Ce am invatat in cursul 1

Biotehnologia definitie Biotehnologia verde, rosie si alba

Curs 2

Procese biotehnologice

Conceptul de proces biotehnologic

Cerintele consumatorului orienteaza sectoarele economice. Consumatorul are nevoie de: un mediu prielnic, nepoluat; alimente sanatoase; venit corespunzator.

dezvoltarea unor activitati noi care sa imbunatateasca viata oamenilor biotehnologia.

Pana in anii 70 conceptul de biotehnologie este, putin folosit; microbiologia industriala, se refera la utilizarea industriala a potentialului productiv al culturilor de microorganisme. revolutia stiintifica din biologie a condus la aparitia si evolutia ingineriei genetice - doua mari etape: - cea a biotehnologiei clasice (traditionale), ca substitut, inlocuitor modern al microbiologiei industriale si, - biotehnologia moderna (noua biotehnologie), care se bazeaza pe ingineria genetica.

La dezvoltarea biotehnologiei moderne au mai intervenit si alte sectoare de activitate ca: Ingineria biochimica, desprinsa din ingineria chimica se contureaza tot mai mult ca o stiinta inginereasca de sine statatoare. Ingineria enzimatica conduce la dezvoltarea industriilor alimentara, farmaceutica, textila, energetica, extractiva etc., care utilizeaza bioconversii si biotransformari in scopuri preparative, asistate de enzime drept catalizatori.

Biologia cu toate domeniile ei: - microbiologie - biologie moleculara/celulara - inginerie genetica Chimie Biochimie - inginerie enzimatica - inginerie a proteinelor - inginerie a materialelor (biomateriale) demonstreaza caracterul multi- si pluridisciplinar al biotehnologiei ca stiinta.

Biotehnologia: ultima revolutie tehnologica majora a secolului; este strans legata de problemele de maxim interes ale dezvoltarii umane: diagnosticarea si vindecarea bolilor, securitatea si siguranta alimentara si protejarea mediului inconjurator; va deveni una dintre cele mai importante arme de lupta impotriva foametei, malnutritiei populatiei.

Imbunatatirea rezistentei naturale (a plantelor si a animalelor) fata de boli sau stres va conduce la: reducerea utilizarii pesticidelor chimice reducerea utilizarii fertilizatorilor si medicamentelor intensificarea implementarii practicilor agronomice rentabile intensificarea metodelor de conservare sau de reducere a eroziunii solului.

Biotehnologia ofera: noi cai de protejare si imbunatatire ambientala, prin metode de bioremediere a aerului, solului si apelor poluate, a deseurilor; dezvoltarea unor procese si produse industriale mai curate (biocataliza).

Principalele domenii biotehnologice sunt: Biotehnologia plantelor - reproducere si propagare, modificari genetice, ameliorare a conditiilor de crestere si a unor proprietati, protectia plantelor, biodiversitate, ecologie etc.. Biotehnologia animala - reproducere, productie, ameliorare a cresterii si dezvoltarii, ameliorare si modificare ale unor caracteristici de productie, acvacultura, biodiversitate etc.. Biotehnologia mediului - degradare/transformare a poluantilor, tratare si bioremediere ale solurilor, bioepurare a apelor reziduale, recuperare si biotransformare ale unor produse secundare din ape reziduale etc..

Biotehnologie industriala obtinerea de produse terapeutice, nutrienti, produse de diagnostic, produse alimentare si bauturi; imbunatatire a calitatii hartiei, a produselor textile si din piele; obtinere de produse chimice si formule de detergenti de ultima generatie.

Obtinerea proteinelor reprezint principala categorie de produse terapeutice - chirurgia, tratarea traumatismelor (refacerea esuturilor), boli cronice degenerative, infecioase, microbiene i virale, ereditare, terapia anticanceroas.

Din 1982, au fost lansate n producie peste 95 de proteine sau peptide terapeutice, alte sute fiind n curs de dezvoltare i testare. peptide scurte (cu mai puin de 30 de aminoacizi) pot fi sintetizate chimic, celelalte sunt produse de celule vii (n general, recombinante exprimnd proteine umane) de bacterii, fungi, insecte sau mamifere, obtinute prin biosintez n condiii de sterilitate.

Costurile mari de capital necesare extinderii capacitilor de producie au determinat trecerea la producia de proteine cu animale transgenice (ex. vaci, capre) sau plante transgenice, eliminnd riscul contaminrii virale, existent la celulele de mamifere.

L-aminoacizii pot fi obinui, industrial, din hidrolizate proteice (ex. L-cistein din hidrolizat de pr), dar n urma unor procese laborioase i poluante; sinteza chimic e o alt cale de producere a aminoacizilor, dar n form racemic (ex. D,L-metionin). n prezent, majoritatea aminoacizilor se produce prin biosintez cu bacterii sau enzime, cu avantajul obinerii selective numai a izomerului asimilabil L-. nceput cu acidul L-glutamic, biosinteza microbian de Corynebacterium glutamicum a realizat, cu mutani ai acestei bacterii, ali aminoacizi importani, ca L-lizin i L-treonin.

1.

n prezent, utiliznd tehnica RMN cu 13C, s-a reuit descifrarea cilor metabolice ale biosintezei bacteriene, cunoscnd, astfel, punctele cheie asupra crora s-ar interveni prin recombinare genetic, supraexprimnd genele relevante (inginerie metabolic).
Dezvoltarea n ultimii ani a metodelor de secveniere complet a genomului bacterian a permis cunoaterea genomului Corynebacterium glutamicum.

2.

3.

Tehnologia cip-ADN poate conduce, prin transcripie i marcare fluorescent, la identificarea genelor active i a mecanismelor de reglare a metabolismului.

Cercetarea proteomic prin gelelectroforez i spectrometrie de masa, permite analiza diferitelor enzime necesare biosintezei aminoacizilor si produse de bacterii n condiii variate.
4.

separare i caracterizare a proteinelor celulare, chiar la concentraii infime cunoaterea tintelor terapeutice si drug-design-ul- sau proiectarea structurilor selectiv active.
-

5. aceste tendinte recente n cercetare constituie baza creterii performanelor bacteriilor productoare de aminoacizi.

Biotehnologia medicala si genetica cuprind: Genomica - activiti de secveniere a genomului uman i a altor organisme procariote sau eucariote; provocarea - stabilirea funciei genelor, ca precondiie a identificrii intelor terapeutice poteniale.

n acest sens, apar: 1. genomica de tip comparativ, identificnd cile metabolice i funciile eseniale n organismul viu, genele lor comune, crora le corespund zone de reglare ca poteniale inte terapeutice;
2.

secvenierea genic a organismelor patogene, permind identificarea intelor pentru medicamentele care le pot combate virulena i caracterul patogen;

3.

4.

5.

sisteme model de analiz genomic, ca drojdii, produi de exprimare ai unor gene umane putnd deveni inte ale medicamentelor; studiul interaciunilor ntre proteine i ntre acestea i ADN, furniznd mecanisme de reglare ca posibile inte terapeutice; identificarea mutaiilor genetice asociate bolilor, produii generai fiind, de asemenea, inte poteniale.

Informatica in biotehnologie, bioinformatica, la interfaa dintre biologie i informatic - prelucrarea computerizat a informaiilor permind, naintea screening-ului, modelarea i simularea n scopul prediciei i seleciei. screening-ul noilor medicamente poteniale: s-a ajuns la aa-numitele sisteme de screening cu debit nalt sau ultranalt, (high throughput screening HTS sau UHTS), utiliznd biodeterminri corespunztoare acestor mari viteze de testare: bazate pe interaciune ligandreceptor sau sisteme celulare, ex. celule animale pentru secvene genice omoloage.

principii de detecie (cu semnale electrice, de scintilaie, luminiscen, fluorescen . a.) adecvate robotizrii i automatizrii, care permit funcionarea independent de comand uman timp de 24 ore. prin biochimia i chimia combinatorie se obtine creterea numrului de structuri propuse i sintetizate pornind de la structuri bloc conductoare n urma screening-ului, sintetiznd i separnd un numr mare de derivai prin metode automatizate. Tehnologia informaiei se aplic la realizarea unor biblioteci de asemenea structuri, care permit interpretarea i selecia celor ce candideaz la studiul chimic.

dezvoltarea proceselor cu membrane semipermeabile, nlocuind separrile convenionale, avantaje: utilizarea unor temperaturi sczute (energoeconomice, menajeaz bioprodusele, n general termolabile); recuperarea substanelor valoroase, care nsoesc produsul principal; separarea nalt - selectiva a produselor; caracterul modular, descentralizat al funcionrii instalaiilor.

Studiu mai individualizat referitor la tipul de membrane si condiiile adecvate unui anumit proces, n comparaie cu tehnicile clasice de separare, avnd un caracter mai universal i o verificare mai ndelungat n practic.

Domeniile de aplicaii ale acestei tehnici moderne includ: biosinteza n bioreactoare cu celule imobilizate pe membrane; procesarea down-stream (in flux continuu) a mediilor dup biosintez; obinerea unor formulri cu eliberare controlat a substanei active imobilizate pe membrane; obinerea de emulsii la nivel de nanoparticule; sterilizarea la rece a mediilor i produselor; purificarea apelor uzate.

Procese de biosinteza

biosinteza de compusi noi = procesul de crestere al microorganismelor pornind de la substantele nutritive din mediu. Celula = factor biochimic microscopic. Nutrienti: azotul, carbonul, oxigenul etc. sunt introdusi in celula si transformati printr-o serie de reactii. Activitatile metabolice din interiorul celulei sunt reglate atat in interiorul cat si din exteriorul celulei. Activitatea biologica a celulei este extrem de sensibila la mediul la care este expusa. La reglarea complexa care apare in interiorul celulei este foarte important sa se inteleaga cum afecteaza factorii de mediu si nutritionali metabolismul celular.

Activitatea normala a microorganismelor este conditionata de existenta unui anumit raport intre volumul celulei si suprafata ei. In timpul cresterii celulei, raportul suprafata/volum se modifica deoarece suprafata creste cu o ratie patratica iar volumul cu o ratie volumica, ceea ce conduce la o micsorare relativa a suprafetei. Pe masura ce dimensiunile celulei cresc se produce o alterare a echilibrului biologic al celulei deoarece concentratia unor compusi scade iar altii se acumuleaza in cantitate mai mare, ingreunand astfel circulatia substantelor prin difuziune in ambele sensuri. Din aceasta cauza apare diviziunea celulara ca o forma de reglare automata a activitatii celulare.

Multiplicarea procariotelor (celulelor bacteriene) se realizeaza prin doua cai: - diviziunea simpla, direct sau binara = multiplicarea generala - inmugurirea sau ramificarea (exceptionala) fiind prezenta la un numar redus de bacterii. In timpul unei biosinteze industriale, reactiile biochimice care se produc au la baza: Mediu de cultura(substrat) +O2+inocul = CO2+NH2+biomasa noua+alti produsi finali

Corelatii intre numarul de celule si biomasa celulara

Grupe de mo
Drojdii Mucegaiuri Superioare Bacterii Virusuri

Nr. Celule
2x10(13)

Masa, g
2,9

10(8) 4x10(8) 1-5 2x10(10) 0,02 10(11) 0,0005

Medii de cultura

Un mediu de cultura = amestec de substante care asigura toate componentele necesare pentru metabolismul celulei, si anume: surse de carbon; azot; substante minerale; factori de crestere; la o concentratie a substantelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare; cu valori de pH si rH optime cresterii si multiplicarii microoranismelor de cultivat. Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea si conservarea microorganismelor sau pentru obtinerea prin cultivare a produselor de biosinteza microbiana. Mediile pot fi procurate de la firme producatoare sau pot fi preparate in laborator.

Mediile de cultura pot fi generale sau selective. Cele generale sunt folosite pentru cultura tuturor bacteriilor, drojdiilor sau mucegaiurilor. Mediile selective sunt special pregatite de a inhiba anumite microorganisme si a favoriza pe cele care se doresc a fi studiate.

Cultura = crestere controlata a unui

microorganism. Cultura microorganismelor este utilizata pentru a creste numarul de celule care se doreste a fi studiate. Microorganismele sunt adaugate in mediul de cultura care contine nutrienti pentru crestere. Cultura este incubata una sau mai multe zile, la temperatura optima a fiecarui organism. In multe cazuri microorganismele sunt crescute pe placi cu agar. Microorganismele se multiplica formand colonii. O colonie creste in locul in care o singura celula a fost innoculata. O colonie este ca o clona. Ea poate fi pura daca nu exista in jurul ei alte tipuri de microorganisme in colonii care o pot contamina.

culturile lichide - microorganisme anaerobe. Prezenta celulelor de microorganisme este evidentiata prin aparitia unei tulbureli a lichidului, care se intensifica in timp ce cantitatea de masa celulara creste. culturi pe medii solide se obtin prin adaugarea in mediile lichide a unor agenti de solidificare ca: agaragar (geloza), un poliglucid obtinut din alge ale genului Gelidium avand in stuctura molecule de galactoza si acid D-galacturonic legate prin legaturi 1,2 si 1,3 glicozidice. In stare purificata se prezinta sub forma de pulbere sau fibre la care se adauga 0,5 pana la 2% mediu lichid. Se solubilizeaza la temperatura de fierbere si gelifica la temperatura de 42-45C.

Un alt agent de solidificare este gelatina, de natura proteica, extrasa din tesuturi colagenice. Se foloseste in cantitate de 12-15%. Se fluidifica la temperaturi mai mari de 35C si gelifica lent sub temperatura de 30-35C. Cultivarea microorganismelor necesita tehnici si materiale sterile. Sterilizarea este un proces de eliminarea a tuturor microorganismelor. Sterilizarea se poate face prin incalzire in cuptoare, etuve, autoclave etc. De asemenea pentru sterilizare se pot folosi filtre microbiologice, care sunt in general scumpe si substante chimice (dezinfectanti, antiseptici, antibiotice) care impreuna cu sterilizarea prin incalzire sunt cele mai folosite. Si radiatiile pot fi agenti de sterilizare. Nivele ridicate de radiatii pot omora microorganismele prin distrugerea materialului genetic (ADN si ARN).

Cand microorganismele cultivate cresc pe medii de cultura trebuie sa se ia masuri preventive ca alte microorganisme sa nu le infecteze. Multe dintre micoroganismele cultivate, care se doresc a fi studiate, au nevoie de aer, dar odata cu aerul pot intra si alte micoorganisme. Din cauza acestor cerinte ale microorganismelor, mediile de cultura sunt diferite. Se cunosc a fi folosite medii de cultura generale, selective, de diferentiere, de imbogatire. O alta clasificare poate fi facuta in, sintetice sau naturale.

Mediile de cultura generale utilizate frecvent sunt: bulionul

de carne lichid sau gelozat (BCA), mediul triptona-extract de drojdie-glucoza-agar (TEGA) pentru cultivarea bacteriilor si mustul de malt agar (MMA) pentru cultivrea drojdiilor si mucegaiurilor. Mediile de cultura generale pot fi definite cand in compozitia lor intra substante chimice pure, precis dozate conform retetei si medii complexe in care intra compusi naturali cu o compozitie variabila (ex. soia su drojdiile). Medii de cultura selective sunt medii definite sau complexe, cu o compozitie chimica definita care permit dezvoltarea unui numar restrans de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii contin pe langa substante nutritive si inhibitori ai altor microorganisme insotitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se doreste a fi selectionata.

De exemplu, multe bacterii gram negative nu pot creste la concentratii mari de sare. in timp ce bacteriile gram pozitive pot. Mediile cu continut mare de sare selecteza bacteriile gram pozitive de cele gram negative. Medii de cultura de diferentiere permit separarea speciilor in functie de anumite caractere biochimice atunci cand acestea au fost selectate dintr-o microbiota eterogena. De exemplu, mediu de agar cu sange de oaie poate fi intrebuintat pentru a diferentia specii din cadrul genului Streptococcus. Toate speciile cresc pe acest tip de mediu, dar coloniile lor arata diferit.

Selectarea si diferentierea mai multor specii de Bacillus

Medii de cultura de diferentiere si selective pot selecta anumite

microorganisme si in acelasi timp diferentia diferite tipuri de bacterii. De exemplu, pot selecta bacteriile gram negative si a le alege pe cele care fermenteaza lactoza, in scopul producerii de acid lactic. Acidul produs prin fermentatie coloreaza indicatorul de pH in rosu-portocaliu, deci coloniile cu aceasta culoare sunt identificate ca cele care fermenteaza lactoza.

Medii de imbogatire, fortifiate sunt destinate

microorganismelor pretentioase din punct de vedere nutritiv si care se afla in numar redus in produsul analizat din punct de vedere micorbiologic. Pentru a le evidentia, se fac treceri din produsul alimentar in mediul de imbogatire, steril si se asigura inmultirea celulelor izolate. De aici se face transferul pe medii de diferentiere iar rezultatul se exprima prin absenta sau prezenta lor. De exemplu la determinarea bacteriilor din genul Salmonella, normele microbiologice stabilesc absenta lor in 25 grame de produs.

Mediile naturale sunt foarte folosite deoarece reproduc conditiile ambientale in care se dezvolta microorganismele. Ele pot fi sucuri sau piureuri de fructe sau legume, mustul de malt, infuzii de plante, lapte, sange, zerul, carnea, bulionul de carne, ficat, oua. Medii fermentative sunt medii de cultura industriale. In compozitia lor intra ca surse de carbon melasa, zaharoza, saruri minerale, fainuri, cereale boabe, zer, amidon etc. Ca sursa de azot in aceste medii pot fi folosite fainuri proteice de soia, sulfatul de amoniu, uree si ingrasamant complex. Pentru imbogatirea in saruri minerale se folosesc: fosfati, sulfati, cloruri.

Nu toate microorganismele pot fi crescute in cultura. Sunt multe bacterii, fungi, virusuri sau protozoare din mediul inconjurator care nu pot fi cultivate in laborator. Acestea trebuie observate direct la microscop. Ne referim aici in special la unele microorganisme patogene si la cele care se dezvolta in interiorul organismului animal sau uman (visuri si protozoare).

MEDII DE CULTURA
Mediile de cultura folosite in laboratorul de microbiologie reprezinta substrate pentru cresterea, dezvoltarea, inmultirea si mentinerea microorganismelor. Mediile de cultura pot fi lichide sau solide, pot fi preparate din reactivi ind ividuali sau se pot obtine prin rehidratarea unei pulberi (medii deshidratate), care contine toti ingredientii necesari cresterii microorganismelor prezente in alimente. Dupa scopul utilizarii, mediile se pot imparti in medii simple sau de izolare si medii speciale (medii de imbogatire, medii elective, medii selective, medii diferentiale, medii de conservare sau de mentinere).

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURA Cantarirea ingredientelor sau a mediului deshidratat (mediu complet)

I
Dizolvarea si omogenizarea pulberii prin incalzire pana la fierbere

I
Corectarea pH-ului, in functie de specia care urmeaza a fi cultivata

I
Repartizarea mediului in baloane de sticla, eprubete sterile cu dop

I
Sterilizare la 1200C, 30 min

I
Depozitare la 40C