Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
R1 HO R2 R3 N(CH3)2
6 5 4
8
7
6a 5a 4a
A
3 OH
D C B
9
10a 12a OH 2
10 11
11a
12 1 CONH2
OH O OH O II
I
Clortetraciclina R1 R2 R3
Oxitetraciclina Cl CH3 H
Tetraciclina H CH3 OH
6 - Demetiltetraciclina H H H
6 – Demetil – 7 – clortetraciclina Cl H H
99
După cum se vede, clortetraciclina conţine un atom de clor în inelul D poziţia 7,
oxitetraciclina conţine un hidroxil în nucleul B poziţia 5, iar tetraciclina are o structură
mai simplă, fără halogen în poziţia 7 şi fără hidroxil în 5.
Tetraciclinele pot suferi unele modificări structurale fără pierderea activităţii.
Astfel, eliminarea grupelor funcţionale din poziţiile 5, 6, 7 nu afectează activitatea
fiziologică, iar înlocuirea grupei -OH de la C6 din tetraciclină şi oxitetraciclină cu un
atom de hidrogen, are repercusiuni neînsemnate asupra activităţii.
Compusul cel mai simplu din seria tetraciclinelor, care mai păstrează încă
activitatea antibacteriană, este 6-desoxi-demetiltetraciclină, care nu mai conţine nici o
grupă funcţională la atomii de carbon din poziţiile 5, 6, 7. Activitatea antibacteriană este
influenţată de modificările sterice şi de poziţia anumitor substituienţi. Prin eliminarea
oxidrilului din poziţia „12 a" se obţine „12 a"-desoxitetraciclina inactivă, iar
deshidratarea grupei 2-carboxiamidică duce la tetraciclino-nitrili cu slabă acţiune
fiziologică. Nitrilii reacţionează cu morfolină, piperidină, pirolidină, aminoacizi (lizină)
dând produşi solubili, cu activitate antibacteriană şi proprietăţi terapeutice apreciabile.
H2
R CO CH2 CO CH2 CO CH2 COOH R CO CH2 CH CH2 CO CH2 COOH
OH
R COR
R COR
COOH HO HO OH OH
HO OH
OH OH OH
III IV V VI
Dacă condensează un număr mai mare de unităţi acetice se obţin combinaţii mai
complexe. Pentru confirmarea ipotezei de mai sus, s-a introdus în mediul de cultură a
microorganismelor producătoare de tetracicline acid acetic cu carbon marcat şi apoi s-au
studiat produsele de descompunere a oxitetraciclinei formate. Studiile efectuate cu acid
100
acetic marcat au dus la concluzia că acidul acetic este precursor în biosinteza
tetraciclinelor.
Carbonul marcat din grupele metilice ale acidului acetic se regăseşte în molecula
oxitetraciclinei în poziţiile 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10 a, 11a, 12a, iar carbonul din grupele
carboxilice în celelalte poziţii (1, 3, 4a, 5a, etc):
R1 HO R2 R3 N(CH3)2
H
H
7 6 5 4
Streptomyces 8 6a 5a 4a 3 OH
CH3 COOH D C B A
aureofaciens 9
10a 11a 12a
10 11 12 1
2 CONH2
OH
OH O OH O
Datorită faptului că radioactivitatea inelului A este mai mică, s-a emis ipoteza
că acest inel este format din acid glutamic şi acid acetic, conform următoarei scheme:
NH2
CH3 RO CH3 RO CH3 RO CH
RO C C C C CH2
O O O O CH2
COOR
101
OH S - enzimã
O
S - enzimã
OH
O + H2O, O2
NH2 O
- enzimã NH2
OH OH OH O O
OH O OH O O
IX Protetronã
Din protetronă (IX) se poate trece uşor la pretetramidă sau produşi înrudiţi, prin
următoarele reacţii:
OH
CONH2
OH OH OH OH
x VIII
O e flu O
r
OH HI OH
HBr sau
O NH2 fenol
Zn
pu CONH2
OH O OH O O lb OH O OH OH
er
e X
XI
102
tetraciclinelor, iar gruparea carboxiamidică şi grupa 6-metil este introdusă în catenă
înaintea ciclizării nucleului naftacenic.
Dovada principală că 6-metilarea precede ciclizarea, o constituie faptul că
obţinerea antibioticului 6-metilat depinde de prezenţa sau absenţa metilului în poziţia 6,
în derivaţii de pretetramidă. Prezenţa substituientului 7-clor în antibioticul obţinut
(clortetraciclină) prin transformarea unei pretetramide poate fi explicat fie prin folosirea
unui derivat clorurat de pretetramidă, fie prin folosirea unui mutant care are capacitatea,
genetic determinată, de clorurare. Dacă se pleacă de la o pretetramidă neclorurată şi se
foloseşte un mutant de clorurare se obţine clortetraciclină, fapt ce demonstrează că
procesul de clorurare are loc după stadiul de formare a pretetramidei.
Confirmarea faptului că intermediarii naftacenici sunt într-adevăr implicaţi în
biosinteză normală a tetraciclinei, s-a obţinut şi prin descoperirea unei 4-hidroxi-6-
metilpretetramide (XII), a cărui structură a fost stabilită folosind reacţiile de oxidare şi
reducere în diverse condiţii (schema I).
Cl OH CH N(CH3)2 CH3
3
OH
OH
CONH2
CONH2
OH
OH OH OH OH OH
OH O O
XIII
I
ol
fen x
, u
S. aureofaciens HJ efl
R
CH3 OH
H2O2 + NaOH
ld
ca
OH
pi la
Lent
Ra O2
d
+
H
aO
CONH2
N
OH OH OH OH
H2
O2
XII
+
Na
O
H
OH CH3 O OH CH3
OH COOH
Rapid
H2O2 + NaOH
COOH
O XV O O XIV
Schema I
103
gruparea 4-dimetil-amino este introdusă în ciclu. În continuare se redă calea de trecere
de la 4-hidroxipretetramidă la tetracicline. (Schema II).
CH3 OH CH3 O
OH OH
O2 Cl2
12a
CONH2 CONH2
OH
OH OH OH OH OH OH O O
XII XVI
CONH2
OH OH
OH OH O O OH OH O O
XVII VIII
CONH2 CONH2
OH OH
OH OH O O OH OH O O
Schema II
104
CH3 O CH3 H N(CH3)2
OH OH
NH3
Tetraciclinã
CONH2 CONH2
OH OH
OH OH O O OH OH O O
XVI
CH3 H N(CH3)2 CH3 HO H H N(CH3)2
OH OH
H2
Oxitetraciclinã O2
CONH2 CONH2
OH OH
OH OH O O OH O O O
XXI XX
Toate aceste procese de metilare, aminare, oxidare, reducere sunt realizate
enzimatic în procesul de biosinteză.
Pentru determinarea cantitativă a tetraciclinelor se pot folosi cu succes metode
titrimetrice, spectrofotometrice, colorimetrice, electrochimice, refractometrice şi
cromatografice.
105
Proprietăţile fiziologice ale miceliului se modifică continuu şi la aceasta
contribuie şi conţinutul în fosfor al mediilor de cultură. Pe de altă parte, există suficiente
date care cofirmă că trecerea de la faza de creştere a S. aureofaciens la faza de
biosinteză a antibioticului, este determinată în mare parte de concentraţia fosforului în
mediul de cultură. De asemenea, datele din literatură demonstrează ca antibioticul este
biosintetizat numai de microorganismele ajunse la maturitate, iar între concentraţia
fosforului, viteza de creştere a biomasei şi viteza de producere a antibioticului este o
strânsă corelaţie (figura 5.1).
106
Figura 5.2. Dependenţa dintre viteza de creştere a masei celulare şi
viteza de elaborare a tetraciclinelor:
a - influenţa concentraţiei fosforului; b - corelaţia dintre viteza de creştere
a masei celulare şi viteza de elaborarea produsului
Condiţii optime
Indici
pentru creşterea biomasei pentru biosinteza tetraciclinelor
Glucoza (mg/ml) 11,4; 20,2 11,0; 16,8; 11,0; 16,8
Azot amoniacal (mg/ml) 0,87; 0,87 0,46; 0,46; 0,68; 0,68
Fosfor (mg/ml) 65; 70 25; 28; 30; 27
Viteza specifică de creştere, h-1
0,079; 0,070 0,024; 0,023; 0,021; 0,029
Viteza specifică de acumulare a
0,40; 0,42 4,80; 4,50; 4,42; 4,22
tetraciclinelor (µg/mg/h)
CS ⋅ CH
μ = μmax - 2 2 (5.1)
K S + C S C H + K 1C S ⋅ C H
CS
μ = μmax = K C (5.2)
K S 1 + 1 + H + C S
CH K 2
CS
μ = μmax = K C K C (5.3)
K S 1 + 1 + H + C S 1 + 3 + H
CH K 2 CH K 4
CS KH K OH
⋅ ⋅
μ = μmax = K S + C S K H + C H 1 (5.4)
K OH +
CH
107
CS KH K OH
⋅ ⋅
μ = μmax = K C K H + CH 1 (5.5)
K S 1 + 1 + H + C S K OH +
CH K 2 2
Figura 5.4. Variaţia vitezei de creştere a biomasei şi de acumulare a tetraciclinelor funcţie de pH:
a - conform ecuaţiei (5.6); b - conform ecuaţiei (5.7).
Pentru cazul în care substratul limitativ este glucoza, această influenţă este
descrisă cel mai fidel de ecuaţia (5.4).
Prin determinarea concentraţiei optime a substratului (figura 5.3) şi a
constantelor KH şi KOH şi introducerea în ecuaţia (5.4) se obţin expresiile de calcul a
vitezei de creştere a biomsei şi a vitezei de formare a produsului:
108
10 ,6 ⋅10 −6 6,1 ⋅ 10 6
⋅
v = V 10,6 ⋅10 −6 + C H 1 (5.7)
6,1 ⋅10 6 +
CH
109
Figura 5.5. Dinamica procesului de fermentaţie a tetraciclinelor
110
R1 OH CH R2 N(CH3)2
3
OH
CONH2
O O O O
Th Th
O O O O
H HH HH HH H
XXII
N(CH3)2
OH
OH CH2 CH2
CONH CH2 N
O CH2 CH2
XXIII
CH2 CH2OH
N
CH2 CH2
N(CH3)2 N(CH3)2 NH2
CH2 CH2
OH OH
N (CH2)4
OH OH
CO NH CH2 CO NH CH2 N
O O COONa
XXIV XXV
111
N(CH3)2 R1
R1 OH
NH N
+ Tetraciclinã + CH2 O OH R2
R2 CO NH CH2
O
R1
CO NH CH N
R2
R3
R1 OH R2 N(CH3)2
OH
CONH2
OH O OH O
XXVI
112