Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1
Detectorul generează un semnal electric de fond în timpul în care numai
eluentul părăseşte coloana, dar produce un semnal cu totul diferit în momentul în
care, împreună cu eluentul, soseşte o componentă a probei. Semnalul electric este
prelucrat (amplificat, modulat, filtrat), iar datele digitalizate sunt transmise spre
sistemul de prelucrare computerizată.
Pompa permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întregul
sistem al cromatografului de lichide: injector, coloană, detector. Pompa permite
creșterea apreciabilă a vitezei de separare în injector, coloană și detector.
Cromatograful de lichide este dotat cu una sau mai multe pompe. Fiecare din
acestea furnizează o presiune de circa 20000 kPa sau mai mare. Această presiune
ridicată este necesară pentru a învinge rezistența la curgere opusă de umplutura cu
finețe mare. În absența presiunii aplicate , debitul efluentului ar fi foarte mic, iar
separarea cormatografică ar dura prea mult. Pompele pot fi cu presiune constantă și
pompe cu debit constant și funcționează într-un mediu coroziv, fiind construite din
materiale rezistente la coroziune (teflon, safir, agat).
Pompele cu presiune constantă sunt simple, relativ ieftine și nu prezintă
pulsații în funcționare. Pulsațiile sunt nedorite deoarece împiedică obținerea unei
linii de bază netede. Aceste pompe au ca dezavantaj, faptul că debitul trebuie
modificat frecvent pentru a se menține cât mai constant. În cazul separărilor de
lungă durată apar probleme deoarece în cursul funcționării cromatografului, are loc
obturarea coloanelor ceea ce duce la scăderea debitului. Orice modificare de debit,
datorită vâscozității sau temperaturii eluentului și a structurii umpluturii afectează
timpul de retenție, și semnalul detectorilor, care sunt sensibili la concentrație.
Pompele cu debit constant pot să fie cu piston sau de tip seringă. Pompele
cu piston sunt cele mai utilizate, mișcarea oscilatorie a pistoanelor și a supapelor
permit o funcționare continuă, dar necesită dotarea cu dispozitive de atenuare
pulsațiilor care să elimine variațiile de debit de mică amploare. Pompele cu
presiune constantă sunt asemănătoare cu seringile, dar au capacitate mai mare. Ele
pompează continuu pe toată durata separării. Pistonul se deplasează cu o viteză
liniară constantă, dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului și
reumplerea cu solvent a corpului pompei.
Introducerea probei trebuie facută foarte rapid, pentru a nu perturba
regimul dinamic al eluentului prin coloană și detector având în vedere presiunea
ridicată de lucru. Cel mai utilizat sistem de introducere a probei este ventilul cu 6
căi, numit și ventil de introducere a probei, prevăzut cu bucle interschimbabile (fig.
2.27). Ventilul cu 6 căi funcționează în 2 etape
etapa A: introducerea probei în ventil cu ajutorul unei seringi;
2
etape B: comutarea ventilului pe analiză când are loc rotirea cu 60° în sensul
acelor de ceasornic și antrenarea probei din buclă în coloană.
Eluentul aderă la pereți, iar pentru completa îndepărtare a sa în momentul
alimentării buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel
puțin 3 ori volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Ventilele sunt
confecționate din materiale rezistente la coroziune (oțel,tantal,teflon).
Fig. 2.27. Ventilul pentru introducerea probei lucrează în două etape: A - alimentarea buclei cu proba;
B -după o rotire cu 60° în sensul acelor de ceasornic,are loc antrenarea probei din buclă în coloană.
3
Fig. 2.28. Coloane HPLC de diferite dimensiuni
Mecanisme de separare în cromatografia de lichide
Separarea prin cromatografia de lichide are loc prin diferite mecanisme în
funcție de faza mobilă și staționară din coloană și de natura fenomenului fizico-
chimic.
În funcție de compușii ce urmează să fie separați prin cromatografia de
lichide (masa moleculară, polaritatea) mecanismul se alege cu ajutorul schemei din
figura 2.29.
4
Figura 2.28. Mecanisme de separare în cromatografia de lichide
6
Fig. 2.29. Schema de principiu a unui detector refractometric cu deflexie
7
Fig 2.31. Schema unui cromatograf care foloseste un detector spectrofotometric
8
Fig 2.33. Principiul de funcționare a detectorului conductometric
9
Fig 2.35. Principiul de funcționare a detectorului amperometric
10
inversă) și detecție prin metode electrochimice (variația de conductivitate), detecție
refractometrică sau analiza postcoloană, analiza vitaminei E (cu faza normală sau
inversă). Detecția se realizează electrochimic, cu fluoresență sau UV.
Analiza amino-acizilor se face prin cromatografia de schimb ionic, în fază
inversă. Pentru detecție se face o derivativare înainte sau după coloana de separare
(pre sau post derivatizare cu reactivi specifici care se atașează de grupele amino
formând compuși fluorescenți).
Determinarea compoziției în aminoacizi și a proporţiei aminoacizilor
esenţiali din proteine (după hidroliză) este importantă pentru evaluarea calităţilor
nutriţionale ale proteinelor din diverse alimente. Prin HPLC se poate determina
compoziția lipidelor, respectiv natura și concentrația acizilor grași saturați și
nesaturați din uleiuri și grăsimi de origine animală. De asemenea prin HPLC se pot
determina componenţii minori şi metaboliţii din alimente: coloranţii din sucurile de
fructe sau vin, diacetilul din unt, flavonoidele din sucurile de fructe, antioxidanţii
din vegetale etc.
Pesticidele din alimente
sunt analizate pe fază normală
sau inversată, și detectate prin
UV, fluorescență sau
spectrometrie de masă. În cazul
micotoxinelor, separarea se
realizează prin cromatografică de
afinitate. În acest caz, procesul de
separare se bazează pe
interacțiunea specifică și
reversibilă dintre moleculele
alfate în faza mobilă
(micotoxine) și un ligand
imobilizat pe suprafața fazei
staționare.
Se observă modificarea
compoziției prin conservare din
analiza cromatografică aplicată la Fig 2.37.Cromatograma morcovilor proaspeți (a)
extractele de morcovi proaspeți și și conservați (b) obținută prin HPLC
conservați. Astfel cromatograma
obținută (fig 2.37) prin HPLC cu fază inversă la analiza izomerilor de structură ai
carotenilor din morcovii proaspeți și cei conservați indică modificarea compoziției
de caroteni prin conservare; picul 7 corespunde la α caroten, iar picul 9 la β
11
caroten, în timp ce picurile 1-6, 8 și 10 sunt date de alți izomeri de structură ai
carotenilor.
Curcumina, este un colorant alimentar și antioxidant natural, de culoare
galbenă, iar puritatea și concentrația de component activ și de compuși înrudiți se
poate analiza prin HPLC pe o coloana cu silicagel modificat C18, cu detecție în
vizibil (la λ=420nm), eluție izocratică cu amestec 4:6 tetrahidrofuran: soluție
apoasă de acid citric 1 g/L. Cromatograma este prezentată în figura 2.38 .
12
Bibliografie
13
17. Dumitru C., Metode și tehnici de control ale produselor alimentare și de
alimentație publică, Ed. Ceres, 1985.
18. Dymat T.C., Atomic Absorption with Electrothermal Atomisation, Pye
Unicam Ltd., 1981
19. Fifield F.W., Kealey D., Analytical Chemistry, Great Britain by Bell and
Bain Ltd., Glasgow, 1983.
20. Gocan S., Cromatografia de înaltă performanţă p I-a Cromatografia de Gaze,
Ed. Dacia Cluj –Napoca,1998
21. Gocan S., Cromatografie de Înaltă Performanţă, p. II-a, Cromatografia de
Lichide pe Coloană, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2002.
22. Grob R.L., Barry E.F., Modern practice of Gas Chromatography, Fourth
Edition, John Wiley & Sons INC, New Jersey, 2004.
23. Gross J.H., Mass Spectrometry A Textbook, Springer Verlag, Berlin, 2004
24. Guide to Solide Phase Extraction, Supleco Bulletin 910
25. Jäntschi L., Naşcu H.I., Chimie analitică și instrumentală, Ed. Academic Pres
& AcademicDirect, 2009.
26. Jäntschi L., Bolboacă S., Analiză Chimică și Instrumentală Aplicată, Ed.
AcademicDirect, 2009.
27. Julean I, Rotărescu A., Chimie analitică, Editura Mirton Timișoara, 1997.
28. Hamilton R.J, Sewell P.A, Introduction to high performance liquid
chromatography, Great Britain by J.W.Arrowsmith Ltd, Bristol, 1982.
29. Lazǎr M.I., Lazǎr D., Corciovǎ A., Analiza medicamentelor, Editura PIM Iași,
2008.
30. Lee M.S., LC/MS applications in drug development, John Wiley & Sons Inc.,
2002
31. Snyder L.R., Kirkland J. J., Dolan J.W., Introduction to Modern Liquid
Chromatography, Third Edition,
32. Luca C., Duca Al, Crișan I. Al., Chimie analitică și analiză instrumentală, Ed.
Didactică și pedagogică, București, 1983.
33. Lundanes E., Reubsaet L., Greibrokk T., Chromatography: Basic Principles,
Sample Preparations and Related Methods, Wiley VCH, 2016
34. Meier P.C., Zund R.e., Statistical Methods in Analytical Chemistry, John
Wiley 7 Sons, New York, 2000.
35. Medvedovici A., Tache F., Noţiuni fundamentale şi mărimi caracteristice in
cromatografie, Ed. Universităţii Bucureşti, 1997
36. Moldovan Z., Metode Instrumentale de analiză, Editura Universității
București, 2001
14
37. Mondello L., Lewis A,C., Bartle K.D., Multidimensional Chromatography,
John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, 2002.
38. Naşcu H., Metode și tehnici de analiză instrumentală, U.T. Pres, Cluj Napoca,
2003.
39. Nielsen Suzanne et . col., Food analysis, Fourth Edition, Springer , New York,
2010.
40. Nollet L.M.L., Food Analysis by HPLC, Second Edition, Marcel Dekker INC,
2000.
41. Oliver J., Palou A., Review, Chromatographic determination of carotenoids in
foods, Journal of Chromatography A, Vol 881, 543–555, 2000.
42. Oprescu D., Ștefănescu M., Stoia M., Muntean C., Analiza chimică cantitativă
– Principii și aplicații, Editura Politehnica Timișoara, 2002.
43. Pattison J. B., Programozolt bevezetes a gaz-folyadek kromatografiaba,
Muszaki konyvkiado, Budapest, 1975.
44. Piringer O. Tătaru E., Cromatografia în fază gazoasă, Editura Tehnică,
Bucureşti, 1969.
45. Pires, M., Carvalho, L.R.F., An artifact in air carbonyls sampling using C18
DNPH-coated cartridge, Analytica Chimica Acta, 1998, 367, 1998, 223-231.
46. Rouessac F., Rouessac A., Analyse Chimique, Methodes et techniques
instrumentals modernes, 3e edition, Masson, Paris, 1997.
47. Scott R.P.W., Chromatographic Detectors, Chromatographic Science Series,
Vol 73, Marcel Dekker INC, 1996.
48. Skoog D. A., Leary J. J., Principles of Instrumental Analysis, Saunders
College Publishing, Fort Worth, 1992.
49. Shibamoto T., Chromatographic Analysis of Environmental and Food
Toxicants, Chromatographic science Series, Vol 17, Marcel Dekker INC,
1998.
50. Sadek P.C., The HPLC Solvent Guide, Second Edition, John Wiley & Sons
Inc, 2002
51. Scott R.W., Principles and practice of chromatography, Library for science,
2003
52. Snyder L.R., Kirkland J.J., Introduction to modern Liquid Cromatography,
Second edition, John Wiley & Sons INC, New York, 1979
53. Ştefănescu M., Metode fizico-chimice aplicate în chimia analitică, Ed.
Politehnica Timișoara, 1998.
54. Subramanian G.,Chiral Separation Techniques, John Wiley &Sons Inc,New
York,2001
55. Tănase I.G. Tehnica cromatografică, Editura Tehnică, Bucureşti, 1967.
15
56. Vâtcă Gh., Lucrări practice de analiză instrumentală, Ed. Risoprint, Cluj
Napoca, 2002.
57. Vâtcă Gh., Metode instrumentale de analiză, Ed. Risoprint, Cluj Napoca,
2006.
58. Wellings D.W. A Practical Handbook of Preparative HPLC,2002.
59. Wu C-S., Handbook of Size Exclusion Chromatography, Marcel Dekker Inc,
1995.
16