Metode spectrofotometrice in controlul medicamentelor

Spectrofotometria este o metoda optica spectral (spectrofometria IR, UV-VIS si cu raze X)

 Metodele optice nespectrale : refractometria si polarimetria s.a.

 Metodele optice spectrale se bazeaza pe interactiunile dintre materie si radiatiile
electromagnetice.

Proprietatea substantelor de a absorbi selectic radiatiile electromagnetice sta la baza

spectrofotometriei de absorbtie si este folosita pentru identificarea, determinarea puritatii ,
dozarea substantelor medicamentoase.

Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicule de radiatii continue prin substanta
de analizat (care poate absorbi o parte din energia acestuia).

Cantitatea de energie absorbita este in functie de structura si de numarul de molecule si de

atomi al substantei cu care interactioneaza fasciculul de radiatii.

O radiatie electromagnetica se caracterizeaza prin :

- Lungimea de unda ( λ) , exprimata in nm, A , milicroni/ mµm = distanta liniara dintre

doua maxime successive ( 1nm = 1mµm =10A = 10−9 m)
- Frecventa (υ) : numarul de unde pe unitatea de timp ; exprimata in cm−1 sau kayseri (1
kayser = 1 cm−1 )

Functie de lungimea de unda, radiatiile se grupeaza in domenii spectral ; pentru

armonizarea terminologiei , Comitetul Reunit pentru Nomenclatura in Spectroscopie Aplicata , a
definit domeniile spectral ,astfel :

- Spectrofotometria in UV (pana la 380 nm ) – FR X : 185-400nm

- Spectrofotometria in VIS (380 – 780 nm) –FRX : 400-800 nm
- Spectrofotometria in IR (peste 780nm) – FRX : peste 800 nm
  Radiatiile ce apar la valori mici ale lungimilor de unda sunt considerate periculoase : raze
gamma, raze X , UV.
 Radiatiile ce apar la valori mari ale lungimilor de unda sunt considerate putin
periculoase : radiatiile IR, microundele , undele radio.

Ex: cuptoarele cu microunde sunt reglate pe frecventa care determina moleculele de apa sa se
roteasca; datorita frecarii dintre moleculele de apa si celelalte molecule din alimente, acestea se
incalzesc.

Radiatiile :

- Reprezinta un factor permanent al mediului inconjurator actionand atat sanogen , cat si

pathogen
- In linii generale, efectele biologice sunt cu atat mai pronuntate cu cat energia radiatiei
este mai mare.

Radiatiile ultraviolete

In mediul de viata al omului gasim radiatii ultraviolet cu lungimea de unda cuprinsa intre
200 si 400nm ,care provin atat din surse natural,cat si din surse artificial.

Radiatiile cu lungimea de unda sub 200nm nu au importanta biologica ,fiind absorbite

rapid in aer (UV de vid).

Clasificarea radiatiilor ultraviolet :

UVA : 320-400 nm – efect pigmentogen

UVB : 280 -320 nm – efect eritematogen

UVC : 200 – 280 nm – efect germicid ( in piele se absorb in stratul cornos, insa cu
puternic efect de distrugere a celulelor neprotejate – de unde actiunea intense de distrugere a
microorganismelor (UV-bactericid). Mai sunt denumite si radiatii germicide, fiind capabile sa
distruga organismele unicelulare. Aceste radiatii component ale razelor solare sunt ,din fericire,
retinute de straturile atmosferice ).

Spectrul
electromagnetic cuprinde
toate tipurile de radiatii,
de la radiatiile X utilizate
in spitale, la undele
radio ,cat si microundele
utilizate in domeniul
alimentar.

Ochiul uman are posibilitatea sa detecteze doar o parte a spectrului electromagnetic.

Starile energectice ale moleculei

 Moleculele pot exista in anumite stari sau nivele de energie ,starea de energie cea mai
joasa numindu-se stare fundamentala ,spre deosebire de starile de energie mai ridicate,
stari excitate.
 Energia absorbita trebuie sa corespunda diferentei de energie dintre 2 nivele energetic
posibile ale molecule , pentru ca tranzitia sa aiba loc ,de unde si denumirea de energie de
tranzitie.
 Spectre de absorbtie in domeniul UV si VIS , numite si spectre electronice ,se
datoreaza tranzitiilor dintre nivelele energetic ale starilor electronice ale moleculei.
 Spectrele de absorbtie in domeniul IR se datoreaza tranzitiilor de rotatie , vibratie si
rotatie-vibratie ale molecule.

 Atunci cand lumina alba (lumina policromatica , care contine tot spectrul de lungimi de
unda , din regiunea VIS) trece printr-un obiect, acesta va absorbi anumite lungimi de
unda, restul radiatiilor fiind transmise si pot fi percepute drept culoare.
 molecula poate inmagazina energie sub forma de energie de translatie,energie de rotatie,
energie de vibratie sau sub forma de tranzitii electronice.
 La originea tranzitiilor electronice stau gruparile cromofore care include diverse tipuri
de electroni.
 Cromoforii sunt grupe de atomi existente in anumite molecule, care absorb radiatii de o
anumita lungime de unda, producatoare de culoare.
 In moleculele organice exista si auxocromi ,care sunt grupe ce nu absorb radiatii, dar
modifica absorbtia cromoforilor de care sunt legati sau altfel spus, lungimea de unda la
care absorb cromoforii si intensitatea maximului de absorbtie.

Grupari saturate de atomi, care atasate unui cromofor ( ex. –OH, -NH2) modifica
absorbtia/ auxocromi.
  Deplasarea batocroma (spre rosu)/ deplasarea maximului de absorbtie la lungimi de unda
mai mari.
 Deplasarea hipsocroma (spre albastru) / deplasarea maximului de absorbtie la lungimi de
una mai mici.
o Efect hipocrom = scaderea intensitatii absorbtiei
o Efect hipercrom = cresterea intensitatii absorbtiei

SPECTROFOTOMETRIE IN ULTRAVIOLET SI VIZIBIL

Dozarile spectrofotometrice in domeniul UV si VIS se bazeaza pe masurarea luminii

absorbite atunci cand este respectata legea Bouguer- Lambert – Beer ,care stabileste relatia dintre
lumina absorbita ,structura si concentratia in substanta de analizat a solutiei si grosimea stratului
absorbant, pentru o anumita lungime de unda exprimata in nanometri.

-Σ · c · I

I = I0 · 10
In care :

- I = intensitatea luminii transmise

- I0 = intensitatea luminii incidente
- Σ = constanta caracteristica fiecarei substante
- C = concentratia in substanta de analizat a solutiei (%m/V)
- I = grosimea stratului absorbant (in cm)

Transmitanta/transmisia (T) este raportul dintre intensitatea luminii transmise si

intensitatea luminii incidente. T= I/ I0.

Absorbanta (A) (extinctia, densitatea optica) unei solutii este logaritmul zecimal al
inversului transmitantei (T) , respective logaritmul zecimal al raportului dintre intensitatea
luminii incidente (I0) si intensitatea luminii transmise (I) si este proportional cu concentratia in
substanta de analizat a solutiei (c) si cu grosimea stratului absorbant (I).

Absorbanta specifica / extincita specifica ( A11 %cm) la o anumita lungime de unda

reprezinta absorbanta corespunzatoare unui strat de solutie cu grosimea de 1 cm care contine un
gram de substanta in 100 ml si este o constanta caracteristica fiecarei substante.

Cunoscand valoarea absorbantei se poate calcula concentratia in substanta de analizat

conform formulei :

A
C=
A 11 %cm
 Pentru stabilirea puritatii unei substante se poate efectua raportul absorbantelor , adica
Aλ1/Aλ2 sau diferenta absorbantelor la 2 lungimi de unda diferite, Aλ1 x Aλ2.

Spectrele de absorbtie in UV si VIS se obtin graphic prin reprezentarea absorbantei sau

a transmitantei in functie de lungimea de unda.

Absorbanta in functie de lungimea de unda

Ca si aparatura utilizata : Spectrofotometrul de absorbtie UV-VIS pentru inregistrarea

spectrelor electronice, compus din :

- Sursa de radiatii
- Un sistem de dispersie combinat cu un monocromator
- Cuve, suportul pt cuve
- Detectorul
- Amplificatorul
- Inregistratorul.
 Sursa de radiatii este un bec cu filament de wolfram pentru domeniul VIS si o lampa de
hidrogeniu sau deuterium pentru UV.

Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla penntru domeniul VIS si din cuart
pentru domeniul UV.

Pentru determinarile spectrofotometrice se folosesc 2 cuve identice , una pentru solutia

substantei de analizat/ solutia proba si o cuva pentru lichidul de compensare (constituit din
solventul sau amestecul de solvent si reactivii folositi la prepararea probei).

Schema bloc a unui spectrofotometru UV-VIS (nu trebuie) :

Concentratiile solutiilor se aleg astfel incat valorile absorbantelor sa fie cuprinse inrte 0,3
si 0,7 intre care se obtine o precizie satisfacatoare a determinarilor.

In monografiile respective se prevede concentratia solutiilor, natura solventului si atunci

cand este necesar conditiile de pH in care se efectueaza determinarile.
 Daca in monografia respective nu se prevede lichidul de compensare determinarea se
efectueaza folosind ca lichid de compensare solventul de la prepararea solutiei proba.

Inaintea inceperii determinarii se face o etalonare a aparatului folosind o solutie de

K2Cr2O7 (s.r.) (60mg K2Cr2O7 dizolvat in H2SO4 0,005 mol/l in balon cotat la 1000 ml) , la
care se cunosc valorile absorbantelor corespunzatoare unui strat de solutie cu grosimea de 1cm.

- λ=235 nm – corespunde A = 0,745 +/- 0,01

- λ=257 nm – corespunde A = 0.870 +/- 0.01
- λ=313 nm – corespunde A = 0.290 +/-0.01
- λ=350 nm – corespunde A = 0.645 +/- 0.01

Inregistrarea spectrelor se face pe solutii ale analitilor, in diferiti solvent.

Alegerea solventului potrivit este o problema deosebita , deoarece solventul nu trebuie sa

absoarba in regiunea spectral folosita pentru determinarea analitului.

Modificarea spectrului de absorbtie a unui compus aflat in solutie de catre solventul folosit
, se numeste solvatocromie.

In general, solventii nepolari prezinta cele mai mici efecte de interactive, in timp ce
solventii polari determina modificari evidente ale spectrului de absorbtie.

Pentru determinarile spectrofotometrice UV-VIS , principalii solvent utilizati sunt : apa,

metanolul, benzene, chloroform, toluene, xilen , hexan, ciclohexan, dioxin, adica solvent
incolori.

Inregistrarea spectrelor este una din problem esentiale in detectia si dozarea substantelor
medicamentoase, prin reprezentarea grafica a absorbantei/ transmitantei , functie de lungima de
unda; spectru obtinut contine informatii calitative si cantitative.

Aplicatii ale spectrofotometriei in controlul medicamentelor

Analiza calitativa/Identificare
 Identificarea substantelor se face dupa curba de absorbtie , prin comparative cu a unei
substante de referinta, pe baza numarului de maxime si minime de absorbtie si a lungimii de
unda a acestora.

Cu cat aspectul are mai multe maxime si minime , cu atat identificarea este mai sigura.

Determinarea trebuie completata cu teste fizice si fizico-chimice, suplimentare,

deoarece spectrul singur nu constituie , in toate cazurile, un mijloc sigur de identificare.

Ex: spectrul de absorbtie in UV al clorhidratului de oxitetraciclina in HCl 0,01N prezinta 2

maxime la 268nm si 353nm, iar extinctia solutiei 0,001%, masurata in cuve de 1cm , este la
268nm : 0,37- 0,40 , iar la 353nm: 0.27-.029.

Determinarea puritatii

Proba de identificare a produsului reprezinta de cele mai multe ori si un test de puritate.

Se poate efectua raportul absorbantelor sau diferenta, la doua lungimi de unda apropiate
(Aλ1/Aλ2 sau Aλ1 x Aλ2).

Ex: pentru ciancobalamina , spectrul UV are 3 maxime : la 278, 361 si 550 nm; in acest caz,
conditia de puritate pentru o solutie apoasa 0.05% este data de rapoartele :

- E361/E278 trebuie sa fie cuprins intre 1.6 – 1.9

- E361/E550 trebuie sa fie cuprins intre 2.8 – 3.4

Analiza cantitativa

Etapele analizei cantitative

Alegerea solventului : solventii utilizati in spectroscopie trebuie sa solubilizeze proba ,sa

fie transparent pentru domeniul de lucru sis a aiba o puritate avansata.
 Pentru fiecare solvent, exista o lungime de unda limita de la care se poate folosi; ex:
etanol de la 205, methanol de la 210nm, chloroform de la 245, benzene de la 280, samd.

Alegerea lungimii de unda : se face prin trasarea curbei care arata variatia absorbantei
(A) functie de lungimea de unda λ.

Se verifica respectarea legii Lambert-Beer prin inregistrarea variatiei absorbantei in

functie de concentratie.

- Se prepara solutii de diferite concentratii (C1-C6) cu substanta etalon si se citesc

absorbantele (A1-A6) solutiilor la spectrofotometru;
- Cu valorile absorbantei (A), se traseaza curba etalon/dreapta de calibrare, liniara.

Determinarea concentratiei

a. Cu ajutorul curbei etalon : se prepara cel putin 6 solutii etalon de concentratii diferite,
cunoscute, se citesc adsorbantele si se face curba etalon ; apoi se citeste absorbanta
substantei de analizat si prin interpolare se determina concentratia.
b. Daca se utilizeaza absorbanta specifica ( A11 %cm )
A
C=
A 11 %cm
c. Daca nu se utilizeaza absorbanta specifica, concentratia se poate determina prin metoda
standardului extern.
 Prezentarea modului de setare a parametrilor curbei de
etalonare se realizeaza cu ajutorul softului atasat aparatului folosit
pentru efectuarea analizelor.

Legea Beer-Lambert se poate aplica si la solutii ce contin

mai multi component cu conditia ca acestia sa nu interactioneze.

Pentru exprimarea absortivitatii molare a unei solutii ce

contine mai mult de o specie se poate folosi proprietatea de
aditivitate a absorbantei solutiei la o lungime de unda data, in
functie de absorbantele substantelor componente.

Considerand doua specii absorbante x si y absorbanta

amestecului este data de relatia : A= A1+A2.

Daca se determina absorbanta celor doua substante si absorbanta amestecului lor se obtin
spectre asemanatoare celor din figura din dreapta, in care cu linie continua sunt reprezentate
spectrele de absorbtie ale celor 2 substante pure in solutie , iar cu linie punctata spectrul de
absorbtie al amestecului celor doua substante.