8. Glucide. Reacţii de culoare.

Monoglucidele şi oligoglucidele se pot recunoaşte prin:

- reacţii de culoare specifică;
- reacţii bazate pe caracterul reducător al glucidelor;
- reacţii enzimatice.

Urina conţine cantităţi mici din diferite glucide: glucoză, fructoză, manoză, arabinoză, xiloză, galactoză,
riboză (urme). Urina normală poate conţine substanţe reducătoare, din care o treime sunt glucide. În mod normal,
glucoza se găseşte în urme, dar poate apare în cantităţi crescute după consumul unor cantităţi mari de glucide sau la
persoanele cu glicurie renală. Aproximativ 40% din gravide prezintă o meliturie în a doua parte a sarcinii (lactozurie şi
frecvent glucozurie). Glucozuriile patologice unt caracteristice pentru diabetul zaharat.
Pentru reacţii calitative se foloseşte urina de la o singură emisie. Probele de orientare se fac pe urina nedefecată şi
dacă reacţia este intens pozitivă nu mai este nevoie de defecare. Dacă reacţia este neconcludentă se lucrează pe
urina defecată. Defecarea se realizează în scopul îndepărtării altor compuşi reducători din urină, în afara glucidelor.
Defecarea se face cu ajutorul reactivului Courtonne.
Reactivi: acetat de plumb
acid acetic
Prepararea reactivului: se dizolvă 100g acetat de plumb în apă distilată într-un balon cotat de un litru. Se
adaugă acid acetic în picături până la mediu neutru şi apoi se aduce la semn cu apă distilată. Se filtrează.
Mod de lucru: Într-un cilindru se iau 45 ml urină şi 5 ml reactiv Courtonne. Se agită cu o baghetă,
se lasă să se depună precipitatul şi se filtrează. Datorită diluării urinei cu reactivul Courtonne, la dozarea glucozei se
înmulţeşte cu factorul de eluţie 1,1.

Reacţii de culoare
Aceste reacţii sunt bazate pe transformarea ozelor în furfurol sau derivaţi ai furfurolului, sub acţiunea acizilor
şi condensarea acestora cu fenoli, amine etc.
8.1. Reacţia Molish. La tratarea soluţiei unui glucid cu - naftol şi acid sulfuric concentrat apare o coloraţie
violet, caracteristică.

H O OH
C OH

CHOH
CHOH H2SO4 c O
R C R C H
_ O _
CHOH 3 H2O H H2O O
CHOH
OH
R
OH

oxidare
R C
O R: H, CH3, -CH2OH

OH

Prepararea soluţiei de - naftol: Se dizolvă 1 g - naftol în 10 ml etanol.

Mod de lucru: Se introduce 1 ml soluţie de glucid într-o eprubetă, se tratează cu 2 ml soluţie de - naftol,
apoi se adaugă 1-2 ml acid sulfuric concentrat pe pereţii eprubetei înclinate. Acidul sulfuric se lasă la fundul eprubetei
şi formează două straturi distincte. Dacă soluţia conţine un glucid ca: hexoză, pentoză, metilpentoză, la limita de
separare a straturilor se formează un inel violet sau roşu. Dacă este un poliglucid, culoarea apare numai după
încălzire, cînd are loc întâi hidroliza şi apoi deshidratarea ozei rezultate. Prin diluare cu apă rezultă un precipitat
albastru-violet.
Dacă în loc de - naftol se lucrează cu o soluţie alcoolică de timol 3% se obţine o culoare roşie rubinie, care
prin diluare cu apă dă un precipitat roşu-carmin.
8. 2. Reacţia cu - naftolul. Această reacţie permite diferenţierea hexozelor de pentoze.
Reactivi: soluţii de glucide 5%
- naftol;
acid sulfuric concentrat
Prepararea reactivului: se dizolvă 0,3 g - naftol în 100 ml acid sulfuric concentrat.
Mod de lucru: Se tratează 2 ml soluţie de oză cu 2-3 ml reactiv, astfel încât cele două lichide nu trebuie să
se amestece (se toarnă reactivul pe peretele eprubetei înclinate). În prezenţa unei pentoze, la suprafaţa de separare
apare un inel albastru. Dacă se lasă un timp, tot stratul de acid sulfuric se colorează în albastru intens. Hexozele dau,
în aceleaşi condiţii, un inel verde-brun, iar stratul de acid sulfuric nu se colorează. (Eprubeta nu trebuie agitată în
timpul experimentului, pentru se evita amestecarea stratului de acid sulfuric cu soluţia glucidului).
8. 3. Reacţia cu acid cromotropic. Această reacţie este dată numai de hexoze.
Reactivi: soluţii de glucide 5%
acid cromotropic
acid sulfuric concentrat
Prepararea reactivului: se dizolvă 0,1 g sare de sodiu a acidului cromotropic în 1 ml apă distilată şi se
completează cu acid sulfuric 70% până la 50 ml.
Mod de lucru: Se adaugă peste 1 ml soluţie de glucid 5 ml din reactivul prepatar. Hexozele dau o coloraţie
violet care se închide la încălzire. Pentozele nu dau această reacţie.
8. 4. Reacţia Selivanov. Este reacţia care diferenţiază aldozele de cetoze. În mediu de acid clorhidric,
glucidele se transformă în derivaţi ai furfurolului, care prin condensare cu rezorcină formează coloranţi xantenici.
Cetozele, în special fructoza, dau o reacţie mult mai rapidă decât aldozele (acestea reacţionează foarte lent). La cald,
în mediu acid, cetozele tratate cu rezorcină dau o coloraţie roşie. Aldozele, în aceleaşi condiţii, dau o culoare
nedefinită de la gălbui la roz pal.

R
R R
O
O O

CHO

+ O HO O O
HO OH HO OH
Reactivi: soluţii de glucide 5%
HCl concentrat;
Rezorcină
Prepararea reactivului Selivanov: se dizolvă 0,15 g rezorcină în 100 ml HCl concentrat, la care se adaugă
200 ml apă distilată.
Mod de lucru: Se lucrează în paralel o probă de glucoză şi una de fructoză. În două eprubete se introduc
câte 5 ml de reactiv. În prima eprubetă se introduce 1 ml soluţie de glucoză şi în a doua 1 ml soluţie de fructoză.
Ambele probe se încălzesc pe baia de apă. În eprubeta cu fructoză apare o coloraţie roşie intensă. Intensitatea culorii
este proporţională cu concentraţia glucidului. În eprubeta cu glucoză apare o culoare roz.
Identificarea fructozei din urină. Fructozuria poate fi pusă în evidenţă prin reacţia Selivanov. Reactivul
Selivanov se poate obţine prin dizolvarea unei cantităţi de 0,1 g rezorcină în 100 ml HCl diluat 1:1 cu apă distilată.
Mod de lucru: Într-o eprubetă se introduc 5 ml reactiv Selivanov şi 0,5 ml urină. Se aduce eprubeta la
fierbere. Coloraţia roşie apărută indică prezenţa fructozei în urină. Dacă nu se colorează, reacţia este negativă. În
cazul în care fructoza se găseşte în cantitate mai mare, la răcire se depune un precipitat roşu, solubil în alcool.
Pentru siguranţă se poate face o probă martor cu o soluţie de fructoză 0,1%, pentru comparare cu proba de urină.
Pentru un om sănătos, proba trebuie să fie negativă. Fructozuria apare în diabetul zaharat şi în unele boli
hepatice. Fructozuria esenţială este o boală ereditară rară (1: 120 000). La persoanele sănătoase, după un consum
mare de fructe poate să apară fructoza în urină.
8. 5. Reacţia Thomas. Este reacţia glucidelor cu aminoacidul heterociclic, triptofan, în mediu acid. Această
reacţie permite atât diferenţierea aldozelor de cetoze, cât şi recunoaşterea unor aldoze.
Reactivi: soluţii de glucide 5%
HCl concentrat;
triptofan.
Prepararea reactivului: se dizolvă 0,2 g triptofan în 50 ml HCl concentrat.
Mod de lucru: Reacţia se realizează pe mai multe probe de diferite glucide. În fiecare eprubetă se introduc 1
ml soluţie de glucid (glucoză, fructoză, arabinoză, manoză etc.) şi 2 ml reactiv. Eprubetele se încălzesc câteva
minute pe baia de apă, la fiebere. După răcire se observă că cetozele dau o coloraţie roşie intensă, aldozele dau
culori mai slabe şi diferite (glucoza- violet; xiloza- brun; arabinoza- violet; galactoza şi manoza- gălbuie etc.).
Glucidele, în mediu acid, dau reacţii de culoare şi cu antrona, floroglucina, anilina şi derivaţii ei etc.
8. 6. Reacţia Bial. Această reacţie este dată numai de pentoze.
Reactivi: soluţii de glucide 5%
alcool amilic;
metil-rezorcină (orcinol);
acid clorhidric concentrat;
clorură ferică.
Prepararea reactivului Bial: se dizolvă 0,4 g orcinol în 200 ml HCl concentrat, la care se adaugă 0,5 ml
soluţie FeCl3 10% proaspăt preparată.
Mod de lucru: Într-o eprubetă se introduc 5 ml reactiv Bial şi 1 ml soluţie de glucid. Se aduce amestecul
lichid la fierbere. Apoi, se lasă eprubeta să se răcească timp de 15-20 minute. Pentozele dau o coloraţie verde, iar
dacă sunt în concentraţie mai mare dau un precipitat verde. Compusul colorat se poate extrage prin agitare cu alcool
amilic. Hexozele nu dau această reacţie.
Identificarea pentozelor urinare cu reactiv Bial.
Mod de lucru: Într-o eprubetă se introduc 5 ml reactiv Bial şi 0,5 ml urină. Se aduce la fierbere, în flacără,
apoi se lasă la răcire 15-20 minute. Prezenţa pentozelor este indicată de apariţia unei coloraţii verzi. Dacă pentozele
se găsesc în cantitate mare, apare un precipitat verde.
Proba este negativă pentru persoanele sănătoase. Dacă proba se face după un consum mare de fructe,
poate fi pozitivă şi pentru persoanele sănătoase. Astfel, arabinoza şi fructoza pot apare în urina persoanelor
sănătoase după ingerarea unor cantităţi mari de fructe. În cazul în care nu s+au consumat fructe, eliminarea
pentozelor indică o pentozurie esenţială, anomalie ereditară inofensivă, cu eliminare de arabinoză racemică şi
xiluloză. Pentozuria esenţială în care se elimină xiluloză este o boală ereditară foarte rară (1: 50 000).
8. 7. Reacţia cu fenilhidrazina. Osazone. Ozele şi oligoglucidele reducătoare reacţionează cu
fenilhidrazina în exces, în mediu de acid acetic şi dau osazone.
Osazonele sunt compuşi frumos cristalizaţi, de culoare galbenă, greu solubile în apă, care se pot recristaliza
din alcool. Fiecare glucid formează o osazonă cu cristale caracteristice (Fig.1) [1, 2]. Aceste cristale privite la
microscop permit identificarea glucidului (condiţia este ca proba respectivă să nu fie un amestec de glucide).

H C N NHC6H5
CHO C N NHC6H5
3 C6H5NHNH2
( CHOH)4 ( CHOH) 3 + C6H5NH2 + NH3
CH2OH CH2OH
hexozã osazonã
Reactivi: soluţii de glucide 5%
 fenilhidrazină sau clorhidratul ei;
acid acetic glacial;
acetat de sodiu 20%;
alcool etilic.
Prepararea reactivului: 10g clorhidrat de fenilhidrazină se dizolvă în 80 ml acetat de sodiu 20% şi se
completează până la 100 ml cu acid acetic glacial.
Mod de lucru: Într-o eprubetă se introduc 1 ml soluţie de glucid şi 3 ml soluţie de fenilhidrazină. Se
încălzeşte eprubeta în baie de apă la fierbere, timp de 30 minute. Apar cristale galbene de osazonă. Se scoate
eprubeta din baie, se lasă să se răcească. Se filtreză cristalele şi se recristalizează din apă sau din alcool. Cristalele
obţinute se examinează la microscop şi se compară cu cele din atlas. 1
Diferenţierea glucozei de lactoza urinară foloseşte reacţia cu fenilhidrazina, prin formarea cristalelor.
Prepararea soluţiei tampon: Se amestecă 20 ml acid acetic glacial cu 50 g acetat de sodiu şi se completează cu apă
distilată până la 100 ml.
Mod de lucru: Într-o eprubetă se iau 10 ml urină, se adaugă 1 ml tampon acid acetic – acetat de sodiu şi un vârf de
cuţit de clorhidrat de fenilhidrazină. Se agită şi se introduce eprubeta în baia de apă (la 70-80°C) timp de o oră. Se
răceşte eprubeta sub un jet de apă. Se ia cu bagheta câteva picături de soluţie cu precipitat, se pun pe o lamă la
microscop, se acoperă cu o lamelă şi se examinează la microscop. Cristalele de glucosazonă se prezintă sub forma
unor ace în mănuchi (snop), iar cele de lactosazonă sub forma unor gheme.

Glucosazonă (x 250)2 Maltosazonă (x 250)2

Galactosazonă (x 160)2 Lactosazonă (x 250)2

Figura 1. Osazonele glucidelor
1.http://slinkyscribblets.weebly.com/biochem-lab/activity-11-formation-of-osazones
2. http://www.didier-pol.net/3osazon.htm
3. I. Popa, N. Arsenescu, Lucrări practice de biochimie, Piteşti, 1994, pag. 16-20