Determinarea resveratrolului din vin

Din punct de vedere biochimic, resveratrolul este o stilbena (principala stilbena din struguri),
apartinand clasei polifenolilor non-flavonoidici (clasa unde sunt inclusi, de exemplu, si curcumina
sau lignanii). S-a constatat ca unele plante il sintetizeaza ca raspuns la diferite circumstante
stresante (lezare, expunere la doze ridicate de radiatii ultraviolete, parazitare fungica etc). Se gaseste
in ambele forme stereoizomerice (cis – in cantitati foarte mici si trans cel mai prezent) si este
liposolubil.
In ceea ce priveste alimentele, substanta se gaseste in struguri (doar in coaja si in cantitati
diferite in functie de soi, regiune si expunerea la infectii fungice), in vin, alune, fructe de padure din
familia Vaccinum (coacaze rosii si negre, afine, merisoare ). Nivelul de resveratrol din vin depinde
de durata perioadei in care vinul vine in contact cu cojile strugurilor. De aceea vinurile albe si rosé
au mai putin resveratrol decat vinurile rosii. Forma de resveratrol din struguri este aceea de glucozid
trans, iar in vin se gasesc si cantitati crescute de agliconi de resveratrol, care se datoreaza
fermentatiei glucidice. In vin se gaseste si resveratrol in forma cis. Este de retinut ca vinul rosu are
un continut bogat de polifenoli cu actiune sinergica , resveratrolul fiind numai unul dintre acestia.

Importanţa resveratrolului derivă din trei domenii de interes:

• oenologic – este un nou compus fenolic, provenit din struguri, care participa la culoare, la
caracterul gustativ, la invechirea vinului, intervine in reactiile de oxidare, interactioneaza cu
proteinele.
• fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin stimularea apararii
naturale a plantei;
• farmacologic – face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori de radicali liberi
in organism; protector impotriva bolilor cardiovasculare; proprietati chimiopreventive impotriva
cancerului; previne inflamatiile asociate cu artrita si reumatismul; creste cantitatea de colesterol
„bun”(HDL) si scade pe cel „ rau”(LDL).
Resveratrolul (trans 3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu rezistenta vitei de
vie la putregaiul cenusiu şi este produs de boabele de struguri sub influenta radiatiilor UV. Sinteza
resveratrolului a fost localizata in pielita bobului, ceea ce indica ca rezistenta principala a
strugurilor la atacul de putregai are loc la acest nivel (PEZET R,-1998) .
Resveratrol este molecula-mamă dintr-o familie de polimeri numit viniferins.
Peretii celulari ATAC

Botrytis
cinereea Fitoalexine
RESVERATROL
ɛ - viniferina

APARARE

Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de planta, in stare
latenta, o perioada lunga de timp ( din iunie pana in septembrie) si se dezvolta dupa coacerea
strugurilor.

Ciclul infectiei şi dezvoltarii Botrytis cinereea

 Fenomenul de latenta, timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa, nu a fost explicata.
Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi: umiditatea, temperatura, tesuturile moarte,
leziunile plantelor, lumina, etc.
Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir.
Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici – resveratrol, resveratrol trans- de-
hidrodimer şi ε - viniferina – in vita de vie dupa infectia cu Botrytis cinerea, a fost pusa pe seama
latentei acesteia.
Biosinteza stilbenilor, flavonoizilor şi taninurilor, decurge din metabolismul secundar al
aminoacizilor – metabolizarea L- fenil alaninei in acid cumaric.
Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina, un aminoacid aflat in
cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilben sintaza sufera o deviere cu formare de
resveratrol .

Ciclul de sinteză al resveratrolului

Cercetarile efectuate au avut ca obiectiv elaborarea unei metode de analiza a resveratrolului,

care sa fie utilizata pentru identificarea şi cuantificarea lui in struguri, vin şi alte componente ale
vitei de vie, cunoscut fiind faptul ca resveratrolul a fost citat pentru prima data in pielita strugurilor,
ca un compus in prevenirea bolilor şi apoi in vin ca aport benefic pentru sanatate. Metoda de
separare cuprinde extractia prealabila a neflavonoizilor din struguri, must, vin si alte produse
vitivinicole - extractie cu metanol si acetat de etil, evaporare la sec, reluare cu metanol sau
acetonitril si concentratul analizat prin HPLC.
 Structura chimica a trans si cis resveratrolului

a) cis – resveratrol b) trans – resveratrol

Referinte

Resveratrol
other names
trans-3,5,4'-Trihydroxystilbene;
3,4',5-Stilbenetriol;
trans-Resveratrol;
(E)-5-(p-Hydroxystyryl)resorcinol (E)-5-(4-
hydroxystyryl)benzene-1,3-diol
Properties
Molecular formula C14H12O3
Molar mass 228.24 g mol−1
Exact mass 228.078644
white powder with
Appearance
slight yellow cast
Solubility in water 0.03 g/L
Solubility in DMSO 16 g/L
Solubility in ethanol 50 g/L
 MATERIAL ŞI METODĂ

Pentru analiza conţinutului de trans - resveratrol, se va utiliza HPLC, care va permite

separarea metaboliţilor şi analiza acestor compuşi cromatografic. Astfel se vor compara picurii
obtinuti prin cromatograma HPLC cu cei standard , putandu-se astfel identica daca exista
resveratrol in produs, şi la ce cantităţi.
Cis-izomerul este, probabil, transformat în timpul procesului de vinificatie, dar de obicei nu
se ajunge la concentraţia trans-izomerul în vin.

Metode de extractie- purificare si de determinare ale trans - resveratrolului

• A Metoda de extractie-purificare bazata pe extractia cu solventi;

• B Metode de determinare : HPLC.

A 1. Extracţia din vin

Vinul este evaporat la ½ din cantitate in evaporator sub vid, pentru indepartaea alcoolului. Din vinul
dezalcoolizat, compusii fenolici se extrag cu acetat de etil conform schemei

Vin ( 20 μl)
+ CH3 OH (50 ml )(metanol)
Refluxare ( 30’ )
Separare faza lichida

Filtrare

Evaporare sub vid ( la sec )

Rezidiuu
+ 30 ml. Apa
Extractie cu acetat de etil (50 ml )

Evaporare sub vid ( la sec )

Rezidiul
+ 5 ml metanol

Evaporare sub vid ( la sec)

+ acetonitril

Analiza cromatografica
B. 2. Metoda de separare prin HPLC

Extractele obţinute din prelucrarea probelor de vin sunt injectate în coloană .

Conditii de lucru :
- Coloana Nucleosil-C18 250 mm x 4,6 mm ; debit 1 ml/minut
- Elutie: Sistem gradient = 2 solventi : A – apa
B - apa acetonitril
H2O / CH3 CN 2:8 (v/v)
Volumul injectat : 20μl

Metoda de separare a compuşilor fenolici prin HPLC are următoarele avantaje:

- este o metodă rapidă pentru separarea, identificarea şi determinarea cantitativă a compuşilor aflaţi în
amestecuri complexe;
- dă posibilitatea separării substanţelor aflate în concentraţii foarte mici în amestecurile de analizat;
- este o metodă simplă şi uşoară pentru interpretarea rezultatelor obţinute;

HPLC: Calibrare Standard

Figura 1. Trans-resveratrol standard . Serii diferite de dilutie: 20 ug/mL (rosu), 10ug/mL

(violet), 5ug/mL (albastru), 2.5ug/mL (verde). ( curba de calibrare).

Figura 2. Cromatrograma HPLC pentru trans-resveratrol standard

HPLC: Extractia vinului rosu

Figura 3. Extractie vin rosu. A)Cromatograma extract vin rosu; tipurile de vin evidentiate sunt:
Merlot din Australia (rosu), Shiraz din Australia (verde), Primitivo din S. Italy (violet). Cu linie
punctata albastra este trans-resveratrol standard . B)Zoomed-in view of the resveratrol peak region.

HPLC: Extractia vinului alb

Figure 4. Extravtie vin alb. A)Cromatograma extract vin alb; tipurile de vin sunt Sauvignon
Blanc din France (rosu) si Chardonnay din N. California (violet). Cu linie punctata albastra este
trans-resveratrol standard . B)Zoomed-in view of the resveratrol peak region.

Figura 5. Concentratia Resveratrolului calculata cu ajutorul cromatogramele de mai sus şi curba de

etalonare. Eşantioanele de vin rosu sunt reprezentate în roşu, cele pentru vinul alb în galben. In
proba de Chardonnay nu s-a detectat Trans - Resveratrol.
• Rezultatele arată clar că vinurile roşii conţin trans-resveratrol în cantităţi semnificative, în timp ce
vinuri albe contin cantitati foarte mici.
 Bibliografie:

..http://www.univagro-iasi.ro/Horti/Lucr_St_2005/63_heroiu%20g.pdf
..http://2008.igem.org/Team:Rice_University/RESULTS#A._Genetic_Engineerin
g_and_Part_Construction
.. http://en.wikipedia.org/wiki/Resveratrol
..http://www.doiserbia.nbs.bg.ac.yu/img/doi/0352-5139/2008/0352-
51390811027D.pdf