Sunteți pe pagina 1din 16

METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

2.4. Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)


Cromatografia de lichide de înalta performanță este în prezent mult
utilizată deoarece permite analiza substanțelor moleculare organice, organo-
metalice și anorganice , inclusiv a compușilor cu masă moleculară ridicată naturali
sau sintetici. Eficacitatea coloanelor în HPLC este mai mică decât cea din
cromatografia de gaze. În schimb, în cazul HPLC se poate modifica atât faza
staționară cât și cea mobilă ceea ce face posibilă separarea unor compuși imposibil
de separat prin alte tehnici. Această tehnică este cel mai mult aplicată dintre
tehnicile cromatografice fiind folosită în analiza chimică, biomedicală,
farmaceutică, analiza alimentelor etc. HPLC este utilizată pentru separarea şi
detecţia unor compuşi biologic activi (hormoni, vitamine, proteine , lipide) ,
instabili termic.
Schema unui aparat HPLC este prezentată în fig. 2.26. unde se observa că
din rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa, alimentează coloana
cu eluent (un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate a
coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. În
coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc separarea propriu-zisă. Componentele
traversează coloana cromatografică şi ies secvenţial din coloană. Efluentul coloanei
intră într-un detector de unde componentul, dacă este separat complet, poate fi
colectat şi izolat, cu ajutorul unui colector de fracţiuni pe baza variației unei
proprietăți. Semnalul dat de detector este înregistrat fie cu un înregistrator, fie
direct în memoria unui calculator.

Fig. 2.26. Schema de principiu a unui cromatograf de lichide de înalta performanță

1
Detectorul generează un semnal electric de fond în timpul în care numai
eluentul părăseşte coloana, dar produce un semnal cu totul diferit în momentul în
care, împreună cu eluentul, soseşte o componentă a probei. Semnalul electric este
prelucrat (amplificat, modulat, filtrat), iar datele digitalizate sunt transmise spre
sistemul de prelucrare computerizată.
Pompa permite realizarea unui debit constant al eluentului prin întregul
sistem al cromatografului de lichide: injector, coloană, detector. Pompa permite
creșterea apreciabilă a vitezei de separare în injector, coloană și detector.
Cromatograful de lichide este dotat cu una sau mai multe pompe. Fiecare din
acestea furnizează o presiune de circa 20000 kPa sau mai mare. Această presiune
ridicată este necesară pentru a învinge rezistența la curgere opusă de umplutura cu
finețe mare. În absența presiunii aplicate , debitul efluentului ar fi foarte mic, iar
separarea cormatografică ar dura prea mult. Pompele pot fi cu presiune constantă și
pompe cu debit constant și funcționează într-un mediu coroziv, fiind construite din
materiale rezistente la coroziune (teflon, safir, agat).
Pompele cu presiune constantă sunt simple, relativ ieftine și nu prezintă
pulsații în funcționare. Pulsațiile sunt nedorite deoarece împiedică obținerea unei
linii de bază netede. Aceste pompe au ca dezavantaj, faptul că debitul trebuie
modificat frecvent pentru a se menține cât mai constant. În cazul separărilor de
lungă durată apar probleme deoarece în cursul funcționării cromatografului, are loc
obturarea coloanelor ceea ce duce la scăderea debitului. Orice modificare de debit,
datorită vâscozității sau temperaturii eluentului și a structurii umpluturii afectează
timpul de retenție, și semnalul detectorilor, care sunt sensibili la concentrație.
Pompele cu debit constant pot să fie cu piston sau de tip seringă. Pompele
cu piston sunt cele mai utilizate, mișcarea oscilatorie a pistoanelor și a supapelor
permit o funcționare continuă, dar necesită dotarea cu dispozitive de atenuare
pulsațiilor care să elimine variațiile de debit de mică amploare. Pompele cu
presiune constantă sunt asemănătoare cu seringile, dar au capacitate mai mare. Ele
pompează continuu pe toată durata separării. Pistonul se deplasează cu o viteză
liniară constantă, dar după fiecare cursă este necesară oprirea debitului și
reumplerea cu solvent a corpului pompei.
Introducerea probei trebuie facută foarte rapid, pentru a nu perturba
regimul dinamic al eluentului prin coloană și detector având în vedere presiunea
ridicată de lucru. Cel mai utilizat sistem de introducere a probei este ventilul cu 6
căi, numit și ventil de introducere a probei, prevăzut cu bucle interschimbabile (fig.
2.27). Ventilul cu 6 căi funcționează în 2 etape
 etapa A: introducerea probei în ventil cu ajutorul unei seringi;

2
 etape B: comutarea ventilului pe analiză când are loc rotirea cu 60° în sensul
acelor de ceasornic și antrenarea probei din buclă în coloană.
Eluentul aderă la pereți, iar pentru completa îndepărtare a sa în momentul
alimentării buclei cu probă, este necesară injectarea prin buclă a unui volum de cel
puțin 3 ori volumul acesteia, înainte de comutarea pe analiză. Ventilele sunt
confecționate din materiale rezistente la coroziune (oțel,tantal,teflon).

Fig. 2.27. Ventilul pentru introducerea probei lucrează în două etape: A - alimentarea buclei cu proba;
B -după o rotire cu 60° în sensul acelor de ceasornic,are loc antrenarea probei din buclă în coloană.

Coloana cromatografică este spațiul în care are loc separarea


componenților probei , fiind formată din corpul coloanei și umplutura coloanei.
Corpul coloanei este alcătuit dintr-un material rezistent pentru a putea funcționa la
presiunile ridicate la care se operează în HPLC și rezistența la coroziune, fiind
construite din oțel inoxidabil lucios, materiale compozite formate din sticlă sau
material plastic în interior și oțel inoxidabil în exterior. Coloanele sunt cilindrice
(fig. 2.28), iar dimensiunile depind de mărimea granulelor şi porozitatea
umpluturii. Diametrul coloanelor este între 0.3÷5cm iar lungimea poate fi între
3÷25cm. În scopuri preparative, se utilizează diametre mai mari de 5 cm. Cu cât
umplutura este mai fină, cu atât se recomandă a se lucra cu o coloană mai scurtă.
Pentru a se reține eventualele impurități sau componenți care nu pot părăsi coloana
deoarece sunt reținuți ireversibil, se pot utiliza precoloanele care au același
diametru ca și coloanele, dar lungimi mai mici (0,4÷1 cm). Coloana cromatografică
este prevăzută la cele două capete cu două discuri metalice poroase pentru a reține
fază staționară care ar putea fi antrenată de faza mobilă în zona poroasă cu porii
având diametrul de 0,5÷10 µm.

3
Fig. 2.28. Coloane HPLC de diferite dimensiuni
Mecanisme de separare în cromatografia de lichide
Separarea prin cromatografia de lichide are loc prin diferite mecanisme în
funcție de faza mobilă și staționară din coloană și de natura fenomenului fizico-
chimic.
În funcție de compușii ce urmează să fie separați prin cromatografia de
lichide (masa moleculară, polaritatea) mecanismul se alege cu ajutorul schemei din
figura 2.29.

4
Figura 2.28. Mecanisme de separare în cromatografia de lichide

Faze staţionare normală şi inverse în HPLC


În funcţie de umplutura coloanelor se disting două variante de lucru pentru
separarea prin HPLC: cu fază normală (HPLC-FN) și cu faza inversă (HPLC-FI).
Pentru umplutura coloanelor cu fază normală se folosesc următoarele substanţe:
silicagel, alumina, celuloză; MgCO3.
Pentru umplutura coloanelor cu fază inversă se folosesc următoarele
substanţe cu proprietăţi de adsorbţie: carbune macroporos, polimeri poroși,
silicagel modificat chimic prin legarea de octadecilsilan C18 sau octasilan C8.
5
Mecanismul pe baza căruia are loc separarea în cele două cazuri este
diferit. În cazul sistemelor HPLC –FN , separarea are loc datorită proceselor de
adsorbţie, iar în sistemele HPLC-FI , procesul de separare se bazează pe repartiţia
componentelor între faza staţionară nepolară şi eluentul polar.
Silicagelul (SiO2) folosit ca fază staționară în coloanele pentru HPLC se
obține sub formă sferică din soluții care conțin silicat de sodiu pur sau alți compuși
ai siliciului care dau reacții de hidroliză: tetraclorura de siliciu, silicat de etil.
Acești compușii siliciului se supun reacției cu de hidroliză, urmată de pulverizare și
de sinterizare. Se obțin granule astfel cu aspect sferic. Granulația silicagelului
trebuie sa fie uniformă. Partea fină se elimină din produs, în acest fel curgerea
eluentului este mult îmbunătățită.
Tipul fazei mobile (a eluentului) depinde de natura fazei staţionare. Astfel
în sistemele HPLC-FN unde faza staţionară este polară, se folosesc eluenţi nepolari
(eter de petrol, hexan puri) iar când faza staţionară este nepolară (HPLC-FI) se
folosesc amestecuri de solvenţi nepolari cum sunt acetonitril, metanol, acetat de
etil. Dacă proba este preponderent nepolară se recomandă utilizarea sistemului
HPLC –FN unde coloana conţine faza staţionară polară cu afinitate diferită. Dacă
probă este preponderent polară se recomandă utilizarea sistemului HPLC – FI.
Detectia in HPLC se realizează refractometric, spectrofotometric, pe baza
difuziei luminii, conductometric și amperometric. În unele cazuri se adaugă reactivi
care permit detecția cu ajutorul unui anumit instrument, de exemplu cu
spectrofotometru sau fluorimetru. Acest procedeu se numeste derivatizare.
Detectorul refractometric, se bazează pe legile refracţiei luminii, de
transmitere a luminii prin medii transparente. Un fascicul luminos trece printr-o
celulă cu două compartimente unul conţinând doar eluentul pur iar celălalt faza
mobilă care părăseşte coloana (Fig. 2.30). Diferenţa dintre indicii de refracţie
pentru soluţiile aflate în cele două compartimente vor fi practic nule, atâta timp cât
din coloană iese doar eluentul pur, dar diferită de zero atunci când în eluent mai
apare un component separat în coloană și antrenat de către eluent.
Detectoare refractometrice sunt universale, semnalând prezenţa oricărei
specii chimice. Aceste detectoare nu se utilizează când se aplică eluţia cu gradienți
(concentraţie, pH, temperatură, viteză de curgere, etc). În acest caz se folosesc
sisteme diferenţiale, comparându-se două curente de efluent, dintre care numai
unul în amestec cu componenţii separaţi. Detectorii refractometrici diferenţiali pot
fi cu deflexie când variaţia indicelui de refracţie al lichidului din celula detectorului
provoacă modificarea unghiului de refracţie, figura 2.29. Raza de lumină care trece
prin celulele de referinţă şi măsură va fi deplasată cu un unghi proporţional cu
diferenţa dintre indicii de refracţie ai celor două lichide.

6
Fig. 2.29. Schema de principiu a unui detector refractometric cu deflexie

Detectorul cu reflexie sub


unghi limită (tip Fresnel), are la
bază legea reflexiei limită,
conform căreia procentul de
lumină reflectată la interfaţa
lichid-solid este proporţional cu
unghiul de incidenţă şi cu indicii
de refracţie ai celor două faze.
Unghiul de incidenţă este ajustat
sub unghiul limită, iar detectorul
semnalizează orice variaţie a
intensităţii de lumină, figura 2.30.
Fig 2.30. Schema refractometrului Fresnel
Detectorul
spectrofotometric în UV-VIS (Fig 2.31) este cel mai utilizat în HPLC. Pentru a
putea fi utilizaţi, compuşii separaţi cromatografic trebuie să fie coloraţi (să
absoarbă în vizibil), sau să absoarbă în UV, iar efluentul trebuie să fie practic
transparent pentru domeniul spectral UV-VIS. Un mare avantaj al detectorului este
faptul că nu este sensibil la micile variaţii de debit şi temperatură. Celula de
detecţie face parte dintr-un spectrofotometru şi are un volum extrem de mic, (8-
10μl), un diametru interior de 1mm la o lungime a celulei de 10 mm.

7
Fig 2.31. Schema unui cromatograf care foloseste un detector spectrofotometric

Detectorul de florescență utilizat în HPLC (Fig 2.32) are un design similar


cu fluorimetrele sau spectrofotmetrele. Acest tip de detector utilizează sursa de
xenon, iar monocromatorul izolează radiațiile fluorescente, are sensibilitate bună,
dar e nevoie de derivatizare. Se utilizează la detecția componenților care prezintă
fluorescență sau au fost transformați prin derivatizare în compuși fluorescenți.

Fig 2.32. Schema unui detector de florescență


Detectorul conductometric se utilizează cu precădere în cromatografia pe
schimbători de ioni. Acești detectori sunt sensibili la ioni anorganici sau organici
inclusiv acizi organici. Detectorii conductometrici sunt specifici și relativ sensibili
(500pg-1ng). Principiul de funcţionare este prezentat schematic în figura. 2.33.
Faza mobilă trece printr-o celulă miniaturizată analogă unei celule
conductometrice.

8
Fig 2.33. Principiul de funcționare a detectorului conductometric

Detectorul amperometric (Fig 2.34) se utilizează pentru compușii


oxidabili sau reductibili. Detectorul utilizat pentru spectrometria de masă necesită
coloane capilare, pulverizare, fiind destul de scump.

Fig 2.34. Principiul de funcționare a detectorului amperometric


Detectorul FT-IR (Fig 2.35) realizează determinări calitative uneori
imposibil de realizat prin alte variante de detecţie în lipsa etaloanelor cunoscute,
dar are un preț de cost ridicat.

9
Fig 2.35. Principiul de funcționare a detectorului amperometric

Cromatograful de lichide cuplat cu spectrometrul de masă și spectrometrul


cuplat inductiv (HPLC-ICP-SM), este prezenatat în figura 2.36. Aparatul prezintă
mai multe avantaje, atât faza staționară cât și faza mobilă pot fi modificate pentru a
obține separarea mai bună, separările pot fi îmbunătățite suplimentar prin
adăugarea de aditivi (aditivi chirali, surfactanți) în faza mobilă, separările pot fi
îmbunătățite prin schimbarea fazei mobile în timpul analizei.

Fig 2.36. Schema unei instalații HPLC-ICP-SM


Aplicații ale HPLC la analiza alimentelor
Extinerea posibilităților de analiză prin HPLC este datorată fazelor legate
de particulele de adsorbant (silicagelul silanizat). Analiza mono și oligozaharidelor
se realizează prin cromatografie cu schimbători de ioni (cu faza normală sau

10
inversă) și detecție prin metode electrochimice (variația de conductivitate), detecție
refractometrică sau analiza postcoloană, analiza vitaminei E (cu faza normală sau
inversă). Detecția se realizează electrochimic, cu fluoresență sau UV.
Analiza amino-acizilor se face prin cromatografia de schimb ionic, în fază
inversă. Pentru detecție se face o derivativare înainte sau după coloana de separare
(pre sau post derivatizare cu reactivi specifici care se atașează de grupele amino
formând compuși fluorescenți).
Determinarea compoziției în aminoacizi și a proporţiei aminoacizilor
esenţiali din proteine (după hidroliză) este importantă pentru evaluarea calităţilor
nutriţionale ale proteinelor din diverse alimente. Prin HPLC se poate determina
compoziția lipidelor, respectiv natura și concentrația acizilor grași saturați și
nesaturați din uleiuri și grăsimi de origine animală. De asemenea prin HPLC se pot
determina componenţii minori şi metaboliţii din alimente: coloranţii din sucurile de
fructe sau vin, diacetilul din unt, flavonoidele din sucurile de fructe, antioxidanţii
din vegetale etc.
Pesticidele din alimente
sunt analizate pe fază normală
sau inversată, și detectate prin
UV, fluorescență sau
spectrometrie de masă. În cazul
micotoxinelor, separarea se
realizează prin cromatografică de
afinitate. În acest caz, procesul de
separare se bazează pe
interacțiunea specifică și
reversibilă dintre moleculele
alfate în faza mobilă
(micotoxine) și un ligand
imobilizat pe suprafața fazei
staționare.
Se observă modificarea
compoziției prin conservare din
analiza cromatografică aplicată la Fig 2.37.Cromatograma morcovilor proaspeți (a)
extractele de morcovi proaspeți și și conservați (b) obținută prin HPLC
conservați. Astfel cromatograma
obținută (fig 2.37) prin HPLC cu fază inversă la analiza izomerilor de structură ai
carotenilor din morcovii proaspeți și cei conservați indică modificarea compoziției
de caroteni prin conservare; picul 7 corespunde la α caroten, iar picul 9 la β

11
caroten, în timp ce picurile 1-6, 8 și 10 sunt date de alți izomeri de structură ai
carotenilor.
Curcumina, este un colorant alimentar și antioxidant natural, de culoare
galbenă, iar puritatea și concentrația de component activ și de compuși înrudiți se
poate analiza prin HPLC pe o coloana cu silicagel modificat C18, cu detecție în
vizibil (la λ=420nm), eluție izocratică cu amestec 4:6 tetrahidrofuran: soluție
apoasă de acid citric 1 g/L. Cromatograma este prezentată în figura 2.38 .

Fig. 2.38. Cromatograma unui extract alcoolic de curcumină

Avantajele metodelor HPLC sunt date de rapiditatea analizelor, faptul că


sunt disponibile comercial faze staționare cu diferite caracteristici care permit
separări complexe, rezoluția foarte bună, sensibilitate ridicată. Proba se poate
recupera, este nevoie de un volum mic de eluent.

12
Bibliografie

1. ***Enciclopedia of food science, food technology and nutrition, Academic


Press, London, 1993.
2. Baiulescu G.E., Năşcuţiu T., Metode fizice de analiză a urmelor, Editura
Tehnică, Bucureşti, 1974.
3. Barry E. ,Grob R., Columns for Gas Chromatography: Performance and
Selection , John Wiley and sons, 2007
4. Bojiță M., Roman L., Săndulescu R., Opren R., Analiza și controlul
medicamentelor. Vol 1. Bazele teoretice și practice. Vol. 2 Metode
instrumentale în analiza și controlul medicamentelor, Editura Intelcredo,
Deva, 2003.
5. Braithwaite A., Smith F.J., Chromatographic Methods, Fifth Edition, Kluwer
Academic Publishers, London,UK, 1999.
6. Braitmaier E., Structure elucidation by NRM in organic Chemistry, A
practical Guide, John Wiley &Sons Ltd, 2002.
7. Cazes J., Encyclopedia of Cromatography, Marcel Dekker INC, 2004.
8. Ciucanu I., Cromatografia de gaze cu coloane capilare, Editura Academiei
Române, Bucureşti, 1990.
9. Chan C.C., Lam H., Lee Y.C., Zhang X.M, Analytical Method Validation and
Instrument Performance Verification, John Wiley & sons, Hoboken, New
Jersey, 2004.
10. Christian G.D. , Analytical Chemistry, Fifth Edition, Mc Graw Hill Book
Company, New York, 1994.
11. Cordoș E., Frențiu T., Rusu A.M., Ponta M., Darvași E., Analiza prin
spectrometrie de absorbție moleculară în ultraviolet-vizibil, Institutul Național
de Optoelectronică, București, 2001.
12. Crosby N.T., Day J.A., Hardcastle W.A., Holcombe D.g. Treble R.D., Quality
in Analytical Chemistry Laboratory, John Wiley & sons, Chichester, 1995.
13. Dăneț A. F. Metode instrumentale de analiză, Ed Științifică , București, 1995.
14. Dettmer-Wilde K.,Engewald W., Practical Gas Chromatography, Springer,
2014.
15. Dumitrescu, H., Milu, C. Controlul fizico-chimic al alimentelor, Ed.Medicală,
București, 1997.
16. Dumitrescu V., Dumitrescu N., Varduca I. Analiză instrumentală Aspecte
teoretice și practice ale spectrometriei de absorbție atomică, Ed.Universității
București, 2003.

13
17. Dumitru C., Metode și tehnici de control ale produselor alimentare și de
alimentație publică, Ed. Ceres, 1985.
18. Dymat T.C., Atomic Absorption with Electrothermal Atomisation, Pye
Unicam Ltd., 1981
19. Fifield F.W., Kealey D., Analytical Chemistry, Great Britain by Bell and
Bain Ltd., Glasgow, 1983.
20. Gocan S., Cromatografia de înaltă performanţă p I-a Cromatografia de Gaze,
Ed. Dacia Cluj –Napoca,1998
21. Gocan S., Cromatografie de Înaltă Performanţă, p. II-a, Cromatografia de
Lichide pe Coloană, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2002.
22. Grob R.L., Barry E.F., Modern practice of Gas Chromatography, Fourth
Edition, John Wiley & Sons INC, New Jersey, 2004.
23. Gross J.H., Mass Spectrometry A Textbook, Springer Verlag, Berlin, 2004
24. Guide to Solide Phase Extraction, Supleco Bulletin 910
25. Jäntschi L., Naşcu H.I., Chimie analitică și instrumentală, Ed. Academic Pres
& AcademicDirect, 2009.
26. Jäntschi L., Bolboacă S., Analiză Chimică și Instrumentală Aplicată, Ed.
AcademicDirect, 2009.
27. Julean I, Rotărescu A., Chimie analitică, Editura Mirton Timișoara, 1997.
28. Hamilton R.J, Sewell P.A, Introduction to high performance liquid
chromatography, Great Britain by J.W.Arrowsmith Ltd, Bristol, 1982.
29. Lazǎr M.I., Lazǎr D., Corciovǎ A., Analiza medicamentelor, Editura PIM Iași,
2008.
30. Lee M.S., LC/MS applications in drug development, John Wiley & Sons Inc.,
2002
31. Snyder L.R., Kirkland J. J., Dolan J.W., Introduction to Modern Liquid
Chromatography, Third Edition,
32. Luca C., Duca Al, Crișan I. Al., Chimie analitică și analiză instrumentală, Ed.
Didactică și pedagogică, București, 1983.
33. Lundanes E., Reubsaet L., Greibrokk T., Chromatography: Basic Principles,
Sample Preparations and Related Methods, Wiley VCH, 2016
34. Meier P.C., Zund R.e., Statistical Methods in Analytical Chemistry, John
Wiley 7 Sons, New York, 2000.
35. Medvedovici A., Tache F., Noţiuni fundamentale şi mărimi caracteristice in
cromatografie, Ed. Universităţii Bucureşti, 1997
36. Moldovan Z., Metode Instrumentale de analiză, Editura Universității
București, 2001

14
37. Mondello L., Lewis A,C., Bartle K.D., Multidimensional Chromatography,
John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, 2002.
38. Naşcu H., Metode și tehnici de analiză instrumentală, U.T. Pres, Cluj Napoca,
2003.
39. Nielsen Suzanne et . col., Food analysis, Fourth Edition, Springer , New York,
2010.
40. Nollet L.M.L., Food Analysis by HPLC, Second Edition, Marcel Dekker INC,
2000.
41. Oliver J., Palou A., Review, Chromatographic determination of carotenoids in
foods, Journal of Chromatography A, Vol 881, 543–555, 2000.
42. Oprescu D., Ștefănescu M., Stoia M., Muntean C., Analiza chimică cantitativă
– Principii și aplicații, Editura Politehnica Timișoara, 2002.
43. Pattison J. B., Programozolt bevezetes a gaz-folyadek kromatografiaba,
Muszaki konyvkiado, Budapest, 1975.
44. Piringer O. Tătaru E., Cromatografia în fază gazoasă, Editura Tehnică,
Bucureşti, 1969.
45. Pires, M., Carvalho, L.R.F., An artifact in air carbonyls sampling using C18
DNPH-coated cartridge, Analytica Chimica Acta, 1998, 367, 1998, 223-231.
46. Rouessac F., Rouessac A., Analyse Chimique, Methodes et techniques
instrumentals modernes, 3e edition, Masson, Paris, 1997.
47. Scott R.P.W., Chromatographic Detectors, Chromatographic Science Series,
Vol 73, Marcel Dekker INC, 1996.
48. Skoog D. A., Leary J. J., Principles of Instrumental Analysis, Saunders
College Publishing, Fort Worth, 1992.
49. Shibamoto T., Chromatographic Analysis of Environmental and Food
Toxicants, Chromatographic science Series, Vol 17, Marcel Dekker INC,
1998.
50. Sadek P.C., The HPLC Solvent Guide, Second Edition, John Wiley & Sons
Inc, 2002
51. Scott R.W., Principles and practice of chromatography, Library for science,
2003
52. Snyder L.R., Kirkland J.J., Introduction to modern Liquid Cromatography,
Second edition, John Wiley & Sons INC, New York, 1979
53. Ştefănescu M., Metode fizico-chimice aplicate în chimia analitică, Ed.
Politehnica Timișoara, 1998.
54. Subramanian G.,Chiral Separation Techniques, John Wiley &Sons Inc,New
York,2001
55. Tănase I.G. Tehnica cromatografică, Editura Tehnică, Bucureşti, 1967.

15
56. Vâtcă Gh., Lucrări practice de analiză instrumentală, Ed. Risoprint, Cluj
Napoca, 2002.
57. Vâtcă Gh., Metode instrumentale de analiză, Ed. Risoprint, Cluj Napoca,
2006.
58. Wellings D.W. A Practical Handbook of Preparative HPLC,2002.
59. Wu C-S., Handbook of Size Exclusion Chromatography, Marcel Dekker Inc,
1995.

16