Sunteți pe pagina 1din 9

SEPARAREA AMINOACIZILOR I PEPTIDELOR

PRIN CROMATOGRAFIA PE HRTIE I PE STRAT SUBIRE

I. Cromatografia pe hrtie este un tip de cromatografie de partiie, n care


compuii solubili att n ap ct i n solveni organici pot fi separai datorit capacitii lor de
a se repartiza difereniat ntre cele 2 faze nemiscibile, conform coeficientului de partiie .

concentratia compusului A in solventul 1



concentratia compusului A in solventul 2

Unul din solveni este apa, legat de suportul cromatografic (hrtie) si constituind cu
aceasta faza staionar. Cellalt solvent const n lichidul de eluie (un solvent organic
sau un amestec de solveni organici saturai cu ap) i constituie faza mobil .
Celuloza , sub forma unor coli de hrtie cromatografic, reprezint un suport ideal pe
care apa este absorbit i pe care se poate realiza separarea aminoacizilor i peptidelor. Un
amestec de substane este aplicat n punctul de start, pe hrtia care conine solventul de eluie
(faza mobil). Cnd acestea din urm atinge spotul se stabilete un echilibru al componentelor
amestecului ntre faza mobil i staionar (celuloza imbibat cu ap). Unele molecule prefer
faza staionar (celuloza mbibat cu ap) i rmn n aceeai poziie sau migreaz foarte lent,
n timp ce altele prefer faza mobil i migreaz rapid cu solventul de eluie. Pe parcursul unei
separri cromatografice, produsul de distribuie a substanelor dintr-un amestec, ntre cele 2
faze, este repetat de un numr mare de ori. n final componentele separndu-se n funcie de
coeficienii lor de partiie.
n principal , tehnica separrii este urmtoarea : hrtia cromatografic pe care s-a
aplicat amestecul de separat este introdus ntr-un tanc, nchis etan n care este pus solventul
de developare. Eluia este considerat ncheiat cnd lichidul a splat aproape ntreaga coal
de hrtie. Frontul solventului este marcat i dup uscarea hrtiei se procedeaz la vizualizarea
componentelor separate, printr-o reacie de culoare. Se calculeaza Rf (factorul de retenie).

dis tan ta parcursa de zona cromatografica a unui component


Rf
dis tan ta parcursa de frontul solventului
care este o caracteristic pentru fiecare compus, permind identificarea lui. Valorile R f ale
aminoacizilor variaz cu sistemul solvent de developare utilizat, cu hrtia cromatografic, cu
concentraia probei aplicat n punctul de start, cu temperatura, cu pH-ul amestecului etc.
ntre Rf i coeficientul de partiie exist relaia :

Sm 1
1 unde Sm este suprafaa seciunii transversale prin faza
Ss R f

mobil, iar Ss este suprafaa seciunii transversale prin faza staionar.


Pentru a evita eventualele erori n identificarea spoturilor de aminoacizi sau peptide,
datorit variabilitii valorilor Rf n funcie de condiiile concrete ale separrii, se recomand ca
pe aceeai coal de hrtie cromatografic s fie aplicate probe cu sbstane standard pentru
comparaia direct.

A. Prelucrarea probei : n soluiile care urmeaz s fie supuse cromatografierii se


gsesc o serie de substane : proteine, glucide, lipide, sruri, uree, care pot interfera cu
separarea efectiv. ndeprtarea proteinelor se realizeaz prin fierbere sau prin precipitare cu
aceton, etanol sau la pH izoelectric. Zaharurile pot fi ndeprtate cu ajutorul schimbtorilor
de ioni, fiind eluate liber. Lipidele sunt ndeprtate : prin extracie cu solveni organici.
Concentraiile mari de sruri provoac mprtierea zonelor cromatografice, modificarea, R f i
pot interfera cu reaciile de vizualizare a componentelor. Srurile se ndeprteaz prin
electroliz, iar ureea prin tratare cu ureaz.

B. Alegerea hrtiei cromatografice. Celuloza este un polizaharid alctuit din resturi


de glucoz, legate, capabil de a reine o cantitate apreciabil de ap (aproximativ - 22 % ).
Colile de hrtie cromatografic sunt obinute din celuloz pur i sunt fabricate special ntr-o
mare varietate de forme i poroziti, asigurnd rezultate reproductibile.
Urmtoarele hrtii pot fi utilizate pentru cromatografia calitativ i semicantitativ
Whatman, Schleicher-Schll i Macharag-Nagel.
Fibrele de celuloz sunt dispuse paralel cu o regularitate microscopic.
Firma productoare indic pe ambalaj direcia de orientare a fibrelor de celuloz, deci
cea mai rapid direcie de developare. Pentru scopuri analitice cel mai des folosit este
Whatman Nr.1. Hrtia Whatman 3MM este utilizat pentru separarea unor cantiti mari de
aminoacizi i peptide, dar cu o rezoluie inferioar. Hrtiile Whatman Nr. 4 i Nr. 5
realizeaz separri rapide dar n dauna capacitii de rezoluie. De pe hrtiile Whatman eluia
poate fi realizat cu ap distilat, fr ca din hrtie s ias substane care s afecteze
colorimetrrile.
De pe hrtile Schleicher -Schll eluia se realizeaz cu acid acetic diluat.

C). Alegerea solventului. Un sovent convenabil n separarea unor componente ale


unui amestec trebuie s realizeze distribuirea lor pe ntreaga lungime a hrtiei, fiecare substan
trebuie s aib un Rf cuprins ntre 0,05 i 0,85, iar diferena ntre valorile Rf a 2 componente
care migreaz una dup alta trebuie s fie mai mare de 0,05. De asemenea, solventul de
developare trebuie s nu interacioneze chimic cu hrtia, cu substanele de separare i cu
reactivi de vizualizare.
Eluenii , dup proprietile lor de separare se pot ncadra ntr-un ir eluotropic .
Deoarece, viteza de migrare a componenilor pentru un adsorbant dat depinde de eluentul
utilizat, irul eluotropic poate fi un ajutor preios pentru alegerea adecvat a eluentului. Exist
o corelaie strns ntre polaritatea i efectul de eluare a solvenilor, iar polaritatea este bine
reflectat de constanta dielectric ( )
( poaritatea unui compus este cu att mai mare cu ct constanta este mai mare).
Seria eluotropic (eluotrop) a unor solveni este redat n tabelul nr . 1.
De multe ori efectul de separare nu este corespunztor cu eluenii formai dintr-un
singur solvent. n asemenea cazuri este indicat utilizarea a 2 sau 3 solveni de diferite
polariti. Dac ntr-o cromatogram substana de separat a rmas pe linia de start, atunci
pentru sistemul respectiv trebuie folosit un eluent mai polar, iar dac substanele ajung pe linia
de front se recomand un solvent mai puin polar .

Tabel nr. 1. Seria eluotrop a unor solveni :

Solvent Const. dielectric Solvent Const. dielectric


n - pentan 1,844 acetat de metil 6,68
n - hexan 1,890 piridin 12,30
n - heptan 1,924 1 - heptanol 13,30
n - octan 1, 948 2 - butanol 15,80
n - nonan 1,972 1 - butanol 17,8
n -decan 1,991 2 - propanol 18,3
ciclohexan 2,023 1 - propanol 20,1
dioxan 2,209 aceton 20,7
Ccl4 2,238 anhidrid acetic 22,0
C6H6 2,284 etanol 24,3
toluen 2,380 metanol 32,63
eter dietilic 4,34 etilenglicol 37,0
CHCl3 4,81 glicerin 42,5
eter dimetilic 5,02 acid formic 58,0
acetat de etil 6,02 ap 80,37
acid acetic 6,15

n continuare vom prezenta cteva sisteme solvent developante pentru aminoacizi :


2 - butanol : 3 % NH3 ( 3 : 1 );
alcool amilic teriar saturat cu ap ( 14 -21 zile );
alcool benzilic saturat cu ap;
n - butanol: etanol : ap (4 : 1 : 1 );
n - butanol : acid acetic : ap ( 9 : 1 : 1);
fenol : ap : amoniac ( 160 : 40 : 1 ).

D. Aplicarea probei . Soluia de analizat, prelucarat corespunztor, este pipetat n


punctul start, sub forma unor spoturi rotunde cu un diametru de maximum 11 mm, sau sub
forma unor linii transversale. Pipetarea se face cu ajutorul unor micropipete speciale
hematologice (10 - 20 l prob). Cnd se aplic volume mai mari este absolut necesar
uscarea n curent de aer sau prin nclzire. n afar de acest mod de aplicare a probei prin
pipetare ntr-un anumit punct de plecare, aceasta se mai poate realiza i prin eluie capilar,
introducnd hrtia cromatografic ntr-un vas n care se afl soluia de analizat. Pe
cromatogram poate fi aplicat i proba n stare de pulbere, dup cum produsul poate fi extins
i la aplicarea unor stucturi de esuturi.

E. Aplicarea aminoacizilor martor . Pentru identificarea spoturilor separate


cromatografic i pentru semicantitativarea rezultatelor se recomand aplicarea pe hrtia
cromatografic de aminoacizi martor :

CH2 CH COOH CH2 CH2 CH COOH
si
HS NH2 S NH2
CH3

Cisteina i metionina

fiind compui instabili, nu pot constitui ca atare martori, ci trebuie mai nti oxidai la acid
cistic i respectiv la metionin - sulfon. Lng start rmne acidul cisteic apoi n ordinea
cresterii capacitii de eluie urmeaz aminoacizii. Lisina (Lys), histidina (Hys)arginina (Arg),
acidul aspartic (Asp), metionin sulfona (Met), serina (Ser), glicina (Gly), acidul glutamic
(Glu), treonina (Tre), alanina (Ala), prolina (Pro), tirozina (Tyr), valina (Val), fenilalanina
(Phe), leucina (Leu). Uneori este introdus i un spot cu Rou Neutru, un Rf identic cu cel al
leucinei, compusul care migreaza cel mai rapid.

F). Developarea . Aceasta operaie poate fi efectuat n direcia descendent,


ascendent, orizontal, circular, poate fi repetat pe aceeai dimensiune sau bidimensional.
Developarea este efectuat dup suspendarea hrtiei cromatografice ntr-un tanc, nchis etan,
n care se gsete solventul. Fluctuaiile de temperatur afectnd vitezele de migrare ale
componentelor (valorile Rf ) se recomand plasarea tencului ntr-o camer cu atmosfer
constant, lipsit de cureni de aer, iar separarea s fie realizate la temperatura camerei.
G). Detectarea spoturilor. Aminoacizii fiind compui incolori, spoturile lor trebuie
vizualizate cu reactivi specifici. Se pulverizeaz reactivul de detectat pe suprafaa hrtiei sau se
scufund aceasta n soluia de colorare.

REACIA NINHIDRINEI
Ninhidrina este un puternic agent oxidant, care reacioneaz cu toi - aminoacizii, n
domeniul de pH : 4 - 8 , cu formarea unor compui colorai n albastru violet ( purpura lui
Ruhemann). Sub aciunea oxidant a ninhidrinei are loc dezaminarea i decarboxilarea
aminoacidului, cu producerea unei grupri carbonil la - atomul de C i eliberarea de CO2 i
de NH3. n cursul reaciei, aminoacidul este dezaminat oxidativ, trecnd prin starile
intermediare de acid - iminic i de acid
- cetonic, n timp ce ninhidrina este redus la hidrindantin, care condenseaz cu NH 3
eliberat, cu formarea complexului colorat, denumit purpura lui Ruhemann :

O
OH
O O OH O O
OH H O OH
OH O
OH
O O O O

Ninhidrin Ninhidrin Hidrindantin

redus

CO2 H COOH H2 O CO2 H H


H NH3 -2H2 O
C C C C
R NH R O R O
R NH2
O O

O O

Purpura lui Ruhemann


Reacia cu ninhidrina este pozitiv i pentru aminele primare i NH 3, dar decurge fr
eliberare de CO2. n cazul iminoacizilor - prolina (pro) i hidroxiprolina, n urma reaciei cu
ninhidrina se formeaz nite produi colorai n galben.
n continuare, prezentm dou variante de prepare a reactivului cu ninhidrin.
1). 0,3 g ninhidrin sunt dizolvate n 100 ml n - butanol, la care se adaug 3 ml acid
acetic glacial. Cromatografia uscat este pulverizat cu acest reactiv.
Dup nclzire la 1100 C timp de 10 minute apar spoturile colorate ale aminoacizilor.
2). 5 g ninhidrin sunt dizolvate n 955 ml aceton, apoi se adaug 25 ml acid acetic i
20 ml 2,4,6 colidin. Vizualizarea se face, de asemenea, dup nclzire la 110 0C timp de 10
minute.

II. CROMATOGRAFIA N STRAT SUBIRE

Separarea aminoacizilor, peptidelor i derivailor lor pe un strat subire de adsorbant se


realizeaz n aceleai condiii ca i n cromatografia pe htie.
Separarea este ns mai rapid i puterea de rezoluie este cu un ordin de mrime superioar
celei obinute prin cromatografia pe hrtie.
Stratul cromatografic este alctuit, n general din Silicagel (Kieselgel) - un produs de
policondensare a acidului ortosilicic, gruprile active fiind resturile hidroxil.
Acest tip de gel are n compoziie un liant CaSO4 1/2 H2O, n diferite cantiti, de la 5 % la 10
% i atunci se numete Silicagel G, sau poate s nu aib CaSO4 , formnd, de asemenea
straturi stabile de 0,26 mm grosime i n acest caz se numete Silicagel H.
Pentru separarea cromatografic a aminoacizilor se utilizeaz straturi de silicagel i
celuloz. Deoarece straturile de silicagel limiteaz detectabilitatea aminoacizilor individuali, n
separarea acestor biomolecule se utilizeaz n special straturile de celuloz.
Cromatografia n strat subire cea mai uzual este cea de tip ascendent. Ea va fi realizat
ntr-un tanc de sticl , acoperit cu o plac. Solventul este plasat la baza tancului cu cel puin o
or nainte de a se ncepe separarea cromatografic. n tanc trebuie realizat o atmosfer
saturat n solventul de developare, condiie facilitat de cptuirea tancului cu o hrtie
cromatografic mbibat n solvent.
Dac aceast condiie nu este realizat, la developarea spoturilor se constat apariia
efectelor marginale : aceleai substane migreaz mai rapid la marginile plcilor dect n centrul
lor. n cazul cromatografie n strat subire exist riscul evaporrii solventului pe strat, mrindu-
se timpul necesar separrii pe o anumt distan. n cazul unui amestec de mai muli solveni,
componentele mai volatile se evapor primele , compoziia amestecului de elueni fcndu-se
pe parcursul separrii cromatografice.
Separarea cromatografic poate fi condus la temperatura camerei
(18 - 230 C), acest factor fizic avnd un mic efect asupra separrii efective. n majoritatea
cazurilor, separrile trebuie efectuate n lumin difuz, evitndu-se lumina soarelui.
Pentru analize calitative se recomand straturi cromatografice cu o grosime de 0,25
mm., n scopuri preparative straturile trebuie s aib 5 mm.

Mod de lucru
Substane - amestec de 3 - 4 aminoacizi (1mg/cm3 ap; 0,1 % )
- soluii control de aminoacizi ( 1 mg/cm3 )
- amestec de developare : butanol : acid-acetic : ap =
8 : 3 : 9 ( v/v/v );
- soluie ninhidrin 0,1 - 0,2 % n butanol sau etanol ;
- hrtie cromatografic Whatman nr.1 ( 5 / 10 cm ) sau plcu
cromatografic silicagel sau celuloz pe sticl sau fiole.
Pe o fie de htie de filtru se trage cu creionul linie paralel cu unul din capete, la o
distan de 2 cm de marginea hrtiei. Pe aceast linie (linie de strat) se aeaz cu o micropipet
cte o pictur din soluia de cercetat i din soluiile de control, din loc n loc, la circa 2 cm
interval, motivndu-se n prealabil locul fiecrei substane. Diametrul picturilor trebuie s fie
de 2 - 3 mm , iar cantitatea maxim de aminoacizi ntr-o pat, n jur de 0,03 mg.

Hrtia cu petele, uscate n prealabil se introduce n teancul cromatografic, care conine


un strat de amestec de developare de 2 - 3 mm grosime, astfel nct captul pe care au fost
pui aminoacizii s ajung n aceasta (n amestecul de elueni).

Spoturile de aminoacizi nu trebuie s intre, iniial, n amestecul de developare. Se las un


timp , pn cnd frontul solventului ajunge la 1- 2 cm de marginea superioar a hrtiei
(developarea ascendent). Se scoate hrtia, se noteaz cu creionul frontul solventului, se usuc
n etuv la 1000 C i se pulverizeaz cu soluia de ninhidrin. Hrtia sau placa astfel prelucrat
se mai introduce 10 min. n etuv la 90 0 , apoi se observ poziia i intensitatea culorilor
spoturilor aprute i se calculeaz Rf. Prin pulverizare cu o soluie de NiSO4 4 % . Se pot
proteja de decolorare cromatogramele revelate cu ninhidrin.

BIBLIOGRAFIE

1. D. Iordnescu, I.F. Dumitru, - Biochimie practic , 1988 , Univ. Buc. -Facultatea


de Bologie, geografie, Geologie.
2. S.Ghergariu, Al.Pop, L. Kdr , Lucrri practice de laborator chimic veterinar
1985 - Inst. Agronomic Cluj-Napoca.
3. G. Nemu i colab. Lucrri practice de chimie i biologie vegetal
1986 - Institutul Agronomic Cluj-Napoca.