Determinarea activității peroxidazei și polifenoloxidazelor.

Controlul îmbrunării enzimatice

Determinarea conținutului total de polifenoli din alimente

1. Determinarea activităţii peroxidazei

Peroxidaza este o enzimă din clasa oxido-reductazelor care catalizează reacţia
generală:
ROOH + AH2 H2O + ROH + A
Substrat redus Substrat oxidat

În care ROOH poate fi: peroxidul de hidrogen sau un alt peroxid organic.
Reacţiile peroxidative catalizate de peroxidază pot avea loc în prezenţa p-crezolului,
guaiacolului, rezorcinolului etc. drept cosubstrat. Peroxidaza poate, de asemenea, cataliza şi
alte tipuri de reacţii cum sunt: oxidative (în prezenţa oxigenului şi acidului hidroxifumaric, acid
ascorbic, hidrochinonă etc.), catalazice (descompunerea de hidrogen şi oxigen molecular
hidroxilează tirozina, fenilalanina, p-crezolul, acidul salicilic etc.). Peroxidazele sunt larg
răspândite în diferite plante (hrean, ridichi, napi, gulie, cartofi, smochine şi alte legume şi fructe)
şi animale (de ex. leucocite, ficat, lapte, salivă etc.). În general peroxidazele au o mare
stabilitate termică ( 85…115C) constatându-se adesea reactivarea lor după tratamentul termic
al diferitelor materiale care le conţin în special de natură vegetală. Datorită acestui fapt,
determinarea activităţii peroxidazei din diferite legume şi fructe supuse tratamentelor termice
(de ex. blanşare, sterilizare etc.) este folosită ca indiciu al eficacităţii tratamentului.
Determinarea activităţii lacto-peroxidazei este folosită la urmărirea pasteurizării în industria
laptelui.
Peroxidazele intervin în degradarea fructelor şi legumelor fiind implicate în modificarea
mirosului şi gustului la mazăre, fasole etc., modificarea culorii cartofilor, merelor, gutuilor etc. (
îmbrunare enzimatică).

Principiul metodei
Metoda se bazează pe proprietatea peroxidazei de a oxida în prezenţa apei oxigenate
sau a altor peroxizi compuşi de natură aromatică. Rezultă chinone care prin polimerizare dau
compuşi de culoare brună (melanine). Reacţia este foarte sensibilă. În acest caz se foloseşte
drept cosubstrat o soluţie alcoolică de guaiacol:
OH OH O
OCH3 HO OCH3 O OCH3

+ H2O + H2O2 Melanine

- H2O - 2H2O

Guaiacol Hidroxi-guaiacol Chinonă

Reacţia continuă cu polimerizarea chinonelor şi formarea unor compuşi coloraţi în brun

(melanine).
 Reactivi
- soluţie alcoolică de guaiacol 1%;
- apă oxigenată 0,5M;
- clorură de sodiu 2%.

Modul de lucru
Se cântăresc 5-10 g produs şi se mojarează fin cu 25 ml soluţie clorură de sodiu 2%. Se
trece conţinutul mojarului cantitativ într-un cilindru gradat de 100 ml cu apă distilată şi se aduce
la semn; se omogenizează bine şi se lasă 15 minute pentru extracţie, timp în care se mai agită
de câteva ori; se filtrează prin filtru cutat într-un vas curat şi uscat. Din filtrat se iau 10 ml într-
un alt vas curat şi uscat, se adaugă 1 ml apă oxigenată 0,5 M, 1 ml guaiacol 1%, se
omogenizează şi se lasă la temperatura camerei timp de 30 minute. Se obţine o culoare brună
mai mult sau mai puţin intensă în funcţie de cât este de activă enzima.
Se determină extincţia soluţiei la un spectrofotometru, la lungimea de undă de 420 nm,
prin cuvă de 1 cm folosind ca fond apa distilată. Dacă soluţia este intens colorată, se face o
diluţie corespunzătoare.

Modul de calcul
În funcţie de extincţia determinată şi de diluţiile efectuate, se exprimă activitatea
peroxidazei în extincţie pentru 1 g produs.
E
A  d , în care:
G
E – extincţia determinată;
G – cantitatea de preparat enzimatic sau sursa de enzimă, în g sau ml;
d – diluţie

2. Controlul inactivării peroxidazei

Principiul metodei
Prin fierberea produselor vegetale peroxidaza este inactivată şi ca urmare reacţia de mai
sus nu mai are loc.
Metoda se foloseşte pentru stabilirea timpului de opărire a materiilor prime vegetale
necesar inactivării enzimelor de oxido-reducere, deoarece peroxidaza este cea mai
termostabilă enzimă din această clasă.
Metoda se bazează pe reacţia de culoare a guaiacolului în prezenţa peroxidazei şi a
apei oxigenate ( vezi determinarea colorimetrică a activităţii peroxidazei).
Reactivi:
- soluţie alcoolică de guaiacol, 1%;
- apă oxigenată, 0,5M.
 Modul de lucru
Se taie dintr-un cartof 5 felii de grosime identică din care una serveşte ca probă martor
iar celelalte se introduc pe rând în apă care fierbe, de unde se scot după 30’’, 1’, 1,5’, 2’… de
la fierbere.
Se pipetează pe fiecare din cele 4-5 felii supuse fierberii şi pe felia martor câteva picături
de apă oxigenată, iar deasupra câteva picături de guaiacol.
Apariţia unei culori roşu-brun indică prezenţa peroxidazei. Dacă enzima este parţial
inactivată culoarea este slabă; dacă culoarea nu apare, peroxidaza nu este prezentă, adică a
fost total inactivată.
Rezultatul testului constă în stabilirea timpului de fierbere necesar pentru inactivarea
enzimei.

3. Determinarea activităţii polifenoloxidazelor

Polifenoloxidazele (crezolaze, catecoloxidaze, tirozinaza, polifenolaza, o-difenol oxigen
reductaza, EC 1.10.3.1) sunt enzime din grupa oxido-reductazelor, care transferă electroni
direct pe O2; catalizează hidroxilarea monofenolilor cu formare de o-difenoli care sunt
transformaţi apoi în o-chinone.
Polifenoloxidazele sunt larg răspândite în plante, găsindu-se în cantităţi mari în ciuperci,
tuberculi de cartofi, frunze de ceai şi tutun, boabe de cafea şi diferite fructe ca mere, piersici,
caise, banane, gutui etc. Polifenoloxidazle din plante nu prezintă specificitate deosebită putând
să acţioneze asupra unei mari varietăţi de compuşi monofenolici şi orto-di-fenolici. În schimb
polifenoloxidazele din ţesuturile mamiferelor au o specificitate mult mai restrânsă acţionează
mai ales asupra tirozinazei şi dihidroxifenilalaninei.
Polifenoloxidaza are o masă moleculară de 34000 şi conţine 1 atom de cupru/moleculă
( 0,2% Cu).
Polifenoloxidazele sunt implicate în procesele de îmbrunare enzimatică a legumelor şi
fructelor. Îmbrunarea şi înnegrirea materialelor vegetale (legume şi fructe) proaspăt tăiate şi
în contact cu oxigenul din aer, se datorează polimerizării sau polimerizării oxidative a chinonelor
formate din mono- şi difenolii asupra cărora a acţionat polifenoloxidaza. Rezultă compuşi de
culoare brună denumiţi melanine.
Îndepărtarea cuprului din molecula polifenoloxidazelor prin complexare cu cianură de
potasiu, dietilditiocarbonat, hidrogen sulfurat etc. inactivează enzima.
Prin folosirea unor tratamente termice (pentru inactivare), a cianurii de potasiu în
concentraţii mici, agenţi de complexare ai cuprului, a acidului ascorbic, bioxidului de sulf sau
sulfitului acid de sodiu, se pot preveni sau minimaliza procesele de îmbrunare enzimatică a
legumelor şi fructelor.
 Principiul metodei
Determinarea activităţii polifenoloxidazei (PFO) prin metoda colorimetrică se bazează
pe proprietatea acestei enzime de a oxida pirocatehina în prezenţa oxigenului din aer:

OH O
OH O
1/2 O2
Melanine
- H2O

Pirocatehina Chinonă

Reacţia se continuă cu polimerizarea chinonelor obţinute şi formarea unor compuşi de

culoare brună ( melanine).

Reactivi:
- pirocatehină 0,5 M.

Modul de lucru
Se cântăresc între 5-10 g produs şi se mojarează fin cu 25 ml apă distilată. Proba astfel
tratată se trece cantitativ cu apă distilată într-un cilindru gradat de 100 ml, se aduce la semn şi
se agită bine; se lasă 15 minute pentru extracţie, timp în care se mai agită de câteva ori. După
expirarea celor 15 minute, extractul se filtrează prin filtru cutat într-un balon conic curat şi uscat.
Din filtrat se iau 10 ml într-un vas curat şi uscat, se adaugă 0,1 ml soluţie de pirocatehină,
se omogenizează bine şi se lasă timp de 30 minute la temperatura camerei pentru desfăşurarea
reacţiei. Se obţine o coloraţie brună mai mult sau mai puţin intensă în funcţie de cât de activă
este enzima. În cazul în care culoarea soluţiei este prea intensă se face o diluţie
corespunzătoare. Se determină extincţia soluţiei colorate la un spectrofotometru la lungimea de
undă de 470 nm, prin cuvă de 1 cm folosind ca fond apa distilată.

Modul de calcul
În funcţie de extincţia determinată şi de diluţiile efectuate, se calculează activitatea
polifenoloxidazei în extincţie pentru 1 g de produs.
E
A  d , în care:
G
E – extincţia determinată;
G – cantitatea de preparat enzimatic sau sursa de enzimă, în g sau ml;
d – diluţia.
 4. Determinarea conținutului total de polifenoli
Polifenolii constituie unul dintre grupurile cele mai comune şi răspândite de substanţe din
plante, care apar în toate vegetalele, derivate din fenilalină și tirozină (figura 1). Ei sunt
metaboliți secundari apăruți în plante, ca reacție la acțiunea razelor ultraviolete, la agresiunea
unor patogeni și constituie un grup heterogen de substanțe naturale ce pot contribui la gustul
amar, astringența, culoarea, aroma, mirosul și stabilitatea oxidativă a produselor vegetale. Sunt
cunoscuți în special pentru acțiunea lor pozitivă asupra sănătății umane, atât prin acțiunea
preventivă, cât și prin reducerea unor factori de risc ai unor boli cronice.
Clasificarea polifenolilor a fost destul de dificil de realizat, datorită varietății mari a
acestora. Polifenolii pot fi clasificaţi în diferite grupe în funcţie de numărul de inele fenolice pe
care le conţin şi pe baza unor elemente structurale care leagă aceste inelele între ele. Structurile
generale a principalelor clase de polifenoli: acizi fenolici, flavonoide, stilbene şi lignani.

Fig. 1. Mecanismul de sinteză al fenilporpanoidelor, stilbenelor, lignanilor, ligninelor,

suberinelor, cutinelor, flavonoidelor și taninurilor din fenilalanină (PAL)
 Compușii polifenolici nu sunt distribuiți uniform în plante la niveluri țesutului, celular și
subcelular. Polifenolii insolubili sunt componentele pereților celulari, în timp ce cei solubili sunt
compartimentați în vacuolele celulelor vegetale. La nivel de țesut, straturile exterioare ale
plantelor conțin niveluri superioare ale polifenolilor decât cele situate în părțile lor interioare.
Polifenolii din pereți celulari, cum ar fi ligninele (unitățile de polimeri de monolignoli) și acizii
hidroxicinamici, sunt legate de diferite componente ale celulelor și contribuie la rezistența
mecanică a pereților celulari, joacă un rol important în creșterea plantelor și morfogeneză
precum și în răspunsul celular la stres și agenți patogeni. Acizii ferulici și p-cumarici, principalii
acizi fenolici, pot fi esterificați la pectine și arabinoxilani sau reticulați la polizaharide de perete
celular sub formă de dimeri cum ar fi acizii dehidroferulic și truxilic. Aceste legături încrucișate
pot juca un rol semnificativ în adeziunea celulelor, formarea ligninelor și contribuie la stabilitatea
termică a texturii alimentelor vegetale.
Până în prezent au fost identificate mai mult de 8000 de structuri fenolice, dintre care peste
4000 de flavonoide.
Fructele în stare proaspătă, cum ar fi strugurii, merele, perele, cireşele şi fructele de
pădure, conţin până la 200-300 mg polifenoli în 100 de grame produs proaspăt. De asemenea,
produsele fabricate din aceste fructe, conţin polifenoli în cantităţi semnificative. În medie, un
pahar de vin roşu sau o ceaşcă de ceai sau de cafea conţine aproximativ 100 mg de polifenoli.
Cerealele, leguminoasele uscate şi ciocolata constituie de asemenea un aport de polifenoli

Principiul metodei:
Polifenolii sunt din punct de vedere chimic compuși aromatici cu una sau mai multe grupări
hidroxil substituite la nucleul aromatic, care le conferă proprietăți redox.
Metoda are la bază transferul de electroni, produs în mediul alcalin, cu reducerea
complexului acid fosfomolibdenic / fosfovolframic. Deci, grupările hidroxil ale compușii
polifenolici sunt oxidate de reactivul Folin-Ciocalteu cu formarea unui compus colorat albastru
cu absorbție maximă la λ = 725 nm. Intensitatea culorii este proporional coninutului de compui
fenolici.

Reactivi:
 acid galic (standard pentru construirea curbei de calibrare)
 alcool etilic 95% (pentru extracte alcoolice sau hidro-alcolice)
 reactiv Folin-Ciocalteu (complex acid fosfomolibdenic/ fosfovolframic)
 Na2CO3, soluție saturată
 Modul de lucru
Pe o sticlă de ceas, tarată și uscată, se cântăresc cu precizie 0,001 g 2,5-10 g plantă
uscată, și mărunțită. Se trece cantitativ proba întru-un pahar Erlenmeyer peste care se adaugă
100 mL apă distilată cu temperatura de 80-100˚C. Se lasă la infuzat timpi diferiți (5-15 min),
apoi se filtrează prin hârtie de filtru.
Într-o eprubetă 0,25 ml de filtrat se amestecă cu 0,25 ml reactiv Folin-Ciocalteu (diluat cu
apă distilată 1:1, v/v), 0,5 ml soluţie saturată de Na2CO3 şi 4 ml apă distilată. Amestecul se
menţine la temperatura camerei timp de 25 minute iar apoi se centrifughează timp de 10 minute
la 5000 rot/min. Se cititește absorbanța supernatantului la 725 nm faţă de un martor pregătit în
acelaşi timp şi conditii cu apă distilată în locul soluţiei de probă.

Modul de calcul
Conținutul total de polifenoli (CTP) se exprimă în echivalenți de acid galic (GAE – gallic
acid equivalents), în mg/g probă utilizând o curbă etalon în acid galic având concentrații în
domeniul 0 – 6 µg (figura 2.).
0.12

y = 0.0156x + 0.0033
0.1
R² = 0.996
0.08

0.06
E, nm

0.04

0.02

0
0 1 2 3 4 5 6
acid galic, ug

Fig. 2. Curba etalon pentru determinarea conţinutului total de polifenoli