Bioseparari analitice

Curs 1

Bioprocesarea se refera la studiul sistematic al principiilor tiinifice i

inginereti utilizate pentru obtinerea si purificarea pe scar larg a

produselor biologice.

Bioprocesarea poate fi clasificata n dou categorii:

1. bioprocesare reactiv
2. bioprocesare extractiva

Bioprocesarea reactiv are drept componenta o anumit reacie

biologic
Ex. Producere de antibiotice, hormoni, vaccinuri

Bioprocesare extractiva implic aproape n ntregime biosepararea

Biosepararile analitice se refera la purificarea

componentelor active cu un singur scop: evaluarea

cantitatii de produs existent in matricea prelucrata si
poate opera cu probe de diverse dimensiuni pana la o

singura celula.

Categorii de produse obtinute prin procese de bioseparare

Categorii
Solveni
Acizi Organici
Vitamine
Aminoacizi
Antibiotice

Exemple
Etanol, aceton, butanol
Acid citric, acidul lactic, acidul butiric
Acid ascorbic, vitamina B12
Lizina, fenilalanin, glicin
Peniciline, rifampicin, streptomicin, soframycin, kanamicina

Zaharuri i carbohidrai
Lipide
Acizi nucleici

Glucoza, fructoza, amidon, dextran, xantan, gelan

Glicerol, acizi grai, corticosteroizi, prostaglandine
Plasmide, ADN terapeutic, vectori retrovirali, oligonucleotide,
ribozomi
Factorii de cretere, proteine, citokine, interleukine, hormoni

Proteine purificate
Proteine semipurificate
Cellule
Extracte celulare brute
Hidrolizate

enzime industriale, proteine din ou, proteine din lapte, proteine

din zer, proteine din soia
Drojdie de panificaie, drojdie de bere, lactobacili uscati prin
congelare
extract de drojdie, extracte de soia, extract de esut de origine
animal
Hidrolizate din soia, hidrolizae din zer, hidrolizae din esut de
origine animal

Principalele activitati economice care beneficiaza de procesele de bioseparare

Categorii
Produse chimice industriale
Agrochemicals
Biofarmaceutice

Exemple
Solventi, acizi organici, enzime industriale
Biofertilizani, biopesticide
Antibiotice, hormoni, anticorpi monoclonali, plasma
proteine, vaccinuri, hormoni, citokine, acizi nucleici
terapeutici

Produse alimentare si aditivii

alimentari

Proteinele din zer, proteine din lapte, proteine din ou,

soia proteine, hidrolizate proteice

Nutraceutice

Vitamine, enzime, coenzime, cofactori, aminoacizi,

proteinele din zer purificate

Produse medicale pentru

diagnostice
produse chimice de mrfuri
Reactivi de laborator
Produse cosmetice

Glucoz oxidaz, peroxidaza, HCG

Detergenti de tip enzime, insecticide

Albumin seric bovin, ovalbumina, lizozima
Extracte din plante, extracte de esuturi de origine
animala

Importana economic a biosepararii

Purificarea produselor biologice pornind de la materialul brut este o sarcina
dificila si costisitoare din punct de vedere tehnic. Acest aspect este un factor
critic si limitant pentru comercializarea unui produs biologic. n multe cazuri,
costul bioseparii poate fi o component substanial a costului total al
bioprocesarii (de ex. pentru proteine i acizi nucleici folosite ca
biofarmaceutice)

Produse

Costul Bioseparii (%)

Solveni

15-20
20-25
20-25
30-40

Celule
Extracte celulare brute
Acizi organici
Vitamine si aminoacizi

Gume i polimeri
Antibiotic
Enzime industriale
Proteine terapeutice non-recombinante
Produsele ADN recombinant
Anticorpii monoclonali
Produse pe baz de acizi nucleici
Proteine plasmatice

30-40
40-50
20-60
40-65
50-70

60-80
50-70
60-80
70-80

Natura biosepararilor

Biosepararile se bazeaz n mare parte pe procese de separare

chimice.
O multitudine de tehnici de separare bine fundamentate
utilizate in industria chimica.

sunt

Unele dintre aceste tehnici s-au dovedit a fi potrivite pentru

efectuarea de bioseparari.
Cu toate ca unele tehnici se pot adapta necesitatilor din industria
biosepararilor diferene fundamentale intre substantele chimice
sintetice si biomolecule exista si trebuie luate in calcul.

Unele biomolecule (antibiotice sau vitamine si aminoacizi) se pot purifica

utilizand tehnici convenionale de separare, cum ar fi: extracia lichidlichid, adsorbie cu strat fix, evaporarea i uscarea fara nici o modificare
fata de tehnicile curente din industria chimica.
Modul de abordare se schimba radical cand este vorba de molecule
complexe cum ar fi: proteine, lipide, carbohidrai i acizi nucleici.
De cele mai multe ori sunt necesare tehnici complet noi sau adaptarea
celor existente.
Diferentele intre procesele de bioseparare si separarile chimice
bazeaza pe urmatoarele aspecte:

se

1. Produsele biologice sunt prezente n concentraii foarte sczute n materialul de pornire. De

exemplu, anticorpii monoclonali sunt de obicei prezenti n concentraii n jur de 0,1 mg / ml in
supernatantul din culturile celulare animale. Prin urmare volume mari de produs diluat
trebuie vehiculat
2. O serie de alte substane care sunt, de obicei, impuriti i, n unele cazuri, produse
secundare sunt prezente n materia prim mpreun cu produsele biologice int. Frecvent
aceste impuriti sau produse secundare au proprieti fizice i chimice similare cu cele ale
produsului dorit. Acest lucru face ca separarea sa fie foarte dificila. De aceea, biosepararea
trebuie s fie foarte selectiva.
3. Exist cerine stricte de calitate pentru produsele utilizate n scopuri profilactice, diagnostice
i terapeutice, att n termeni ai coninutului de produs activ, ct i n ceea ce privete absena
impuritilor specific (produse terapeutice injectabile trebuie s fie liber de endotoxine i
pirogeni). Procedurile pentru respectarea acestor cerinte trebuie sa fie elaborate in carul
procesului de bioseparare.

4. Produsele biologice sunt susceptibile la denaturare i alte forme de

degradare. Prin urmare, tehnicile de bioseparare trebuie s s fie "blnde" n
ceea ce privete evitarea condiiilor fizico-chimice extreme, cum ar fi pH-ul i
tria ionica, condiii hidrodinamice, viteze de forfecare ridicate, i expunerea
la interfee gaz-lichid. Solvenii organici care sunt utilizate pe scar larg la
separri n industria chimic au o utilizare relativ limitata n bioseparari tinand
cont de tendina lor de a promova degradarea multor produse biologice.
5. Multe produse biologice sunt termolabile i, prin urmare, majoritatea
biosepararilor sunt de obicei efectuate la temperatur sub-ambiant.
6. Biosepararea se bazeaz adesea pe o filiera de tehnici (un flux deseori
complex care are la baza o serie de tehnici individuale).

Bazele separarii n procesele de bioseparare

Produsele biologice sunt separate pe baza uneia sau mai multora din
urmtoarii factori:
1. Dimensiune molecule: de ex filtrare, separare prin membran, centrifugare
2. Densitate: de ex centrifugare, sedimentare, flotaie
3. Difuzivitate: ex separare prin membran
4. Forma: de ex centrifugarea, filtrarea, sedimentarea
5. Polaritate: de ex extracia, cromatografia, adsorbia
6. Solubilitate: de ex extracie, precipitare, cristalizare
7. Incrcare electrostatica: de ex adsorbie, separare prin membran,
electroforez

8. Volatilitatea: de exemplu, distilare, distilare cu membran, pervaporatie

Forma fizica in care se afla materia care trebuie separata

Biosepararea implic de obicei separarea fizic a portiunilor de materie care se afla in
diferite forme .
1. Separare de tip particule-lichid
Exemple de separare a particulelor de lichide pot fi:

separarea celulelor din mediul de cultur celular,

separarea celulelor sanguine din plasma, producere proteinelor plasmatice,
eliminarea bacteriilor i virui din soluii proteice.

 Separarea particulelor de lichid poate fi realizat prin forarea suspensiei printr-un

mediu poros care reine particule n acelai timp permind lichidului s treac prin
acesta. Acest principiu este utilizat n separarea i filtrarea pe membrane.

Separarea particulelor-lichid poate fi realizat prin supunerea suspensiei unor

cmpurile gravitaionale naturale sau induse artificial. n cazul n care particulele
sunt mai dense dect mediul lichid n care acestea sunt suspendate se formeaza la
baza vasului un sediment i lichidul limpede lsat n urm este denumit supernatant.
Acest principiu este utilizat n procesele de separare, cum ar fi sedimentarea i
centrifugarea.
Dac particulele sunt mai uoare dect lichidul n care acestea sunt suspendate,
acestea tind s pluteasc i, prin urmare, s se concentreze n partea de sus a
containerului n care are loc suspendarea. Acest principiu este utilizat n flotatie.

2. Separare de tip particula-particula din mediul lichid

Exemple de separare a particulelor de alte particule n mediul lichid sunt:
fracionarea organelelor subcelulare,
separarea ADN-ului plasmidic din ADN-ul cromozomial
separarea celulelor mature de celule tinere.
Acest tip de separare poate fi realizat prin centrifugare zonal. Ca
rezultat particulele mai grele vor migra mai repede dect particulele mai
uoare, avnd ca rezultat segregarea lor n benzi distincte din care aceste
particule pot fi recuperate ulterior utiliznd mijloace adecvate.
Separarea particulelor de particule poate fi realizat n teorie prin
utilizarea unui mediu poros care reine particulele mai mari, dar permite
particulelor mai mici s treac prin acesta.
Aceasta operatie este destul de dificil de pus in practica i se poate
efectua numai n cazul n care particulele mai mari pot fi mpiedicate s
blocheze mediul poros.

3. Separarea substanei dizolvate n mediu lichid

Un exemplu n acest sens este separarea antibioticelor dizolvate care sunt produse in
celule.

Metodele utilizate pentru separarea solutului sunt fundamental similare cu cele

utilizate pentru separare solid-lichid, datorit faptului c resturile de solut raman

dizolvate n mediul lichid.

4. Separare solut-solvent
Separare solutului de solvent este destul de comun n bioseparare, scopul acesteia fiind fie
eliminarea total sau parial a unui solvent dintr-un solut produs. Aplicatiile curente sunt:
cresterea concentraiei de proteina ,
ndeprtarea impuritilor dizolvate dintr-un produs lichid,
nlocuirea unui solvent dintr-o soluie cu altul (schimb de solvent).
O serie de opiuni sunt disponibile pentru separarea solutului de solvent si cele mai simple

dintre acestea sunt evaporarea i distilarea.

O problema esentiala a acestor tehnici este necesitatea aplicarii unui tratament termic i,
prin urmare, nu pot fi utilizate pentru separarea materialelor biologice care tind s fie

termolabile.

Membranele care pot reine materialul dizolvat permind n acelai timp

eliminarea solvenilor reprezinta o alternativa viabila mai ales ca sunt prezente
diverse variante:
o membrana de osmoza inversa va reine molecule mici si ioni,
o membran de nanofiltrare va retine mai molecule mai mari, cum ar fi
vitamine, hormoni i antibiotice,

O membran de ultrafiltrare va retine macromolecule cum ar fi proteinele i

acizi nucleici

Principiul separarii prin membrana

Domenii de aplicare a membranelor

Un alt mod de a scoate un solvent dintr-o substan dizolvat este prin legare
reversibila a solutului pe o suprafa solid, acesta fiind procesul de adsorbtie.
Odat ce legarea solutului a avut loc, aceast separare este transformata ntr-o

separare de tip particula-lichid, adic solventul este separat de solutul legat de solid.
Solutul legat este recuperat ulterior din materialul solid, procesul fiind denumit
desorbie.
O metoda indirect de separare a substanei dizolvate din solvent este precipitarea
Care se transforma astfel nc o dat in separare de tip particula-lichide.
Schimbul de solvent poate fi realizat prin extracie lichid-lichid unde substana
dizolvat este transferat de la un lichid la altul, cu care solventul original este
nemiscibil.

5. Separarea de tip solut-solut n mediu lichid

Separarea solut-solut este de departe forma cea mai dificila de separare.

Un exemplu n acest sens este separarea de albumin seric dintr-un amestec de alte proteine serice.
Separarea solut-solut poate fi realizat prin adsorbie selectiv, adic prin legarea selectiv si reversibila a solutului dorit pe un
material solid.
Separarea solut-solut pot fi transportata prin extracie lichid-lichid, de exemplu prin punerea n contact a soluiei ce contine

amestecul de biomolecule cu un lichid nemiscibil n care solutul int are o solubilitate ridicat.
In urma apariiei membranelor, separarea solut-solut a devenit mult mai facila.
Membrane de tip nanofiltrare, ultrafiltrare si dializa pot fi folosite pentru astfel de separari.
Un mod indirect de a efectua separarea solut-solut este prin precipitare, care implic precipitarea selectiv a solutului inta

6. Separarea lichid-lichid
Separarea lichid-lichid este necesar pentru fabricarea de solveni ca aceton i etanol, care

de obicei se formeaza in mediu apos. Dac solventul este nemiscibil cu apa, separarea
urmat de decantare poate fi suficient. Cu toate acestea, n cazul n care solventul este

miscibil cu apa (ca n cazul etanolului) sau formeaza amestecuri azeotrope, alte metode de
separare trebuie utilizate. In cazul etanolului distilarea a fost utilizat n mod tradiional. Cu
toate acestea, odat cu apariia tehnologiei membranelor, procesele de separare cum ar fi
distilarea prin membrana i pervaporatie au inceput sa fie utilizate pe scara larga.

Curba lichid vapori pentru doua substante X si Y care nu formeaza si care formeaza
amestec azeoptrop de maxim

Principiul de functionare a procesului de pervaporatie care este de fapt o

distilare cuplata cu separare prin membrana