Lucrare de laborator Nr. 4.

Separarea nucleoproteidelor din drojdii, hidroliza

acidă a acestora şi identificarea părţilor componente a nucleoproteidelor
Principiul metodei: Nucleoproteidele sunt proteine conjugate în care
gruparea prostetică e reprezentată prin acizii nucleici- ADN şi ARN, astfel se
deosebesc dezoxiribonucleoproteine (DRNP) şi ribonucleoproteine (RNP). La
izolarea nucleoproteinelor legăturile dintre proteine şi acizii nucleici disociază. Pot
fi utilizate diferite metode de separare a nucleoproteinelor, de exemplu, extracţia
cu o soluţie diluată (0,2-0,4%) de alcaliu, urmată de acidifiere cu acid acetic;
filtrarea prin gel de sephadex etc.
În rezultatul hidrolizei nucleoproteinelor se obţin produsele scindării
constituenţilor acestora, proteinele se descompun (total sau parţial, în funcţie de
condiţiile hidrolizei) până la aminoacizi, iar acizii nucleici – până la nucleotide.
RNP din drojdii hidrolizează cu obţinerea nucleotidelor pirimidinice şi a celor
purinice, ultimele formând prin scindare purine, riboză şi acid fosforic.
Componenţii RNP purinice se identifică prin reacţii specifice.
Utilaje și reactive: Centrifugă; balon cu fund rotund (100 ml); refrigerent cu
reflux; mojar cu pistil; pahar (200 ml), cilindru gradat (50 ml); pâlnie de sticlă
(diametrul 7-8 cm); baghete de sticlă; stativ cu eprubete; nisip spălat şi călit;
drojdii; hidroxid de sodiu, soluţii de 0,4% şi de 10%; acid acetic, soluţie de 10%;
hârtie de indicator universal; acid clorhidric conc.; sulfat de cupru, soluţie de 1%;
amoniac conc.; azotat de argint, soluţie de 1%; reactiv molibdenic (se amestecă
molibdat de amoniu, soluţie de 15% cu acid azotic conc. în raport de 11:9); eter
etilic; acid sulfuric, soluţie de 5%.
Separarea şi hidroliza proteinelor
Mod de lucru: A. În mojar se introduc 5 g drojdie, 2 ml eter, 2 ml apă, se
adaugă 5 g nisip, se omogenizează minuţios, adăugând în porţii mici 40-50 ml
soluţie de NaOH (0,4%). Durata operaţiei e de cca 15 min. Sedimentul se filtrează
sau se separă prin centrifugare. Centrifugatul se toarnă într-un pahar, apoi se
adaugă soluţie de acid acetic de 10% (în porţii mici, a câte 0,5 ml), până la reacţie
slab acidă (5-6 ml). Precipitatul obţinut ce conţine nucleoproteinele este separat
prin centrifugare.
În balonul pentru hidroliză se introduce sedimentul nucleoproteinelor şi 20
ml soluţie de acid sulfuric de 5%. Se etanşează refrigerentul de reflux şi se fierbe
lent 0 oră pe o sită de azbest. Hidrolizatul se răceşte, se filtrează şi în soluţia
transparentă obţinută se identifică produsele hidrolizei acide a RNP.
B. Scindarea hidrolitică a nucleoproteinelor poate fi efectuată şi fără o
separare prealabilă. Pentru aceasta se refluxează lent timp de 60-90 min.
Amestecul format din 5-7 g drojdie şi 40 ml soluţie de acid sulfuric de 5%.
Identificarea produselor de hidroliză se realizează după răcirea şi filtrarea
hidrolizatului.
Identificarea proteinelor. Reacţia biuretului
La 1 ml de filtrat se adaugă 2 ml hidroxid de sodiu, soluţie de 10% şi o
picătură sulfat de cupru, soluţie de 1%, apare o coloraţie albastră-violetă.
Comentaţi fenomenul, studiind mecanismul acestei reacţii, prezentat în lucrarea 2.
Identificarea ribozei. Reacţia Trommer
Într-o eprubetă se introduc cca 1 ml de filtrat şi se alcalinizează cu NaOH,
soluție de 10% controlându-se pH-ul cu hârtie de indicator. Se adaugă cu picătura
sulfat de cupru, soluţie de 1%, agitând amestecul până la formarea unui sediment.
Se încălzeşte sedimentul până la fierbere. Apare un precipitat cărămiziu. Explicaţi
cele observate pe baza mecanismului reacţiei Trommer, comentat în lucrarea 5.
Identificarea bazelor purinice
Într-o eprubetă se introduc 2 ml de filtrat, se tratează cu soluţie conc. de
amoniac până la reacţie net alcalină, apoi se adaugă 1 ml soluţie azotat de argint.
Se observă formarea treptată a unui sediment sur al sărurilor de argint ale bazelor
purinice:

Identificarea acidului fosforic

La 1 ml de filtrat se adaugă un volum egal de reactiv molibdenic, amestecul
se fierbe câteva minute. Soluţia se colorează în galben. La răcire se formează
sedimentul galben al fosfomolibdatului de amoniu:
12(NH4)2MoO4 + H3PO4 +21HNO3 → (NH4)3PO4 12MoO 3 ↓ + 21NH3NO3 +
12H2O