Universitatea Valahia Trgovite Specializarea Controlul i Expertiza Alimentelor

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

1. Definirea metodei de analiz.........................................................................3 2. Principiul metodei..........................................................................................5 3. Avantajele metodei.........................................................................................8 4. Dezavantajele metodei...................................................................................9 5. Aparatura utilizat........................................................................................10 6. Etapa preparativ de pregtire a probelor.................................................14 7. Descrierea metodei de lucru specifice..........................................................15 8. Rezultate furnizate.........................................................................................17 9. Interpretarea rezultatelor obinute..............................................................18 10. Aplicaii n identificarea componentelor alimentare..................................19 11. Bibliografie ....................................................................................................24

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

1.Definirea metodei de analiz

Spectrofotometria reprezint msurarea cantitativ a spectrelor de absorbie / emisie ale unei substane. Spectrofotometria este o metod optic de determinarea a concentraiilor constituenilor existeni ntr-o prob dat. Aceast metod se bazeaz pe iradierea probei de analizat cu un fascicol de radiaii electromagnetice, a crui putere radiant se micoreaz la ieirea din sistem n funcie de natura i concentraia speciilor absorbante. Substanele care absorb radiaii aparinnd domeniului vizibil se vor colora n culori complementare. Acest fapt face posibil determinarea cantitii de lumin absorbit de ctre soluie, intensitatea radiaiei transmise fiind proporional cu concentraia speciilor absorbante din soluia analizat. Un fascicol de radiaii de intensitate I0,ce strbate sub o inciden normal un strat absorbant, pierde o parte din energia sa radiant prin reflexie Ir iar o parte din aceasta este absorbit de ctre sistem Ia. Deci din intensitatea iniial numai o parte din radiaie este transmis i ea se noteaz cu It. Gradul de diminuare al intensitii radiaiei incidente este (conform legii lui Beer-Lambert) proporional cu grosimea stratului traversat i cu concentraia speciei absorbante: lg I 1 = lg 0 = kcb = E T It

Legea Beer-Lambert - exprima legatura ntre intensitatea luminii care traverseaz o soluie i concentraia soluiei respective.

n spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbia: T - este transmisia; E - este extincia .

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie T= I = 10 Cd Io 1 E = log = log T T

n fenomenele de propagare, lumina prezint, dup cum se tie, un aspect ondulatoriu, de und electromagnetic. n fenomenele de emisie, respectiv absorbie, lumina prezint un aspect corpuscular, adic se comport ca fiind format din cantiti bine determinate de energie, indivizibile, numite cuante sau fotoni. Explicaia existenei fotonilor rezid n aceea c fiecare unitate de energie radiant este emis de cte o microparticul: atom,ion sau molecul. Absorbia sau emisia unui foton este legat de trecerea prin salturi a unei asemenea microparticule de la o stare energetic posibil la alta.Pentru un astfel de salt este necesar ca energia cunatei, s fie egal cu diferenade energie dintre cele dou stri.Aceste tranziii, legate de interaciunea foton-microparticul urmeaz anumite reguli de selecie care determin ce fel de salturi de la un nivel la altul sunt permise. Pe de alt parte, o tranziie are loc numai dac sunt ndeplinite anumite condiii de interaciune cuant particul. n chimie i fizic, diferite tipuri de spectrofotometre acoper game largi ale spectrului electromagnetic: ultraviolet (UV), lumina vizibil, infrarou (IR), sau cu microunde. Spectrofotometria UV este deosebit de util n detectarea i cuantificarea substanelor incolore, n soluie.

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

2.Principiul metodei
Spectrofotometrele sunt de diferite tipuri dar se compun, n principiu, din urmtoarele dispozitive eseniale: o surs luminoas, un monocromator, un recipient cu perei transpareni, numit celul de absorbie, un detector i un dispozitiv pentru msurat i nregistrat efectele detectate. Pentru determinarea spectrelor n infrarou servesc drept surse luminoase, vergelele de oxizi greu fuzibili (Zr, Th, Ce) sau de carbur de siliciu, nclzite, prin trecerea unui curent electric, la cca. 1500C. Ferestrele celulelor de absorbie trebuie confecionate din materiale transparente pentru radiaiile din regiunea spectral respectiv, n cazul infraroului, se utilizeaz clorur de sodiu sau alte sruri. Spectrele n infrarou se determin la soluii ale substanelor n solveni transpareni pentru radiaiile respective sau la gaze aflate la presiune normal. se utilizeaz amestecuri de substane cu KBr, presate sub form de pastile (KBr este transparent pentru infrarou). Monocromatorul are scopul de a separa radiaiile emise de sursa luminoas n fascicule de raze monocromatice, pe care le dirijeaz apoi succesiv, printr-o fant, asupra celulei de absorbie. Detectorul are rolul de a transforma radiaia transmis, neabsorbit n alt form de energie. n spectroscopia n infrarou servesc drept detectoare termoelemente. Curentul produs de detector este nregistrat, obinndu-se curbe de absorbie.

Schema unui spectrofotometru 5

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie Principiul spectrofotometrului- determinarea frecvenelor la care au loc tranziii: coeficientul de extinie prezint un salt brusc pentru frecvenele cuantelor care provoac tranziii n prob. Pentru aflarea acestor frecvene se fac deci determinri de coeficieni de extinie n funcie de frecven. n principiu se folosete un calorimetru, dar n loc s se lucreze n lumin alb,se fac determinri n lumin monocromatic a crei frecven se poate varia continuu. Se utilizeaz o surs de lumin alb, de exemplu un bec cu filament, i se selecteaz pe rnd radia iile de diferite frecven e cu ajutorul unui dispozitiv numit monocromator.

n figur este prezentat schema de principiu a obinerii luminii monocromatice pentru un spectrofotometru cu monocromator cu reea.

Figura 1. Schema de principiu a unui spectrofotometru 1- surs de lumin, 2-lentile colimatoare, 3-sistem de fante, 4- sistem monocromator cu prism, 5- spaiu pentru cuvele cu soluie de analizat, 6- detector de radiaie luminoas, 7- amplificator, 8- sistem de afiare.

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie Un astfel de ansamblu (fig.1) format dintr-o surs alb, un monocromator i un calorimetru cu citire direct, constituie cel mai simplu tip de spectrofotometru. Cu ajutorul unor oglinzi mobile din monocromator se schimb n salturi foarte mici frecvena luminii selectate din radiaia total a sursei. De fiecare dat se msoar absorbia, transmisia sau extinia i se calculeaz valoarea coeficientului de extinie E. Reprezentnd grafic variaia lui E n funcie de frecven sau lungimea de und se obine o spectrogram (un spectru).

Figura 2. Corespondena tranziiilor posibile (a) cu liniile spectrale ideale (b) respectiv benzile reale(c) dintr-o spectrogram. n fig. 2 se red o astfel de spectrogram pentru cazul n care proba prezint n domeniul cercetat trei nivele de energie permise, sunt ndeplinite condiiile de interaciune i nici una din tranziii nu este interzis. Valorile nu pot fi trasate direct de aparatele nregistratoare, aflarea lor necesitnd un calcul n funcie de concentraie i grosimea de strat.

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

3. Avantajele metodei
Metoda spectrofotometric are numeroase i variate domenii de aplicabilitate, n special n analiza n urme iar n analizele tehnice metalurgice se aplic pentru determinarea elementelor de aliere din oeluri, fonte, aliaje, aplicaii biologice, medicale, clinice, de mediu, industria alimentar . permite automatizare i determinare foarte rapid; pot fi utilizate probe mici; pot fi cercetare probe complexe; prezint o sensibilitate ridicat; dau un grad mare de siguran a rezultatelor msurtorilor. precizie mare de determinare; permite obinerea de date certe; se poate aplica pentru dozarea majoritii substanelor. n cazul n care compusul nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacie chimic adecvat ntrun compus colorat ce absoarbe lumina.; folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de determinare a urmelor de substan; sunt metode rapide, prin msurarea direct, fr a fi necesar adugarea de soluie titrat. n multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea unor reactivi specifici i prin controlul strict al reaciei se poate elimina interferena ionilor strini (controlul pH-ului, lungime de und convenabil aleas, utilizarea solvenilor organici pentru extragerea complecilor colorai, utilizarea unor reacii redox etc.). prin metodele spectrofotometrice se poate pune n eviden punctul de echivalen ntr-o metod titrimetric (titrare spectrofotometric).

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

4. Dezavantajele metodei
Nu determin nemetalele - n prezent, aceast metod nu a fost gsit util pentru determinarea direct de elemente nemetalice, cum ar fi halogenurile, oxigenul i azotul; Nu analizeaz direct probele solide i gazoase - o alt problem n absorbia atomic, este faptul c este foarte util pentru analiza probelor de lichid, dar nu a fost utilizat cu succes pentru analiza direct de solide sau gaze; Analizeaz doar un element pe rnd - echipamentul care este disponibil n prezent este construit pentru a determina doar un element pe rnd. Acest lucru nu ar constitui o problem, dac un numr de probe trebuie s fie analizate pentru un singur element. Dar, n cazul n care o prob trebuie s fie analizat de o serie de elemente, ar putea aprea o dificultate. Fiecare element trebuie s fie determinat separat; este necesar o etalonare iniial sau continu a aparatului; sensibilitatea i precizia depind de aparatura sau metoda chimic de etalonare; precizia final se afl adesea n domeniul 5%; costul iniial i pentru ntreinerea echipamentului este ridicat; intervalul de concentraie este limitat (msurtori relative); n mod obinuit, necesit spaiu destul de mare; implic un personal cu o pregtire special; timp mai ndelungat pentru obinerea rezultatelor; necesit un numr mre de determinri pentru o interpretare statistic; d indicaii asupra unei singure caracteristici.

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

5. Aparatura utilizat
La modul cel mai general, un spectrofotometru este alctuit dintr-o surs de radiaii, o fant de intrare reglabil care modific fluxul de lumin care vine de la surs, un element dispersiv (prisma sau reea dar mai des se folosete o reea), mai multe oglinzi care asigur direcionarea fasciculului de lumin, departamentul probelor i elementul de msur (un fotodetector i un amplificator). Adugnd diverse accesorii, spectrofotometrele pot efectua i alte tipuri de msurtori cum ar fi cele de reflexie, difuzie, fluorescen etc. Spectrofotometrele pot fi cu dou fascicule sau cu un singur fascicul. Spectrofotometrul cu un singur fascicul aceste spectrofotometre au un singur fascicul luminos care trece pe rnd prin cuva cu soluie de referin i prin cuva cu soluie de analizat. Spectrofotometrul VSU-2G ultravioletul apropiat la infrarou. Schema aparatului este reprezentat n figura 1. lucreaz n domeniul 200-1600 nm, de la

10

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Radiaia care vine de la sursa 1 (un filament care emite radiaie prin nclzire) ajunge, dupa reflexiile pe oglinzile 2, 3, 4, pe fanta de intrare 5, care poate fi reglat din exteriorul aparatului. Fascicolul divergent este transformat n fascicul paralel prin reflexie pe oglinda concava 6 i ajunge apoi la re eaua de difrac ie prin reflexie 7. Fasciculul, care este acum separat dup lungimile de und, este din nou reflectat de oglinda concava 6 care l transform ntr-un fascicul convergent care ajunge la fanta de ieire (nereglabil) 8 i de acolo, cu ajutorul lentilei 9, la cuvele cu soluii 10. Dup care fasciculul emergent ajunge pe un fotodetector 11 legat direct la calculator. Se citete o tensiune care este proporionala cu fluxul fasciculului. O caracteristica importanta a unui spectrofotometru este lrgimea benzii pasante. Ea se definete ca lrgimea domeniului spectral care iese din monocromator la o lungime de unda dat. Datorit lrgimii finite a fantei de ieire, aceasta este traversat de o band de lungimi de und. Distribuia energiei luminii, n funcie de lungimea de unda prezint aproximativ forma unui triunghi al crui vrf se situeaz la lungimea de und marcat pe scal. Spectrofotometrul cu dublu fascicul este un aparat automat construit dup principiul monofascicul, care s nregistreze zeci de puncte pe secund, ar fi nevoit s alterneze foarte repede cuva de dizolvant cu cea de soluie, operaie greu de rezolvat din punct de vedere mecanic i care ar necesita cuve perfect etane. De aceea este mult mai raional s se menin cuvele pe loc i s se treac, simultan sau succesiv, cte un fascicul de lumin prein fiecare cuv, realiznd astfel aparate cu dublu fascicul .

11

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie Schema de principiu a unui asemenea dispozitiv este redat n figura 2.

Fig.2. principiul spectrofotometrului cu dublu fascicul S surs; M monocromatro; E1, E2, E01, E04- motoare electrice; O1, O4 oglinzi mobile; O2, O3 oglinzi fixe; C1, C2 cuve; R receptor; A amplificator; K compensator; Er motor reversibil; Di dispozitiv de nregistrare.

Sursa S trimite un fascicul de lumin alb pe fanta de intrare a monocromatorului M. Motoraul E1 schimb continuu elementele mobile ale monocromatorului, astfel nct din monocromator iese o radiaie monocromatic a crei frecven se schimb uniform n timp.La un moment dat radiaia cade pe oglinda mobil O1, rotir de electromotorul E01 cu circa 10 rot/sec. Oglinda fix O2 schimb direcia razei cu 900 i o trece n cuva cu soluia de cercetat. ntru-ct n cuva C2 se gsete dizolvat i substan a de cercetat, aceasta va introduce o absorbie suplimentar, iar ca urmare pe receptor vor cdea alternativ un fascicul mai intens i unul mai slab.De la receptor semnalele sunt trecute la amplificatorul A, care este informat printr-un sistem de sincronizare de poziiile celor dou oglinzi n fiecare moment. Impulsurile amplificate sunt trecute la motorul reversibil Er, care mpinge n drumul fasciculului mai intens o pan de compensaie K, n form de

12

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie pieptene.Cu ajutorul penei compensatoare se reduce intensitatea radiaiilor de comparaie pn la valoarea celor care au trecut prin cuva cu soluie, moment n care motorul Er se oprete. Ajundndu-se apoi ntr-un domeniu spectral n care substan a absoarbe i mai intens,pana este mpins i mai adnc n drumul radia iilor de comparaie de ctre motorul Er. n acest moment faza impulsurilor de radiaie de la receptorul R se inverseaz, motoraul Er pornete n sens invers, trgnd pana n afar pn la restabilirea echilibrului.Solidar cu compensatorul K se mic i o peni nregistratoare care nscrie pe un tambur cu hrtie o diagram. Spectrofotometrul cu ir de fotodiode una din realizrile cele mai importante n domeniul spectrofotometriei o reprezint folosirea detectoarelor ir de fotodiode, n locul detectoarelor clasice. Aceste tip de detector permite preluarea spectrului UV-VIS-NIR n acelai timp nefiind necesar scanarea secven ial n timp a tuturor lungimilor de und.

n figura de mai sus este prezentata un spectrofotometru UV-VIS cu ir de fotodiode. Se remarc n principal faptul c acest spectrofotometru nu are nici un element mecanic sau electromecanic n micare aa cum au spectrofotometrele clasice cu scanare. La acest tip de spectrofotometre lumina se desparte n lungimile de und individuale abia dup ce trece prin cuv. Pentru fiecare lungime de und individual dorit exist ca detector al intensitii luminoase absorbite cte o fotodiod individual.

13

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

6. Etapa preparativ de pregtire a probelor

Efectuarea unei determinri cantitative (dozri) spectrofotometrice sau elaborarea unei noi metode de dozare cuprinde urmtoarele etape de lucru: a) Studiul reaciei chimice ce st la baza determinrii (reacie de culoare) implic: alegerea reactivului de culoare; a solventului; viteza de apariie a culorii; stabilitatea n timp a speciei colorate; influena diferiilor factori asupra reaciei de culoare (pH, temperatur, ordinea adugrii reactivilor, prezena speciilor strine, interfereni); sensibilitatea reaciei de culoare; domeniul optim de concentraie. b) Studiul aspectului fizic al determinrii: alegerea lungimii de und la care compusul colorat prezint absorban maxim i a metodei de msurare. c) Verificarea valabilitii legii Lambert-Beer. d) Construirea curbei de etalonare. e) Msurarea absorbanei probei de analizat (prelucrat n aceleai condiii cu etalonul) i deducerea valorii concentraiei de pe curba de etalonare. Sensibilitatea metodei spectrofotometrice depinde de doi factori: sensibilitatea reaciei de culoare ; sensibilitatea nregistrrii (observrii) diferenelor mici de absorban. Sensibilitatea reaciei de culoare este proporional cu coeficientul molar de extincie al substanei ce absoarbe. Proba supus analizei se prelucreaz corespunztor (tocare, marunire, mojarare, omogenizare) n aa fel nct s se realizeze o mas uniform i omogen. n timpul prelucrrii trebuie exclus orice fel de impurificare. Proba astfel prelucrat se pstreaz n pungi de plastic bine nchise.

14

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

7. Descrierea metodei de lucru specifice

Modul de lucru pentru determinarea concentra iei unei solu ii de acridinorange folosind spectrofotometrul Materiale necesare:

spectrofotometrul Helios (fig1.); soluia de referin: ap distilat; soluii de cercetat: soluii de acridin-orange (AO) de concentraii cunoscute i de concentraie necunoscut: 2, 4, 8, x (AO este o substan fluorescent cu dou maxime de absorbie: 494 nm pt monomer i 465 nm pt dimer/ apare n cazul soluiilor concentrate);

cuve pentru spectrofotometru; linie; marker; hrtie de filtru;

Fig.1 Spectrofotometrul HELIOS Efectuarea msurtorilor: 1. Se pornete spectrofotometrul (butonul "ON"); se ateapt 5 min nainte de a ncepe msuratorile, pn cnd lampa aparatului se nclzete i temperatura acesteia devine constant;

15

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie 2. Se selecteaza metoda de nregistrare: Absorban (A), de la butonul 3; 3. Se selecteaza lungimea de unda de la butoanul 1 (regiunea central a aparatului); se va ncepe cu lungimea de unda 440nm; 4. Calibrarea spectrofotometrului:

o cuv se umple cu ap distilat pn n dreptul liniei orizontale; se noteaz pe cuv tipul de soluie pe care l conine; se deschide capacul spectrofotometrului; se introduce cuva cu ap distilat n spectrofotometru, astfel nct pereii transpareni ai cuvei s permit trecerea neperturbat a luminii prin cuva cu soluie;

se nchide capacul spectrofotometrului; se regleaz transmitana automat prin apsarea butonului "Zero"; se ndeprteaz cuva cu ap distilat; 5. Se noteaz pe cuve numele soluiilor ce vor fi analizate: soluiile 2, 4, 8,

x de AO i se umplu cuvele cu solu iile de cercetat; 6. Se introduc una cte una cuvele cu soluiile de AO (2, 4, 8, x) n spectrofotometru i se citete absorban a pe ecranul spectrofotometrului pt fiecare soluie n parte; 7. Valorile absorbanelor se noteaz ntr-un tabel. Este posibil ca aceste valori s fie nregistrate i pe hrtie prin apsarea butonului "Print"; 8. Se repet etapele anterioare pentru o alt lungime de und, deoarece se vor efectua msurtori din 10 n 10 nm de la 440 540 nm; 9. Se reorganizeaz locul de lucru; 10. Se oprete spectrofotometrul, iar techerul se scoate din priz.

16

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

8. Rezultatele furnizate
Calcularea concentra iei necunoscute a solu iei de AO: 1. Se traseaz un grafic A = f(); 2. Se traseaz cele patru curbe pentru fiecare soluie de AO (2, 4, 8, x); Obs: toate cele patru curbe se traseaz pe acelai grafic; 3. Se selecteaz lungimea de und corespunztoare maximului de absorbie pentru toate cele patru soluii de AO; 4. Se calculeaz concentraia necunoscut a soluiei de AO - dou metode: a) calcularea concentraiei folosind metoda grafic:

se traseaz un grafic A = f(c) cu valorile absorbanei pentru maximul se determin concentraia necunoscut a soluiei de AO prin b) calcularea concentraiei prin metoda matematic (metoda celor mai mici ptrate):

de absorbie al soluiilor de AO;

intrapolare;

se scrie ecuatia dreptei de regresie: Y=a+bX A = a + b cx A = absorbana; cx = concentraia necunoscut

se calculeaz parametrii a i b cu ajutorul unui program pentru se nlocuiesc n ecuaia dreptei de regresie valorile parametrilor a i b; se calculeaz concentraia necunoscut a soluiei de AO; 5. Se compar valoarea concentraiei obinut prin metoda grafic cu valoarea

calcularea parametrilor dreptei de regresie;

obinut prin metoda matematic; 6. Se emit una dou concluzii.

17

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

9. Interpretarea rezultatelor obinute

n funcie de masa probei, volumul final al soluiei, softul aparatului prelucreaz aceste date i afieaz direct rezultatul. Se ia n considerare media celer dou determinari, dac sunt ndeplinite condiiile de repetabilitate. r-repetabilitatea : valoarea sub care diferena absolut dintre rezultatele a dou teste separate obinut n condiii de repetabilitate( de exemplu : aceeai prob, acelai operator, acelai aparat, acelai laborator i interval scurt de timp) se situeaz n limitele unei probabiliti specifice ( n principiu 95%), astfel r= 2.8xs(r). s(r) deviaia standard, calculat din rezultatele obinute n condiii de repetabilitate.

18

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

10. Aplicaii n identificarea componentelor alimentare

1. Identificarea coloran ilor alimentari prin metoda spectrofotometric Aditivii alimentari sunt ncorporai n produsele alimentare cu scopul de a mbunti calitile lor senzoriale . Culoarea este primul senzor de calitate n funcie de care fiecare aliment este analizat, iar calitatea i aroma alimentelor este strans asociat cu aceasta. Coloran ii sunt ingrediente foarte importante n multe produse, cum ar fi produsele de patiserie, gustri i buturi, fr de care acestea ar fi incolore iar aspectul neatrgtor. Concentraia acestor aditivi trebuie s fie atent controlat, deoarece pot avea diverse efecte duntoare asupra sntii umane. Cu toate acestea, n majoritatea alimentelor se adaug 2 sau 3 colorani. Din acest motiv i innd seama de ali factori, precum economie i rapiditate, multe componente sunt analizate cu ajutorul spectrofotometriei care poate fi o metoda pentru determinarea prezenei coloranilor n alimente. Mod de lucru: Din proba de analizat se cntresc cu precizie 25 g i se mojareaz, apoi se transfer ntr-un balon cotat de 50 ml, se trateaz cu 25 ml soluie tampon de acetat pentru a se aduce proba la un pH de 4,5 i apoi se nclzete la 700 C, timp de 10 minute. Se rcete solu ia i se aduce balonul la semn cu solu ie tampon de acetat, se amestec bine i se filtreaz. Proba se introduce n spectrofotometru i se msoar lungimea de und la 481,7 nm iar apoi se repet la 445,5 nm, dup care spectrofotometrul printeaz graficul curbelor de calibrare. Rezultate i discuii Spectrele de absorbie (de ordin zero) ale probei la lungimi de unda ntre 300-550 nm sunt prezentate n figura 1.

19

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

n concluzie, metoda propus este util pentru analiza coloranilor alimentari din amestecuri, fie n form pur sau n buturi pulbere. Teste de rutin pot fi efectuate prin msurarea spectrului simplu, dup o extracie direct. Spectrofotometria mai este folosit i pentru identificarea fierului din alimente, a coninutului de vitamine, coninutului de zinc,coninutului de nitrii. 2. Identificarea concentra iei de amoniac din ap prin metoda

spectrofotometric Aceasta metoda este aplicat pentru determinarea coninutului de amoniac din ape (de exemplu apa de precipitaii) pentru domeniul de concentraii 0,04 2,0 mg NH4/L. Principiul metodei ntr-o soluie alcalin (pH 10,4-11,5) ionii de amoniu reacioneaza cu hipocloritul formnd monocloramina. n prezena fenolului i a unui exces de hipoclorit, monocloramina va forma un compus albastru, indofenol, reacia fiind catalizata de nitroprusiatul de sodiu. Concentraia de amoniac este determinat spectrofotometric la 630 nm.

20

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie Reactivi si aparatura Toate substanele chimice trebuie s fie de puritate analitic. Apa utilizat pentru diluare i spalare trebuie s fie dublu-distilat sau deionizat i apoi distilat. Fenol (C6H5OH); Nitroprusiat de sodiu (Na2Fe(NO) (CN)5x2H2O); Hidroxid de sodiu (NaOH); Solutie de hipoclorit de sodiu (NaOCl) 1M - se prepara o solutie ce contine aproximativ 3,5% clor activ (35 g/L) n NaOH 0,1M; Clorura de amoniu (NH4Cl); Tiosulfat de sodiu (Na2S2O3); Reactiv A: se dizolva 3,5 g fenol si 0,040 g nitroprusiat de sodiu n 100 mL apa. Solutia se pastreaza n frigider, la ntuneric. n cazul n care culoarea solutiei devine verde, trebuie preparata o alta solutie; Reactiv B: se dizolva 1,8 g hidroxid de sodiu ntr-un volum mic de apa ntr-un balon cotat de 100 mL. Se adauga 4,0 mL solutie de hipoclorit de sodiu 1 M si se aduce la semn cu apa. Solutia se pastreaza n frigider, la ntuneric. Daca solutia este pastrata un timp mai ndelungat (cteva saptamni) concentratia acesteia trebuie verificata prin titrare cu o solutie de tiosulfat de sodiu; Solutie standard de amoniu I, 100 mg NH4/L: clorura de amoniu trebuie uscata timp de o ora la 100 C. Se dizolva apoi 0,2965 g sare n apa ntr-un balon cotat de 1000 mL. Se dilueaza pna la semn cu apa. Aceasta solutie este stabila pentru sase luni atunci cnd este pastrata n frigider; Solutie standard de amoniu II, 4 mg NH4/L: cu ajutorul unei pipete, se transfera 20,0 mL de solutie standard de amoniu I ntr-un balon cotat de 500 mL. Se aduce la semn cu apa. Aceasta solutie standard de amoniu ct si solutiile etalon de amoniu folosite pentru obtinerea curbei de calibrare trebuie sa fie proaspat preparate; Spectrofotometru dotat cu o celula de drum optic de 10 mm; Baie de apa termostatata, 50 C; Eprubete: 30 ml; Baloane cotate: 10, 500 si 1000 ml; Pipete: 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 10,0; 20,0; 25,0; 50,0 ml;

21

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie Micropipeta: 250 l. Calibrarea Prepararea soluiilor etalon pentru curba de calibrare: Se transfer n baloane cotate de 100 ml: 0,0; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 25,0 si 50,0 m soluie standard de amoniu II. Se aduce la semn cu ap. Concentraiile acestor soluii sunt: 0,00; 0,04; 0,08; 0,2; 0,4; 1,0 si 2,0 mg NH4/L. Se transfer 5,0 ml din fiecare dintre aceste soluii standard i 5,0 ml ap n eprubete de 30 ml. Se adaug n fiecare eprubeta cte 250 l reactiv A cu ajutorul unei micropipete i se amestec bine. Se adaug 250 l reactiv B cu ajutorul unei micropipete i se amestec din nou bine. Se acoper eprubeta cu un material inert. Eprubetele sunt inute timp de 2 ore ntr-o baie de ap la 50C. Se rcesc soluiile la temperatura camerei i se transfer n celula de 10 mm. Se msoar absorbana la 630 nm. Se realizeaz o curb de calibrare prin reprezentarea absorbanelor soluiilor standard n funcie de concentraia de amoniu. Se traseaz noi curbe de calibrare pentru fiecare serie de probe. Pentru verificarea coninutului de amoniu n reactivi, se realizeaz o citire fotometric a probei martor (0,00 mg NH4/L) fa de ap. Absorbana nu trebuie s depeasc 0,020 unit i. Mod de lucru Se transfer 5,0 ml de proba i 5,0 ml de ap ntr-o eprubet de 30 ml. Se procedeaz conform instruciunilor prezentate la punctele 2 i 3 de mai sus. Se transform citirile spectrofotometrice ale probei n mg NH4/L folosind curba de calibrare. Concentraia poate fi exprimat n mg N/L prin multiplicarea rezultatului obinut cu 0,778. Probele ce conin mai mult de 2,0 mg NH4/L trebuiesc diluate. Cu ajutorul unui echipament corespunzator, metoda indofenolului poate fi automatizata.

22

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie 3. Analiza spectrofotometric a cobaltului Pentru etalonarea spectrofotometrului n cazul determinrii cu sulfat de Co se prepar o soluie 0.2M dizolvndu-se 5.831 g n ap i aducndu-se la cot ntr-un balon cotat de 100 ml. Din aceast soluie se prepar prin diluare soluii 0.04M, 0.08M, 0.12M, 0.16M n baloane de 25ml. Algoritmul de lucru 1. Se conecteaz aparatul la reea; 2. Se alege lungimea de und prin rsucirea butonului ce comand lungimea de und la valoarea 425 nm; 3. Se alege deschiderea fantei; se recomand deschiderea cea mai mic; 4. Se regleaz punctul 0 transmitan (1 extincie) prin deplasarea comutatorului n poziia 0; n acest caz se obtureaz complet fasciculul luminos; se regleaz punctul 0 folosind butonul 0 de calibrare; 5. Se regleaz punctul de 100 transmitan (0 extincie) folosind proba martor cu ap distilat; menionm n cazul soluiilor cu mai muli ioni, se folosete o prob martor care s conin toi ionii soluiei de analizat, mai puin cei ai Co; se rotete butonul 1 de reglare pn cnd acul se deplaseaz la valoarea 100 transmitan (0 extincie); 6. Se consider soluia cu concentraia de 0.2M. Se introduce n cuva spectrofotometrului cu ajutorul unei pipete de 2ml i se introduce n spectrofotometru; se noteaz valoarea absorbanei; 7. Se repet paii 1-6 pentru valorile lungimii de und de la pasul 2 urmtoare: 440nm, 455 nm, 470 nm, 480 nm, 490 nm, 500 nm, 510 nm, 520 nm, 530 nm, 550 nm, 565 nm, 580 nm; 8. Se reprezint grafic n coordonate Extincie = f(); se stabilete maximul curbei; din desen se extrage valoarea corespunztoare a lungimii de und; 9. Se fixeaz lungimea de und la aparat la valoarea gsit pentru maxim; 10. Se regleaz din nou punctul de 0 i 100 (paii 4 i 5); 11. Pentru fiecare din soluiile 0.04 M, 0.08 M, 0.12 M, 0.16 M, 0.2 M se citete valoarea extinciei pentru lungimea de und fixat; 12. Se interpoleaz liniar; aceasta constituie dreapta de etalonare a spectrofotometrului pentru ionii de cobalt;

23

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

1. Iuliu Pogany Metode fizice n chimia organic, Editura tiin ific, Bucureti, 1972 (pag. 69-77, 178-185); 2. Lorentz Jntschi Chimie Fizic. Analize Chimice i Instrumentale , Editura AcademicDirect, 2004 (http://ph.academicdirect.ro); 3. Lorentz Jntschi ,Sorana Bolboac - Analiz Chimic i Instrumental Aplicat, Editura AcademicDirect (http://ph.academicdirect.ro), ( pag. 40-42); 4. www.umftgm.ro/old/laborator/LP_2.pdf. 5. www.hydrop.pub.ro/Spectrofotometrul.pgf 6. http://www.fizica.unibuc.ro/fizica/studenti/cursuri/doc/DBejan/spectrofot omtru%20uv-vis%20VSU-2G.pdf 7. http://www.fia.usv.ro/avizier/files/cursuri/CURS_absorbtie_moleculara.pdf 8. http://www.umfiasi.ro/atdoc/Doctorate/Cursuri/Metode-analiticeperformante-cercetarea-farmaceutica.pdf 9. sites.google.com/site/biophysicsumfcd/didactic/biofizica-medicala/lucraripractice2/spectrofotometrul 1 10. http://www.scritube.com/geografie/ecologie/Determinareaspectrofotometric 74245.php

24