Lucrare de laborator Nr. 11. Coenzime vitaminice.

Dozarea vitaminei C în
materialul vegetal
La formarea centrului activ al unor fermenţi participă molecule de
cofermenţi (coenzime), ce reprezintă compuşi organici de natură neproteică.
Coenzimele pot fi clasificate potrivit funcţiilor, pe care le îndeplinesc în cataliza
enzimatică: 1) coenzime legate cu enzimele clasei oxidoreductazelor: coenzime
nicotinamidice şi flavinice, acidul lipoic, glutationul, acidul ascorbic,
ubichinonele, vitaminele grupei K; 2) coenzime legate cu enzimele clasei
transferazelor: nucleozidfosfafi, coenzima A, acidul tetrahidrofolic, fosfaţii
glucidelor, coenzime piridoxalice; 3) coenzime legate cu enzime ce aparţin
clasei liazelor, izomerazelor, ligazelor: tiaminpirofosfatul, biotina, coenzimele
cobaminice.
În organismele superioare cofermenţii nu pot fi sintetizaţi, iată de ce
aceștia trebuie neapărat să fie prezenţi în hrană. Deoarece unica funcţie a
coenzimelor în metabolism este participarea în procesele catalitice, necesarul
zilnic în cofermenţi este foarte mic (de ordinul mg).
Majoritatea coenzimelor sunt derivaţi ai vitaminelor, de aici şi
importanţa majoră a vitaminelor în fiziologia alimentaţiei.
Vitamina C - acidul ascorbic - previne apariţia scorbutului, maladie
caracterizată prin depresie generală, dereglări ale sistemului cardiovascular,
hemoragii, care apar ca rezultat al măririi permeabilităţii şi fragilităţii vaselor
sanguine.
Ca structură chimică vitamina C e foarte apropiată de hexoze şi prezintă
lactona acidului dienolgulonic (2-ceto-α-gulon--lactonă). Prezenţa grupării
dienolice (-C(OH)=C(OH)-) condiţionează oxidabilitatea sporită a vitaminei C
(vezi lucrarea 2.3.2.).
Nativă este numai L- forma acizilor ascorbic şi dehidroascorbic, în timp
ce forma D- obţinută sintetic, nu este biologic activă.
 Cea mai mare cantitate de vitamină C în organisme se conţine în forma
enolică. Se consideră, că funcţia principală a acestei vitamine este menţinerea
grupelor sulfhidrilice ale proteinelor enzimatice în stare redusă, fapt care
contribuie la activarea multor enzime. Fiind prezentă în ţesuturile tuturor
animalelor şi plantelor superioare, vitamina C nu poate fi sintetizată în
organismele primatelor, cobailor. Marea majoritate a animalelor şi, probabil,
toate plantele, pot sintetiza acidul ascorbic din glucoză.
Doza zilnică de vitamină C pentru omul matur constituie 50-70 mg;
pentru prevenirea scorbutului este suficientă o cantitate de 10 mg de vitamină pe
zi.
Vitamina C se foloseşte în industrie ca antioxidant la producerea
grăsimilor alimentare şi a sucurilor de fructe, pentru prevenirea formării
nitrozaminelor cancerogene din nitriţi, adăugaţi în mezeluri pentru păstrarea
culorii naturale, pentru vitaminizarea laptelui şi a produselor lactate. În chimia
analitică acidul ascorbic se utilizează pentru dozarea oxidanţilor, de ex. a Fe
(III), Hg (II) prin metode titrimetrice şi a P, Mo, Si, Fe (III) prin analiză
fotometrică.
Reacţiile calitative de identificare a vitaminei C se axează pe proprietatea
acesteia de a reduce albastrul de metilen, 2,6-diclorfenolindofenolul,
hexacianoferatul(III) de potasiu, nitratul de argint.
Principiul metodei: Acidul ascorbic se dozează folosind soluţia cu titrul
cunoscut a 2,6-diclorfenolindofenolului. Se concluzionează despre conţinutul
vitaminei C în materialul cercetat pe baza cantităţii de reactiv consumat pentru
oxidarea vitaminei. Procesele redox au loc potrivit schemei:
 În mediu neutru şi bazic soluţia apoasă a sării de sodiu a 2,6-
diclorfenolindofenolului e colorată în albastru, iar în mediu acid aceasta are
culoarea roză - violetă.
Utilaje și reactive: microbiurete (2 buc.); pipete; baloane conice (50 şi
100 ml); pahare de laborator (100 ml, 4 buc.); baloane cotate (100 ml, 2 buc.);
cilindre gradate; mojar cu pistil; nisip de cuarţ; pâlnii de sticlă; hârtie de filtru;
material vegetal: varză, măcieşe, suc de roşii, ace de conifere, lămâi, măr, cartof;
acid clorhidric, sol. 5%; 2,6- diclorfenolindofenol, sol. 0,001 N (Se cântăresc
într-o fiolă 130 mg de reactiv şi printr-o pâlnie se transferă într-un balon cotat de
500 ml, spălând minuţios fiola şi pâlnia. Se adaugă 10 picături hidroxid de
sodiu, soluţie 0,01 N şi apă distilată (~250 ml), se agită energic până la
solubilizarea 2,6-diclorfenolindofenolului. Se aduce la cotă cu apă distilată. Se
agită, apoi se filtrează într-un vas uscat din sticlă întunecată. Reactivul este
stabil trei zile.); acid ascorbic, sol. 0,1%; iodat de potasiu, sol. 0,001 N; iodură
de potasiu, sare cristale; amidon, sol. 1%; iodură de potasiu, sol. 5%; peroxid de
hidrogen, sol. 3%; acid sulfuric, sol. 2%.
Mod de lucru:
Determinarea titrului soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol.
 Pentru determinarea cantitativă a vitaminei C se foloseşte soluţie de 2,6-
diclorindofenol cu titrul determinat. Titrul reactivului se determină în ziua
lucrării, folosind soluţia de concentraţie cunoscută a acidului ascorbic. Cu acest
scop se iau 2 ml acid ascorbic, soluţie 0,1 % şi se dizolvă în 50 ml acid sulfuric,
soluţie 2%. Apoi 5 ml de soluţie căpătată se titrează cu 2,6-diclorfenolindofenol
din microbiuretă până la apariţia coloraţiei roze. Se notează volumul de 2,6-
diclorfenolindofenol consumat pentru titrare – V1. Imediat după aceasta se
titrează acelaşi volum de acid ascorbic (5 ml) cu iodat de potasiu, soluţie 0,001
N cu adăugarea în balon, înainte de titrare, a câtorva cristale (nu mai mult decât
0,1 g) iodură de potasiu şi a 5 picături de amidon, soluţie 1%. Titrarea se
efectuează atent până la apariţia culorii slab albastre şi se notează volumul
soluţiei de iodat de potasiu, folosit la titrare - V2. Aşa cum în ambele cazuri au
fost titrate volume egale din soluţia acidului ascorbic de 0,1%, cantităţile de
iodat de potasiu şi 2,6-diclorfenolindofenol sunt echivalente între ele. Se ştie, că
1 ml iodat de potasiu, sol. 0,001 N este echivalent cu 0,088 mg de acid ascorbic,
atunci titrul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol exprimat în mg de acid ascorbic
va fi:
T= 0,088 × V2/V1,
Pregătirea extractului vegetal
Obiectul vegetal în cantitate variind între 1 g (ace de conifere) şi 10 g
(măr sau cartof) se taie bucăţi mici şi se pisează în mojar cu adăugare de puţin
nisip şi a unui volum mic de acid clorhidric, sol. 5% până la formarea unei mase
omogene. în total pentru operaţie se consumă 50 ml de acid şi amestecul se trece
cantitativ cu ajutorul pâlniei în balonul cotată de 100 ml. Apoi în balon se
adaugă apă distilată până la cotă. Conţinutul balonului se agită bine şi se
filtrează. Extractul căpătat trebuie să fie absolut transparent.
Determinarea conţinutului acidului ascorbic în extract
În balonul pentru titrare se introduc 10 ml de filtrat şi se titrează din
microbiuretă cu soluţia 2,6-diciorfenolindofenolului până la apariţia culorii roze
stabile timp de 0,5 - 1 min. Pentru fiecare extract se efectuează în paralel nu mai
puţin de 2-3 titrări, notându-se volumul mediu de reactiv, consumat pentru
titrare. Pentru comparaţie se realizează şi experienţa de control cu o probă de
extract vegetal (10 ml), în care vitamina C a fost distrusă prin fierbere în
prezenţa câtorva picături de peroxid de hidrogen. Dacă în extract se conţine acid
ascorbic, la titrare soluţia se decolorează, iar la adăugarea în exces a reactivului -
se colorează în roz (toată cantitatea de acid ascorbic în probă deja este oxidată şi
reactivul nu se mai reduce). În proba de control coloraţia roză apare în urma
adăugării câtorva picături de reactiv (lipseşte reducătorul). Se calculează
conţinutul de acid ascorbic (mg per 100 g de material) cu formula:
C = a×T× 1 0 0 × b / 1 0× m mg%,
unde: a - volumul mediu de 2,6-diclorfenolindofenol consumat la titrare, ml;
b - volumul total al extractului (100 ml),
T - titrul 2,6-diciorfenolindofenolului (exprimat în mg acid ascorbic);
m - masa materialului cercetat, g.
Tabelul 8. Conţinutul acidului ascorbic în plante şi produse vegetale
Produs Vit. C mg/100g Produs Vit.C mg/100g
Ardei verde 100-200 Țelină 10
Ardei roșu 250-300 Sfeclă 5-10
Pătrunjel 150 Sfeclă de zahăr 30-40
Mărar 50-150 Ridiche 20
Cartofi 15-22 Dovlecei 16-30
Fasole albă 0-5 Castraveți 5
Mazăre alba 25-35 Ceapă 60
Varză albă murată 17-25 Vinete 15
Varză roșie 50 Pepene verde 7
Conopidă 70 Pepene galben 20
Morcovi 5 Lobodă 140-150
Păstârnac 40 Salată 10-50
Hrean proaspăt 200 Suc de lămâie 50-70
Spanac 50 Portocale 40
Urzici 100 Mandarine 30-45
Lucernă 225 Afine 5
Tomate 18-60 Agrișe 30-45
Tomate pasta 30-50 Coacăză albă 5-6
Suc de tomate 10 Coacăză roșie 30-70
Pere 4-10 Coacăză neagră 140-300
Piersici 10-19 Căpșuni 25-120
Caise 7-20 Fragi 30
Prune 7-14 Zmeură 28-45
Gutui 10-38 Mure 5
Coarne 50-60 Măcieșe 120-800
Ananas 5-12 Ace de conifer 100-300
Lămâe 50 Miere de albine 100

Notă: Prin această metodă este dozată numai foma redusă a acidului ascorbic.
Apreciaţi rezultatele determinărilor, consultând Tabelul 8.