat de sticl sau un disc
poros.
La partea superioar se introduce proba (Muestra) care
conine doi compui A i B dizolvani ntr-o cantitate ct
mai mic de solvent (momentul t0).
ncepe introducerea fazei mobile (Fase movil) i cei doi
componeni migreaz diferit n coloan (momentele t1i t2)
Momentul t3 corespunztor elurii compusului A se
nregistraz pe cromatogram prin apariia unui pic bine
definit de forma clopotului lui Gauss.
n continuare elueaz n acelai mod i compusul B n
momentul t4.

16

http://www.forumsci.co.il/HPLC/modes/modes2.htm
17

Diagrama care reprezinta rezultatul analizei cromatografice se

numeste cromatograma
este un semnal, funcie de timp sau de volumul de eluent

18

Elemente de baz ale cromatogramei

1. Picurile cromatografice
2. Timpul de retenie, tR - mrime caracteristic pentru fiecare
component al amestecului separat de coloan
3. h inaltimea picului
4. A aria picului
19

Analiza calitativa/cantitativ in cromatografie:

Se poate realiza prin dou tipuri de metode:

Se colecteaz fiecare component n vase separate,

dup care fiecare fraciune se analizeaz prin
procedee chimice sau instrumentale adecvate (in
prezent utilizata numai pentru preparare/purificare
probe);
en.wikipedia.org
1.

20

2. analiza are loc direct in cromatograf,

utilizandu-se tehnici si detectori
specifici utilizata in practica
analitica actuala

21

Prezentarea principalelor tehnici

cromatografice utilizate la control alimente

1. Cromatografie n strat subire (CSS)

2. Cromatografie de gaz (CG)
3. Cromatografie de lichide (CL)
22

Cromatografia in strat subtire CSS

Thin Layer Chromatography TLC
Principiul metodei:
Separarea se bazeaza pe distributia
componentelor probei intre doua faze:
Faza fixa strat subtire de material solid
depus pe un suport plan
Faza mobila lichida (singular sau amestecuri)

23

Faza fixa
Silicagel
Oxid de aluminiu
Kieselgur
Faza mobila
Amestecuri de solventi in proportii si
concentratii variabile

24

Avantaje :
Rapiditate
Cost redus
Aplicabilitate la compui care prezint instabilitate
termic, att hidrosolubili ct i liposolubili
Posibilitatea analizrii simultane a mai multor probe
Reproductibilitatea rezultatelor
Dezavantaje:
Sensibilitate (n general) mai mic dect n
cromatografia de gaz sau lichid
Necesitatea unei purificri mai avansate
Repetabilitate sczut n cazul unor temperaturi sau
umiditi ambientale ridicate (risc sczut n condiiile
climatice din ara noastr)
25

Etape
Aplicarea probei (spotare)
Developare
Relevarea componentelor amestecului
Determinare calitativa
Determinare cantitativa

26

Mod de lucru

Se folosesc plci de sticl de

diferite dimensiuni, ( 20 x 20
cm,) pe care se depune un
strat uniform de absorbant cu
grosime de aproximativ 250
m.(faza staionar)

1.

Spotare (spot=pata) - la o
distan de circa 1,5 cm de
marginea plcii se aplic o
cantitate foarte mic de
amestec al substanelor ce
urmeaz a fi separate
microseringi
http://www.virtual-labs.leeds.ac.uk/brewing/TLCtheory.php

www.hamiltoncompany.com
27

 Developare: se imerseaz placa ntr-un vas cu nchidere etan

n care atmosfera este saturat de vapori ai solventului sau ai
amestecului de solveni utilizai pentru separare (faza mobil).
In acest mod are loc un proces de migrare al componenilor
fazei mobile printre particolele fazei staionare.
Componentele amestecului migreaz diferit, n funcie de modul
lor de distribuie ntre cele dou faze.

http://www.reachdevices.com/TLC.html

28

 Identificare - atunci cnd frontul

developantului ajunge la extremitatea plcii,
aceasta se scoate, se usuc i se trece la
faza de identificare

http://www.bio-rad.com/en-za/applications-technologies/chromatography
29

TLC - Automatizare

http://www.camag.com/en/home.cfm

30

Determinarea calitativa
1.

Prin reactii chimice specifice, direct pe placa

2.

Prin valoarea Rf (retardation factor) masoara viteza de deplasare

pe placa a componentelor fata de frontul developantului

Rf valori 0 - 1
Etaloane !!!!

Rf = Xspot/Xsolvent

31

www.microbialcellfactories.com

http://webapps.utsc.utoronto.ca/chemistryonline/tlc.html

32

Determinarea cantitativa
1.

Direct pe placa
1. Metoda compararii vizuale semicantitativa
2. Metoda densitometrica

2.

Dupa elutia substantei din adsorbant

1. Spectrofotometrie UV
2. Colorimetrie
3. GC

33

ACTIVITATE INDEPENDENTA
Dati ex de determinare cromatografica
de tip CSS pe care ati aplicat-o pana in
prezent

34

Metoda gaz cromatografic

Gas chromatography
(GC)
Principiul metodei
1 Substana sau amestecul de substane ce
trebuie determinate sunt trecute prin injectare,
ntr-o coloan ce conine o faz staionar (fixa)
i unde se nclzesc la o anumit temperatur,
trec in faza gazoasa si se retin in mod selectiv
de catre faza fixa.

35

2- Ulterior prin coloan se trece un gaz care reprezint faza

mobil i care va elua componentele amestecului
3 -la ieirea din coloan este amplasat un detector care
nregistreaz apariia substanelor sub forma unor picuri ce
formeaz cromatograma.

36

Faza mobil gaz

hidrogenul, heliul, azotul sau argonul

Faza fixa
DPDV al starii de agregare, fazele stationare
sunt:
Solide :silicagel, alumin
Lichide (adsorbite pe substrat solid)

37

38

Coloane cromatografice
coloane cu umplutur
coloane capilare cele mai eficiente

http://people.whitman.edu/~dunnivfm/C_MS_Ebook/CH2/2_3_3.html

39

Introducerea probelor
microseringi, volumul probei fiind ntre 1 i 5 l la
coloanele cu umplutur i de 0,1 pn la 2 l la cele
capilare

http://www.chromacademy.com/gc_troubleshooting_column_detector_issues_Essential_Guide.ht

40

 Detectori CG
1. detector
universal
care permit
nregistrarea
sigur
a
tuturor
componenilor probei
Ex:Detectorul cu ionizare n flacara
(FID)
2. detectori specifici, care rspund doar
la anumite tipuri de molecule
Ex: Detectorul cu captura de
electroni (ECD)
41

Analiza cromatografica
Analiza calitativa pe baza compararii timpilor
de retentie inregistrati pentru compusii din
proba si pentru etaloane cunoscute
Analiza cantitativa se calculeaza pe baza
ariei cuprinse sub fiecare pic cromatografic
(sau inaltimea picului) care este proporional
cu concentraia compusului respectiv

42

43

Metoda cromatografiei de lichide

Liquid chromatography (LC)
Termenul de cromatografie de lichide se
refera la o gama extinsa de sisteme
cromatografice care au n comun
faptul ca utilizeaza o faza mobila
lichida.

44

Avantaje (fata de GC)

permite analizarea probelor
volatile sau instabile termic

greu

faza mobila participa activ la

separare

ofera
posibilitati
suplimentare pentru realizarea unor
separari eficiente

45

Principiul metodei
- este analog cu cel de la GC cu deosebirea c faza
mobil este lichid.
Substana sau amestecul de substane ce trebuie
determinate sunt trecute sub form lichida, prin
injectare, ntr-o coloan ce conine o faz staionar
(fixa).
Ulterior prin coloan se trece un lichid sau amestec
de lichide care reprezint faza mobil i care va elua
pe rand componentele amestecului.

46

Tehnici ale cromatografiei de lichide

cromatografia de adsorbtie lichid-solid
(LSC)
cromatografia de repartitie lichid-lichid
(LLC)
cromatografia ionica (IC)
cromatografia prin excluziune (SEC)
47

48

Detectoare utilizate n LC

Clasificarea detectoarelor se poate face n doua

categorii
A - Detectoare care masoara modificarea unei
proprietati fizice a efluentului coloanei
Ex: detectoarele de indice de refractie

B - Detectoare care masoara modificarea unei

proprietati a solutului
Ex: detectoarele spectrofotometrice
49

Analiza LC ca si la GC
Analiza calitativa pe baza compararii
timpilor de retentie inregistrati pentru
compusii din proba si pentru etaloane
cunoscute
Analiza cantitativa pe baza compararii
ariilor pentru compusii identificati pozitiv din
proba cu aria unor etaloane de concentratii
cunoscute
50

LC - Exemple

www.springerimages.com
51

research.cens.ucla.edu -

www.shimadzu.com

52

ACTIVITATE INDEPENDENTA
Ce este compusul Natamycin
detectat cromatografic in ex de pe
slide-ul anterior?

53

Aplicatii ale metodelor cromatografice

Componenti majori: glucide, lipide, aminoacizi
Componenti minori: enzime, vitamine,
antioxidanti naturali
Substante adaugate (adugate): coloranti,
antioxidanti, conservati
Contaminanti alimentari organici: pesticide,
micotoxine, dioxine, etc

54

55

CONCLUZII
1. Metodele cromatografice sunt tehnici de separare urmate
de determinari calitative/cantitative
2. Cel mai adesea se clasifica in functie de natura fazelor
cromatografice
3. Fazele procesului cromatografic sunt aceleasi indiferent de
tehnica aplicata
4. Rezultatul determinarii se numeste cromatograma si ea este
compusa dintr-o succesiune de picuri caracterizate de Tr,
inaltime si arie
5. Cele mai utilizate tehnici cromatografice sunt:
1. Cromatografia in strat subtire TLC
2. Cromatografia de gaze GC
3. Cromatografia de lichide LC
56

6.

Detectarea compusilor separai se face n mod

specific, n funcie de proprietile acestora

7.

In toate tehnicile cromatografice

1.
2.

8.

Determinarile calitative se bazeaza pe compararea

timpilor de retentie ale etaloanelor cu cele din probe
Determinarile cantitative se bazeaza pe compararea
ariilor (Inlimii) picurilor identificate n prob cu cele
ale unor etaloane de concentraie cunoscut

Tehnicile cromatografice au aplicaii complexe

n domeniul alimentelor

57

Test de autoverificare
1.

Ce reprezint cromatografia (n general)?

2.

Cum se realizeaz un proces cromatografic (n general)?

3.

Care sunt criteriile dup care se clasific metodele

cromatografice?

4.

Clasificai metodele cromatografice dpdv al

mecanismului de separare/natura fazelor cromatografice/
configuratia sistemului cromatografic

5.

Dai minim cte doua ex de aplicare a CSS/CG/LC n

domeniul controlului alimentelor

6.

Care sunt fazele oricrui proces cromatografic?

58

7. Cum se numete rezultatul unei determinri

cromatografice?
8. Ce caracterizeaz o cromatogram (elemente de
baz)?
9. Care este faza fix i cea mobil la CSS (TLC)?
10.Enumerai minim 3 avantaje/dezavantaje ale tehnicii
CSS
11.Care sunt etapele unei determinri de tip CSS?
12.Pe ce se bazeaz determinarea calitativa/cantitativ n
determinrile CSS?
13.Care este faza fix i cea mobil la CG?
14.Care este principiul determinarii CG?
59

15.Pe ce se bazeaz determinarea calitativa/cantitativ n

determinrile cromatografice de gaze?
16.Care este deosebirea fundamental ntre tehnicile
cromatografice de lichide i cea de gaze?
17.Care sunt avantajele cromatografiei de lichide fa de
cea de gaze?
18.Care este principiul de funcionare al tehnicilor
cromatografice de lichide?
19.Enumerai tehnici ale cromatografiei de lichide.
20.Pe ce se bazeaz determinarea calitativa/cantitativ n
determinrile cromatografice de lichide?

60