LABORATOR 2

Biotehnologii pt. protecia mediului

METODE DE STERILIZARE UTILIZATE N

LABORATORUL DE BIOTEHNOLOGII
STERILIZAREA reprezint totalitatea mijloacelor ce duc la distrugerea sau ndeprtarea
complet a microorganismelor de pe suprafaa obiectelor, precum i substanele lichide sau solide
(medii de cultur, soluii) att sub forma lor vegetativ ct i sub form de spori.
Exist numeroase metode de sterilizare, alegerea metodei fiind n funcie de proprietile
obiectului supus sterilizrii.
Dup natura agentului folosit pentru distrugerea sau nlturarea celulelor microbiene,
sterilizarea poate fi:
prin metode fizice
- prin metode chimice
- prin metode mecanice
n alegera metodelor folosite trebuie s se in seama de sensibilitatea microorganismelor
fa de aciunea unor factori de mediu externi i de calitile fizice i chimice ale materialului supus
sterilizrii.

1.1. Sterilizarea prin metode fizice

Presupune folosirea cldurii (uscate sau umede), radiaiilor i ultrasunetelor.
1.1.1. Metode de sterilizare prin cldur uscat
flambare
nclzire la rou
folosirea de aer cald
incinerare
Sterilizarea prin flambare
se realizeaz prin trecerea obiectului sau suprafeei de sterilizat prin flacra unui bec de
gaz rapid i n mod repetat, la interval de 3-4 secunde
procedeul este aplicabil numai obiectelor de dimensiuni mici i cu suprafaa neted,
lipsit de asperiti, care ar putea proteja germenii (gtul baloanelor i eprubetelor,
pipete, lame de sticl)
Sterilizarea prin nclzire la rou
- const n nclzirea pn la nroire, n flacra unui bec de gaz sau a unei lmpi cu alcool, a
obiectului de sterilizat
- procedeul este aplicabil numai la sterilizarea unor obiecte de metal (spatule, ace de sering,
anse de nsmnare-att nainte ct i dup utilizare)
- instrumentul sterilizat se folosete pentru o singur operaiune, dup care este sterilizat din
nou n acelai mod (ori de cte ori este necesar)
- acest procedeu are inconvenientul c deterioreaz, n timp, obiectele sterilizate
Sterilizarea prin folosirea de aer cald
- se aplic pentru obiecte din sticl i porelan (nu obiectelor cu pri metalice, a celor din
cauciuc)
- se realizeaz cu ajutorul etuvei (fig.1.1 )
1

Fig.1.1. Sterilizarea cu ajutorul etuvei

Descrierea etuvei:
- este un cuptor cu perei dubli, cu sistem de nclzire electric
- n interior se gsesc rafturi de sit metalic sau tvi cu fundul perforat pe care se aeaz
obiectele de sterilizat
- pentru a se obine o sterilizare complet, este necesar s se menin obiectele de sterilizat, la
temperatura de 1600 C timp de dou ore sau la 1800 C timp de o or.
Mod de funcionare:
- obiectele curate i perfect uscate, montate (eprubetele, fiolele se astup cu dopuri de vat) i
mpachetate n hrtie rezistent, sunt aezate pe rafturi, la distan de perei, pentru a
evita carbonizarea hrtiei
- se nchide ua etuvei i se seteaz de pe displayul aparatului temperatura de 1800 C, timp de
o or
- dup expirarea timpului, se las s se rceasc treptat, dup care obiectele se pot scoate (cnd
temperatura interioar a ajuns egal cu a mediului nconjurtor)
- deschiderea aparatului nainte de rcire duce la spargerea obiectelor din interior, prin
diferena brusc de temperatur
- n timpul sterilizrii, hrtia i vata capt o culoare uor glbuie; acestea nu trebuie s fie
nnegrite (datorit carbonizrii), deoarece degaj gudron, bogat n substane antiseptice,
mpiedicnd dezvoltarea microorganismelor
- cnd o asemenea carbonizare s-a produs, obiectele de sticl trebuie splate cu alcool, apoi cu
ap, uscate i sterilizate din nou
Sterilizarea prin incinerare
- const n arderea substraturilor care conin microorganisme
- se aplic n special substraturilor care prezint microorganisme patogene
- aceast metod se realizeaz la temperaturi de 300-500 0 C, n cuptoare speciale numite
crematorii sau incineratoare
1.1.2. Metode de sterilizare prin cldur umed se aplic obiectelor care nu suport cldur
uscat (cauciuc, plut, metale cu lipituri) i lichidelor care s-ar evapora prin sterilizare
uscat:

fierbere

tindalizare

pasteurizare

autoclavare
Sterilizarea prin fierbere
2

fierberea este considerat o sterilizare incomplet, deoarece acioneaz prin denaturare

asupra formelor vegetative, dar nu i asupra sporilor
- timpul de sterilizare este de minimum 30 de minute la 100C, din momentul nceperii
fierberii
- se folosete pentru sterilizarea instrumentelor ce se utilizeaz imediat (n special pentru
instrumentele metalice)
- se poate aduga n apa de fierbere borax sau carbonat de sodiu (4-5 %) pentru ridicarea
punctului de fierbere al apei i protejarea instrumentelor
Sterilizarea prin tindalizare
- tindalizarea este considerat o sterilizare fracionat sau discontinu. Se nclzesc produsele
n baia de ap consecutiv 3-8 zile, timp de 1-3 ore ntre 60-100C; ntre nclziri, materialul
este pstrat la 4C.
- metoda se aplic n special pentru sterilizarea lichidelor care conin substane termolabile, ai
cror constituieni ar putea fi denaturai sub aciunea temperaturilor ce depesc 100 0 C
(unele medii de cultur)
Sterilizarea prin pasteurizare
- const n nclzirea unor lichide n baia de ap la temperaturi diferite, timp variat (la 60-65C
timp de 30 min. = pasteurizare joas, 70-75C timp de 15 min. = pasteurizare medie, sau 8590C cateva secunde = pasteurizare nalt), urmat de o rcire brusc la 40C .
- permite numai distrugerea formelor vegetative ale microorganismelor (nu i sporii) - nu se
distrug micobacteriile i enterovirusurile
- asigur o conservare temporar i se aplic lichidelor ce nu suport tratamente termice la
temperaturi de peste 1000C (laptele, berea) (fig.1.2.)

Fig.1.2. Instalaie pentru pasteurizarea laptelui

Sterilizarea prin autoclavare
- este o sterilizare prin vapori de ap sub presiune
- cldura umed sub presiune fiind mai penetrant, este cea mai sigur metod de sterilizare
- se sterilizeaz prin acest procedeu mediile de cultur, produsele patologice, sticlria
infectat, obiectele de cauciuc, filte, etc.
- nu se sterilizeaz lichide alterabile la peste 100C.
- se realizeaz cu ajutorul autoclavei (fig.1.3.)
- ridicnd presiunea vaporilor de ap la 1 atmosfer, se realizeaz o temperatur de 120C
care, n 30 minute distruge att formele vegetative ct i sporii.
3

- presiunea interioar folosit este de: 0,5 atm-115C, 1 atm-121C, 2 atm-134C

Descrierea autoclavei:
- autoclava este un recipient metalic, prevzut cu un capac masiv de bronz sau de oel care se
prinde de corpul recipientului prin intermediul unor butoane cu uruburi
- etaneitatea este asigurat de o garnitur de azbest sau cauciuc
- aparatul este prevzut cu o supap de siguran, cu un robinet de vapori i cu un manometru
care indic presiunea n bari, la anumit presiune corespunznd i un anumit nivel al
temperaturii de saturaie corespunztor acelei presiuni
- n interior se gsete un trepied metalic nalt de 5-6 cm, pe care se pune un co, n care se
aeaz obiectele de sterilizat
- sub aparat se gsete sursa de cldur
- aparatul n ntregime, inclusiv sursa de cldur, este mbrcat la exterior ntr-un alt nveli, de
obicei din font, iar pe partea lateral este prevzut cu un tub de nivel care indic nivelul apei
n recipient i care este util pentru controlul cantitii de ap din interior, precum i un robinet
de scurgere pentru golirea apei din recipient

Fig. 1.3. Sterilizarea cu ajutorul autoclavei

1.1.3. Metode de sterilizare prin radiaii
se folosesc diferite tipuri de radiaii (electromagnetice, raze X, raze gamma, radiaii
neionizante, raze ultraviolete artificiale)
cele mai penetrante i microbicide radiaii ionizante sunt razele gama (distrug ADN-ul).
Razele gama se obin dintr-o surs radioactiv de cobalt-60 sau cesiu-137, dar materialul
sterilizat nu devine radioactiv. Aceast metod se folosete pentru sterilizarea la rece, n
ambalaje, pentru produse medicamentoase, instrumentar medical i n general, pentru
materiale degradabile la caldur.
cele mai utilizate sunt radiaiile ultraviolete (UV); acestea, avnd lungimi de und cuprinse
ntre 2300-2800 nm, influeneaz activitatea biologic a microorganismelor, producnd
n funcie de durata expunerii, omorrea acestora sau inducerea de mutaii
radiaiile ultraviolete cu lungimi de und de 2600 nm, au un efect letal asupra
microorganismelor; efectul antimicrobian al acestor radiaii se datoreaz aciunii lor
asupra acizilor nucleici din celul

 sunt utilizate pentru sterilizarea aerului din laboratoare, boxe, hote, pentru dezinfectarea
diferitelor suprafee de lucru, a instrumentelor de laborator, precum i n vederea
sterilizrii unor culturi
sterilizarea camerelor nu trebuie fcut n timpul lucrului ci dup terminarea lui i prsirea
laboratorului, lsnd lmpile de ultraviolete aprinse n cursul nopii i folosind un
comutator situat n afara camerei respective
radiaiile ultraviolete sunt produse de un arc electric care funcioneaz n vapori de mercur
aflai la presiune joas; lmpile de ultraviolete sterilizante, sunt confecionate dintr-un
tub din sticl cu lungime variabil, montat ntre dou contacte electrice; tubul lmpii este
confecionat dintr-o sticl ce permite trecerea selectiv a radiaiilor cu lungime de und
de 2537 nm i oprete radiaiile cu lungime de und mai mic de 2000 nm (fig.1.4.)

Fig. 1.4. Lamp cu ultraviolete pentru sterilizare

aceste msuri au ca scop mpiedicarea formrii ozonului, gaz, care n concentraie de 0,05 %
este toxic pentru om
1.1.4. Metode de sterilizare cu ultrasunete
ultrasunetele pot fi utilizate pentru sterilizarea i curirea instrumentelor chirurgicale,
ntreruperea ferementaiilor, dar nu i pentru sterilizarea substanelor chimice, pe care le
altereaz
ultrasunetele pot dezlipi particule organice aderente, pe care le frmieaz la dimensiuni
micronice, uor de eliminat
undele cu mai mult de 20.000 vibraii pe secund au un efect de dezintegrare, determinnd
spargerea peretelui celular i liza celular
metoda permite dezintegrarea chiar i a sporilor

1.2. Sterilizarea prin metode chimice

n vederea sterilizrii sunt utilizate diferite substane chimice, care, n funcie de efectul
produs (microbiostatic sau microbicid), pot fi:
- antiseptice
- dezinfectante
Antisepticele sunt substane chimice cu aciune antimicrobian care au o toxicitate relativ
redus, fapt ce permite aplicarea local extern a acestora pe esuturile vii, n scopul de a mpiedica
producerea sau extinderea unei infecii (efect microbiostatic).
Substanele dezinfectante au o toxicitate ridicat i se aplic numai pe substraturi inerte, n
scopul distrugerii microorganismelor contaminante (efect microbicid).
n laboratorul de microbiologie sunt folosite mai multe substane dezinfectante (tabelul 1.1)
5

Tabelul 1.1. Substane chimice cu rol dezinfectant

Denumirea substanei
Scopul n care este folosit
Alcool medicinal i etilic 70 %
Formol-soluie comercial

Apa oxigenat
Acid acetic 1 %
Hidroxid
de
caustic)
Cloramina

sodiu

(soda

Diferii detergeni i spunuri

Soluie de bicromat de potasiu
5%
Clorul gazos (2-3%)
Etanol (50-70%)
Isopropanol (50-70%)
Formaldehida (8%)
Tinctur de iod (2% n 70%
alcool)

-dezinfecia curent a minilor sau tegumentelor

-dezinfecia obiectelor din sticl, faian, metal, de
laborator (n conc. de 5%)
-inactivitatea culturilor microbiene n vederea
preparrii unor vaccinuri (conc. 0,1-2 %)
-dezinfecia mucoaselor
-dezinfectarea pipetelor i lamelor n laboratoarele
care se ocup cu studiul germenilor din genul
Leptospira
-dezinfecia mobilierului, pardoselilor (conc. 3 %)
-dezinfecia minilor (sol.1 %)
-dezinfecia meselor de laborator (conc. 5%)
-dezinfecia minilor (sol. 0,1 %);
-splarea sticlriei
-dezinfecia pipetelor ntrebuinate
- tratarea apei pentru a deveni potabil
- antiseptic al pielii
- antiseptic al pielii
-dezinfectant al pielii, omoar endosporii
- antiseptic al pielii

1.3. Sterilizarea prin metode mecanice

se realizeaz prin trecerea unui fluid (lichid sau gaz) printr-un perete poros sau printr-o
membran ce reine microorganismele printr-un dublu mod de aciune:
- reinere mecanic
- reinere prin mecanisme fizico-chimice (absorbie, atracie electrostatic)
filtrarea sterilizant nu este o metod perfect de sterilizare, deoarece microbii cu dimensiuni
foarte mici (virusuri i chiar unele bacterii-micoplasme-) pot traversa pereii filtrelor;
se realizeaz la temperatura camerei i se aplic lichidelor alterabile prin cldur
nu distruge microorganismele, ci numai le separ din lichidul n care sunt suspendate (soluii
de zaharuri, preparate enzimatice, unele vitamine etc.)
exist mai multe tipuri de filtre:
- filtre de sticl cu sept poros sunt discuri fabricate din sticl cu poroziti cuprinse
ntre 200 pn la 1. Acest filtru face parte din seria G din care G5 are porii mai
mici de 1,7 (fig.1.5.)
- filtre din porelan (bujii) notate L1-L13 (filtrele L3, L4, L5 rein celulele bacteriene)

Fig.1.5. Sterilizarea prin filtrare

Sterilizarea aerului
este strict necesar n fermentaiile aerobe, deoarece aerul poate conine fungi, bacterii,
virusuri i spori
pentru sterilizarea aerului se utilizeaz mai multe metode:
- sterilizarea termic
- sterilizarea cu raze ionizante, ultraviolete;
- sterilizarea cu ageni chimici
- sterilizarea prin filtre mecanice prevzute cu fibre din sticl sau fibre sintetice
n procesul de biosintez se combin sterilizarea termic cu sterilizarea prin filtre
Sterilizarea liniei tehnologice
linia tehnologic cuprinde: fermentatorul de inoculare, fermentator intermediar i cel de
regim i conductele de legtur

sterilizarea lor se face cu abur, la 120-150 0C, timp de 30 de minute