Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Unul din solveni este apa, legat de suportul cromatografic (hrtie) si constituind cu
aceasta faza staionar. Cellalt solvent const n lichidul de eluie (un solvent organic
sau un amestec de solveni organici saturai cu ap) i constituie faza mobil .
Celuloza , sub forma unor coli de hrtie cromatografic, reprezint un suport ideal pe
care apa este absorbit i pe care se poate realiza separarea aminoacizilor i peptidelor. Un
amestec de substane este aplicat n punctul de start, pe hrtia care conine solventul de eluie
(faza mobil). Cnd acestea din urm atinge spotul se stabilete un echilibru al componentelor
amestecului ntre faza mobil i staionar (celuloza imbibat cu ap). Unele molecule prefer
faza staionar (celuloza mbibat cu ap) i rmn n aceeai poziie sau migreaz foarte lent,
n timp ce altele prefer faza mobil i migreaz rapid cu solventul de eluie. Pe parcursul unei
separri cromatografice, produsul de distribuie a substanelor dintr-un amestec, ntre cele 2
faze, este repetat de un numr mare de ori. n final componentele separndu-se n funcie de
coeficienii lor de partiie.
n principal , tehnica separrii este urmtoarea : hrtia cromatografic pe care s-a
aplicat amestecul de separat este introdus ntr-un tanc, nchis etan n care este pus solventul
de developare. Eluia este considerat ncheiat cnd lichidul a splat aproape ntreaga coal
de hrtie. Frontul solventului este marcat i dup uscarea hrtiei se procedeaz la vizualizarea
componentelor separate, printr-o reacie de culoare. Se calculeaza Rf (factorul de retenie).
Sm 1
1 unde Sm este suprafaa seciunii transversale prin faza
Ss R f
Cisteina i metionina
fiind compui instabili, nu pot constitui ca atare martori, ci trebuie mai nti oxidai la acid
cistic i respectiv la metionin - sulfon. Lng start rmne acidul cisteic apoi n ordinea
cresterii capacitii de eluie urmeaz aminoacizii. Lisina (Lys), histidina (Hys)arginina (Arg),
acidul aspartic (Asp), metionin sulfona (Met), serina (Ser), glicina (Gly), acidul glutamic
(Glu), treonina (Tre), alanina (Ala), prolina (Pro), tirozina (Tyr), valina (Val), fenilalanina
(Phe), leucina (Leu). Uneori este introdus i un spot cu Rou Neutru, un Rf identic cu cel al
leucinei, compusul care migreaza cel mai rapid.
REACIA NINHIDRINEI
Ninhidrina este un puternic agent oxidant, care reacioneaz cu toi - aminoacizii, n
domeniul de pH : 4 - 8 , cu formarea unor compui colorai n albastru violet ( purpura lui
Ruhemann). Sub aciunea oxidant a ninhidrinei are loc dezaminarea i decarboxilarea
aminoacidului, cu producerea unei grupri carbonil la - atomul de C i eliberarea de CO2 i
de NH3. n cursul reaciei, aminoacidul este dezaminat oxidativ, trecnd prin starile
intermediare de acid - iminic i de acid
- cetonic, n timp ce ninhidrina este redus la hidrindantin, care condenseaz cu NH 3
eliberat, cu formarea complexului colorat, denumit purpura lui Ruhemann :
O
OH
O O OH O O
OH H O OH
OH O
OH
O O O O
redus
O O
Mod de lucru
Substane - amestec de 3 - 4 aminoacizi (1mg/cm3 ap; 0,1 % )
- soluii control de aminoacizi ( 1 mg/cm3 )
- amestec de developare : butanol : acid-acetic : ap =
8 : 3 : 9 ( v/v/v );
- soluie ninhidrin 0,1 - 0,2 % n butanol sau etanol ;
- hrtie cromatografic Whatman nr.1 ( 5 / 10 cm ) sau plcu
cromatografic silicagel sau celuloz pe sticl sau fiole.
Pe o fie de htie de filtru se trage cu creionul linie paralel cu unul din capete, la o
distan de 2 cm de marginea hrtiei. Pe aceast linie (linie de strat) se aeaz cu o micropipet
cte o pictur din soluia de cercetat i din soluiile de control, din loc n loc, la circa 2 cm
interval, motivndu-se n prealabil locul fiecrei substane. Diametrul picturilor trebuie s fie
de 2 - 3 mm , iar cantitatea maxim de aminoacizi ntr-o pat, n jur de 0,03 mg.
BIBLIOGRAFIE