METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE ȘI ANALIZĂ

2.5. Cromatografia în strat subțire

Cromatografia planară (CP) este cunoscută şi sub denumirea de
cromatografie în strat subţire fiind cea mai simplă şi ieftină dintre metodele
cromatografice. În această variantă a
cromatografiei de lichide, separarea nu
mai are loc într-o coloană închisă ci pe o
fază staționară similară, granulară
(poroasă) dispusă într-un strat subțire,
formând un plan (fig. 2.39). Acest strat
denumit “subţire”, este format dintr-un
adsorbent cu grosimi de 100-250µm
care este depus pe o placă rigidă sau
este legat adeziv de placă datorită
adaosului de liant. Adsorbentul este în Fig 2.39.Placă cromatografică și
pozițiile relative ale spoturilor
contact cu o fază gazoasă saturată cu
vapori de eluent. Se mai utilizează cromatografia pe hârtie unde faza staţionară
constă dintr-o bandă de hârtie de filtru, confecţionată din celuloză pură,
sau prin folosirea unor plăci din materiale ceramice poroase. Cromatografia în
straturi subţiri se realizează pe un adsorbent pulverulent (silicagel, celuloză,
alumină, poliamidă) dispus în straturi subţiri pe plăci rigide din sticlă sau pe folii
din aluminiu, poliester, materiale inerte faţă de sistemul pe care are loc separarea.
Pentru a se putea demara procesul de eluţie, în prealabil pe placa cu strat
subţire se aplică proba. Acest lucru se realizează cu seringi sau micro-pipete, dar şi
alte dispozitive specializate, astfel încât să se obţină aliniate, pe linia de start (fig.
2.39), mai multe spoturi de probe sau de amestecuri etalon supuse simultan
separării.
Migrarea eluentului are loc prin coloana deschisă, pe veriticala (ascendent
sau descendent) și pe orizontală. O placă se poate elua de mai multe ori sau se
poate evapora solventul în timpul migrării. În acest fel se mărește eficiența pe
seama timpului de separare. Pentru realizarea separării (eluției) se utilizează
camere de developare. Formele cele mai uzuale ale camerelor de developare sunt
cele paralelipipedice sau cilindrice (pahare) prevăzute cu capac și cu dispozitiv de
fixare a plăcii plane (hartie sau strat subțire).

1
Fig 2.40.Camere cromatografice
uzuale în cromatografia planară
 Ele pot fi saturate cu amestecul de solvenți utilizat la separare pentru a mări viteza
de eluție. Camerele de developare de formă paralelipipedice se numesc camere de
tip N (normale), iar cele subțiri se numesc camere de tip S (sandwich) (Fig 2.40).
Camerele de developare de tip S prezintă avantajul unui volum redus al fazei
gazoase ceea ce duce la o viteză de saturare mai mare și o durată mai mică a
procesului de separare. Eluția are loc după introducerea plăcii în camera
cromatografică, până când amestecul de solvenți atinge o înalțime finală, fixată de
obicei între 5 și 18 cm, sau după un anumit timp stabilit.
Solvenții utilizați se aleg în funcție de proprietățile de eluție ale
substanțelor supuse separării. După eluţie placa de developare se scoate şi se
usucă. Dacă substanţele separate sunt incolore, ele trebuie “vizualizate” cu ajutorul
unor reactivi cu care se obţin compuşi coloraţi.
Vizualizarea componenţilor (Fig 2.41) pe placa cromatografică se poate
realiza prin următoarele procedee: scufundarea
plăcii cromatografice într-un reactiv ( de exemplu
acidul sulfuric concentrat); pulverizarea cu soluţia
reactivului cu ajutorul unui pulverizator;
introducerea într-o atmosferă ce conţine gaze
reactive ( de exemplu vapori de ammoniac sau
iod). Plăcile cromatografice se pot vizualiza şi
prin introducerea în etuvă, la cald, când au loc Fig 2.41. Aspectul plăcilor și
al spoturilor la vizualizare
reacţii chimice.
Se pot folosi plăci impregnate cu o substanţă fluorscentă ( ZnS sau
fluoresceina).
Prin examinarea cromatogramelor eluate şi uscate în lumină , se vor
observa spoturi închise la culoare sau colorate pe un fond fluorescent, luminos.
Fazele staționare mai utilizate sunt silicagelul, alumina și celuloza .
Principalii absorbanți sunt silicagelul, oxidul de aluminiu, kiselgurul,
hidroxidul de magneziu, celuloza, poliamidele, rășinile schimbătoare de ioni.
Un adsorbant ca să poată fi utilizat în CSS trebuie să indeplinească condițiile:
• Să nu reacţioneze cu substanţele de separat sau cu developanţii;
• Să nu reacţioneze cu reactivul de identificare;
• Să reziste la t> 100º C la care trebuie uneori încălzite plăcile;
• Să aibă suprafaţa specifică mare, granulaţia fină, pori de diametru mic.
Dacă se cunosc componenţii probei de analizat, deci polaritatea
substanţelor şi posibilitatea formării legăturii de hidrogen, atunci în alegerea
fazelor mobile se vor folosi seriile eluotrope.

2
 Dacă nu se cunoaşte componenţa probei de analizat, selecţia fazei mobile
este mai dificilă şi necesită încercări preliminare, la început cu solvenţi nepolari şi
apoi pe măsura creşterii polarităţii, cu celelalte categorii de solvent.
Analiza calitativă se face prin compararea
valorilor Rf ale spoturilor obţinute pentru etaloane cu
cele ale substanţelor din proba de analizat. Pentru
fiecare compus separat prin cromatografia în strat
subțire se calculează parametrul de retenție, așa
numitul Rf , care reprezintă viteza relativă de migrare
a acestuia față de developant. Rf se defineşte ca
raportul între distanţa a măsurată de la start până în
punctul de concentraţie maximă a spotului
corespunzător unui component şi distanţa b parcursă
de frontul developantului în acelaşi timp, figura 2.42. Fig. 2.42. Caracteristicile
Rf reprezintă o caracteristică a compusului separat în unei cromatograme pe
condiţii date; are valori cuprinse între 0 şi 1. strat subțire
a
Rf 
b
(2.48)

Prin cromatografia în strat subțire se pot separa și identifica o gamă largă

de substanțe: metale din apă, coloranți alimentari, naturali sau sintetici, aminoacizi,
edulcoranți, pesticide din ape, sol, alimente etc.
Analiza cantitativă se bazează pe densitometria prin transmisie sau
reflexie a spotului, respectiv scanarea. Semnalul măsurat serveşte la construirea
unei curbe de etalonare din semnalele măsurate pentru diferitele spoturi, conţinând
cantităţi crescătoare de component, aplicate, alături de proba necunoscută, pe
aceeaşi placă.
Se preferă metoda curbei de etalonare în reflexie (adică prin măsurarea
reflectanţei) deoarece domeniul liniar al metodei este destul de îngust şi adesea
curba de etalonare este neliniară.
O variantă mai simplă dar mai laborioasă de analiză cantitativă constă în
,,spălarea” zonei corespunzătoare analitului de pe suport într-un pahar, folosind un
solvent adecvat şi apoi determinarea, cu o altă metodă instrumentală, a
concentraţiei soluţiei rezultate.
Evaluarea cu ajutorul fotodensitometrelor este până în prezent cea mai
utilizată metodă. În aceste instrumente, placa se deplasează odată cu suportul (de
regula în direcţia developării), prin faţa fantelor sistemului optic de iluminare,

3
respectiv de măsurare a intensităţii luminii reflectate. Schema unui astfel de
dispozitiv este prezentată în fig. 2.43.

Pentru detecție se poate selecta lampa, aparatul fiind dotat de obicei cu mai
multe lămpi: lampă cu halogen, pentru determinări în domeniul vizibil (400÷800
nm), lampă cu deuteriu pentru spoturile care absorb în UV (190÷400 nm) și cu
lampă UV cu intensitate mai ridicată (cu xenon sau cu vapori de mercur), pentru
spoturile fluorescente.
Lumina monocromatică care părăseşte monocromatorul se reflectă pe
oglinda, se reflectă pe placa cu strat subţire iar lumina reflectată este receptată pe
fotomultiplicator. Semnalul obţinut este înregistrat de înregistratorul I, care poate fi
chiar un calculator.

Fig.2.43. Sistemul optic al densitometrului

4
 După înregistrare, densitogramele se evaluează cantitativ, prin măsurarea
înălţimii picurilor, sau a suprafeţei acestora. Oricare dintre mărimile măsurate
poate constitui semnalul analitic. Trasarea graficului semnalului analitic în funcţie
de cantitatea de substanţă din spot, duce la o curba de etalonare. În cazul
determinărilor de fluorescenţă acest grafic este liniar.
Determinarea cantitativă a seleniului din ape prin cromatografia în strat
subțire se face astfel: în prima etapă se realizează derivatizarea, obținîndu-se un
compus fluorescent, apoi se aplică proba pe placă.
În fig. 2.44 a se prezintă densitograma unei probe de apă conţinând seleniu
derivatizat. Reactivul de derivatizare, apare separat pe aceeaşi placă alături de
compusul rezultat cu seleniul din apă. Repetându-se separarea cu mai multe probe
cunoscute se obţin picuri cu înălţimi diferite (fig. 2.44 b). Reprezentarea grafică a
înălțimilor picurilor din densitograme duce la curba de etalonare (fig 2.44 c).

Fig. 2.44.Aspectul unei densitograme al Se-apă (a), cu înălțimile picurilor (b)și curba de
etalonare(c)

Avantajul cromatografiei în strat subțire este simplitatea și rapiditatea

metodei, faptul că nu necesită aparatură complicată, iar prin utilizarea de diferiți
absorbanți și diferite sisteme de eluție permite separarea unui număr mare de
compuși.
Dezavantajul cromatografiei în start subțire este sensibilitatea inferioară
HPLC-ului; astfel în aplicațiile analitice de performanţă, cu toată simplitatea şi
preţul de cost scăzut, cromatografia planară nu poate înlocui întotdeauna HPLC-ul.

5
Bibliografie

1. Bojiță M., Roman L., Săndulescu R., Opren R., Analiza și controlul
medicamentelor. Vol 1. Bazele teoretice și practice. Vol. 2 Metode
instrumentale în analiza și controlul medicamentelor, Editura Intelcredo,
Deva, 2003.
2. Braithwaite A., Smith F.J., Chromatographic Methods, Fifth Edition, Kluwer
Academic Publishers, London,UK, 1999.
3. Cazes J., Encyclopedia of Cromatography, Marcel Dekker INC, 2004.
4. Dăneț A. F. Metode instrumentale de analiză, Ed Științifică , București, 1995.
5. Dumitrescu, H., Milu, C. Controlul fizico-chimic al alimentelor, Ed.Medicală,
București, 1997.
6. Dumitru C., Metode și tehnici de control ale produselor alimentare și de
alimentație publică, Ed. Ceres, 1985.
7. Jäntschi L., Naşcu H.I., Chimie analitică și instrumentală, Ed. Academic Pres
& AcademicDirect, 2009.
8. Jäntschi L., Bolboacă S., Analiză Chimică și Instrumentală Aplicată, Ed.
AcademicDirect, 2009.
9. Jianu I., Ersilia Alexa E., Cromatografia pe strat subţire în analiza şi controlul
produselor agroalimentare, Ed. Eurobit, Timişoara, 1998.
10. Jercan E., Metode de separare în chimia analitică, Editura Tehnică, Bucureşti,
1983.
11. Liteanu C, Gocan S., Bold A., Separatologie analitică, Editura Dacia, Cluj-
Napoca,1981. John Wiley & Sons, Inc.2010
12. Snyder L.R., Kirkland J. J., Dolan J.W., Introduction to Modern Liquid
Chromatography, Third Edition,
13. Luca C., Duca Al, Crișan I. Al., Chimie analitică și analiză instrumentală, Ed.
Didactică și pedagogică, București, 1983.
14. Lundanes E., Reubsaet L., Greibrokk T., Chromatography: Basic Principles,
Sample Preparations and Related Methods, Wiley VCH, 2016
15. Medvedovici A., Tache F., Noţiuni fundamentale şi mărimi caracteristice in
cromatografie, Ed. Universităţii Bucureşti, 1997
16. Moldovan Z., Metode Instrumentale de analiză, Editura Universității
București, 2001
17. Mondello L., Lewis A,C., Bartle K.D., Multidimensional Chromatography,
John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, 2002.

6
18. Naşcu H., Metode și tehnici de analiză instrumentală, U.T. Pres, Cluj Napoca,
2003.
19. Nielsen Suzanne et . col., Food analysis, Fourth Edition, Springer , New York,
2010.
20. Pelloni-Tamaş V., Iohan F, Cromatografia în strat subţire, Editura Tehnică,
Bucureşti, 1971.
21. Rouessac F., Rouessac A., Analyse Chimique, Methodes et techniques
instrumentals modernes, 3e edition, Masson, Paris, 1997.
22. Shibamoto T., Chromatographic Analysis of Environmental and Food
Toxicants, Chromatographic science Series, Vol 17, Marcel Dekker INC,
1998.
23. Sadek P.C., The HPLC Solvent Guide, Second Edition, John Wiley & Sons
Inc, 2002
24. Sajid M., Porous membrane protected micro-solid-phase extraction: A review
of features, advancements and applications, Analytica Chimica Acta, 2017,
965, 36-53.
25. Scott R.W., Principles and practice of chromatography, Library for science,
2003
26. Snyder L.R., Kirkland J.J., Introduction to modern Liquid Cromatography,
Second edition, John Wiley & Sons INC, New York, 1979
27. Ştefănescu M., Metode fizico-chimice aplicate în chimia analitică, Ed.
Politehnica Timișoara, 1998.
28. Subramanian G.,Chiral Separation Techniques, John Wiley &Sons Inc,New
York,2001
29. Tănase I.G. Tehnica cromatografică, Editura Tehnică, Bucureşti, 1967.
30. Vâtcă Gh., Lucrări practice de analiză instrumentală, Ed. Risoprint, Cluj
Napoca, 2002.
31. Vâtcă Gh., Metode instrumentale de analiză, Ed. Risoprint, Cluj Napoca,
2006.
32. Wellings D.W. A Practical Handbool of Preparative HPLC,2002.