4.

1 Descrierea procesului tehnologic

Procesul de baza din tehnologiile de biosinteza este un proces biologic(de fermentatie), transpus la scara industriala, ceea ce a facut ca el sa apartina unui nou domeniu, cel al ingineriei biochimice, domeniu care studiaza procesele de fermentatie aerobe si anaerobe si elaboreaza tehnologiile pentru obtinerea antibioticelor, vitaminelor, hormonilor, alcoolilor, proteinelor, a produselor destinate agriculturii, culturilor de celule, etc. O tehnologie de biosinteza poate fi reprezentata printr-o schema bloc ca o succesiune de trepte specifice in care rolul central il detine treapta de fermentatie biochimica.

Treapta de prelucrare A include procesele premergatoare fermentatiei biochimice, respectiv pregatirea mediilor de cultura, sterilizarea aerului tehnologic, si sterilizarea aparaturii, iar treapta de prelucrare C cuprinde procesele prin care se realizeaza separarea produselor obtinute prin biosinteza, incluzand eventuala recirculare a unei parti din biomasa sau recircularea fazei lichide, daca nu au fost epuizate in totalitate componentele mediului de cultura (aceste recirculari sunt specifice proceselor continue de fermentatie). [1, p.29] In treapta B de prelucrare biochimica are loc procesul de biosinteza prin fermentatie aeroba sau anaeroba, reprezentand treapta determinanta pentru performantele biotehnologiei, performante dependente, pe de o parte, de productivitatea susei folosite, legata direct de potenta acesteia, compozitia mediului si gradul de sterilitate, iar pe de alta parte, de performantele proceselor specifice ingineriei biochimice care intervin in conducerea fermentatiei (transferul de masa, caldura, impuls, etc). Etapele care au loc in procesul de obtinere a penicilinei G sunt: a).pregatirea mediilor de cultura; b).serilizarea mediului de cultura si a aerului c).fermentatia biochimica; d).filtrarea solutiilor native; e).separarea si purificarea penicilinelor. a).Pregatirea mediului de cultura Mediile de cultura sunt formate din solutii apoase care contin substante necesare cresterii microorganismului cultivat si elaborarii produsului dorit. In functie de natura componentelor care intra in compozitia lor, mediile de cultura sunt: sintetice, semisintetice si organice. Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza al penicilinei, deoarece

microorganismul producator are nevoie de surse de carbon si energie, azot, substante minerale, aminoacizi, iar toate acestea dozate in limite foarte stranse. Surse de carbon si energie Principalele surse de carbon si energie utilizate in formularea mediului de cultura pot fi grupate astfel: -monozaharide: glucoza, xiloza; -dizaharide: zaharoza, melasa din sfecla de zahar si trestie de zahar bogata in zaharoza, lactoza, maltoza; -polizaharide: amidon, dextrina, inulina, celuloza din turba si din apele bisulfitice rezultate din industria prelucrarii celulozei; -alcooli: metanol, etanol, polialcooli (glicerina); -acizi carboxilici: acid acetic, acid succinic, etc.; -grasimi si acizi grasi; -hidrocarburi: metan, n-butan, n-pentan, n-parafine; -deseuri din industria laptelui si industria alimentara: zer, zer in amestec cu melasa, tarate si faina de cereale, [1, p.61]

etc.

Randamentul de crestere a biomasei pe substrat de mono-, di- si polizaharide e cuprins intre 0,4 si 0,5 g celule/g substrat, crescand in cazul folosirii alcoolilor si a hidrocarburilor pana la 1g celule/g substrat dupa cum rezulta din tabelul 2.7. Tabel .2.7. Randamentul de utilizare a surselor de carbon si energie de catre microorganisme.

Sursa de carbon si energie

Randament in masa celulara g celule/g substrat

Glucoza Alcool metilic Alcool etilic Metan n-Alcani Amidon

0,50 0,50 0,75 0,62 1,00 0,50

Glucoza: este o sursa excelenta de carbon si energie, foarte mult utilizata pentru stimularea cresterii microbiene, uneori constituind chiar precursorul in biosinteza (obtinerea glicozidelor, a glicoproteinelor). Glucoza (denumita si dextroza) este folosita ca sursa de carbon si energie pentru prelucrarea antibioticelor, steroidelor, aminoacizilor, acizilor organici mono- si policarboxilici (acid butiric, citric), polizaharidelor microbiene (xantan, dextran), precum si a heteropolizaharidelor. Sursele de glucoza comerciale sunt: siropul de glucoza cu 32-40% (uneori 50%) glucoza, glucoza solida cu un continut de 65-66% si glucoza cristalizata cu 99-100% glucoza. Compozitia glucozei utilizabila ca substrat in procesul de fermentatie e redata in tabelul 2.8.

Tabel 2.8.Compozitia glucozei comerciale utilizata ca substrat.

Componenti

Continut Dextroza hidrat cristalizata Dextroza din amidon de cartofi sau cereale 65 66 3 9 10 22

D-glucoza D-fructoza Maltoza Dextrina(maxim,admis)

90 100 0 0 0

Din grupul dizaharidelor(zaharoza,lactoza,melasa) cea mai utilizata este melasa. Melasa este foarte accesibila economic si contine, inafara zaharozei, si alti componenti, cum ar fi: zahar invertit (amestec de D-glucoza si D-fructoza), betaine (betainele sunt derivati cuaternari ai aminoacizilor), aminoacizi, acizi organici. Compozitia melasei utilizabila ca sursa de carbon si energie (melasa rezultata de la obtinerea zaharului brut si melasa rezultata de la rafinarea zaharului) este prezentata in tabelul nr 2.8. Melasa este un subprodus rezultat din fabricarea zaharului din sfecla de zahar. Cercetarile efectuate au demonstrat marea variabilitate chimica a melaselor. Variabilitatea este determinata atat de compozitia diferita in aminoacizi, biotina, zaharoza invertita, pH, cat si de substantele daunatoare cum sunt caramelul, cat si substantele melanoide si humice, etc. Melasele cu pH scazut, cu un procent crescut de zaharoza invertita, la carelipsesc aminoacizii necesari biosintezei (metionina si treonina) si cu continut crescut in substante colorate (caramel, substante melanoide) conduc la rezultate scazute in fermentatie. [1, p.63] Tabel nr 2.9.Compozitia procentuala a melasei utilizabila ca sursa de carbon si energie si valoarea pH-ului.

Componente

Sursa de melasa Separare zahar brut Rafinare zahar 79,50 82,20 50,00 54,60 0,12 1,56 1,24 1,54 1,45 1,65 11,14 14,33 7,5 8,5

Substante solide Zaharoza Zahar invertit Rafinoza Azot total Cenusa Valoare pH

78,90 86,20 43,80 54,40 1,19 4,50 0 2,75 0,82 1,90 5,30 9.60 6,4 8,1

Melasa reprezinta sursa ideala pentru obtinerea drojdiilor de bere, alcoolului etilic, acidului citric si a altor acizi organici , acetonei, vitaminelor hidrosolubile, aminoacizilor, etc.

Lactoza: este un dizaharid reducator care se foloseste in stare pura numai pentru biosinteza antibioticelor (in mod deosebit la obtinerea penicilinei). Solutia tehnica de lactoza, rezultata ca subprodus in industria branzeturilor, se utilizeaza in concentratii de 70-75% pentru obtinerea etanolului, a drojdiei de panificatie, a proteinelor monocelulare ale acidului citric. Solutia mai contine, pe langa lactoza, 12-14% proteine si 8-9% saruri minerale. Surse de azot Necesarul de azot dintr-un mediu de cultura e asigurat de sursele organice naturale si sintetice si din sursele anorganice. Microorganismele sunt capabile, in mod obisnuit, sa biosintetizeze toate tipurile de moleculele cu azot (aminoacizi, proteine) plecand de la ionul amoniu (NH4+), in functie de energia existenta, timp si gradul de tratare mutagena a sursei cultivate. Viteza de crestere a microorganismelor capata, insa, valori ridicate numai daca in mediu se gasesc sursele necesare de azot organic. In mediile sintetice, utilizate in laborator, ionul amoniu este introdus, in principal, sub forma de clorura, fosfat, sulfat sau azotat, in timp ce in culturile industriale necesarul de azot este asigurat de sursele naturale, cum ar fi: extractul de porumb, faina de soia, de arahide, de bumbac, de orez, de secara, lucerna, etc., cu adaosurile de saruri de amoniu mentionate anterior. Aceste surse naturale sunt bogate in proteine si aminoacizi, continand si acizi nucleici, oligoelemente, lipide, zaharuri, compusi cu sulf si fosfor, dupa cum se observa in tabelul nr.2.9. [1,p.66] Ca surse de azot anorganic se folosesc saruri de amoniu in cantitati de 3-3,5%, iar corectarea pH-ului pe tot parcursul fermentatiei se face cu ape amoniacale. Azotul total din lichidul de cultura ajunge la 6,5-8,5%. Dintre toate sursele de azot, sulfatul de amoniu da cele mai bune rezultate. Un adaos de corn-steep liqueur (extract de porumb) pana la concentratia de 4%, creste , de asemenea, productia de lizina. Prezenta ionului amoniu in mediile necesare fermentatiilor industriale favorizeaza metabolizarea proteinelor, dar si formarea unor produse din clasa antibioticelor, aminoacizilor etc. In toate procesele biochimice este esential sa fie controlata riguros concentratia ionului amoniu din mediu,respectiv mentinerea acestui parametru in limitele prescrise. In situatia in care ionul amoniu apare in exces caz destul de frecvent,corectarea concentratiei la valorile optime se poate face prin: -adaugarea in mediu a captatorilor de ioni -utilizarea surselor lente,precum NH4Cl imobilizata in matrice de polimeri In afara surselor de azot prezentate,se mai foloseste,aproape intotdeauna,ureea iar uneori se adaoga in mediu si hidrolizat de drojd Tabel 2.10.Compozitia surselor naturale de azot (% fata de s.u.) (A-metionina, B-cisteina, C-lizina)

Sursa azot

de Protein Mat. e grase 2 1 1,8

Aminoacizi A 0,1 0,43 0,22 B 1,40 0,52 C 0,1 1,60 0,42 -

Ca

Na

Mg

Faina de 13 malt Faina de 47 arahide Faina de 11,5 orz

0,1 0,02

1,15 0,5

0,26 0,13

0,28 0,15

0,6 0,36

0,2 0,07

Faina de 42 soia Faina de 12 secara Faina de 73 orez Faina de 50 carne Faina de 65 peste

3,5 1,9 1,7 8,5 5,5

0,54 0,16 0,14 0,67 2,00

1,10 0,40 0,16 0,66 1,60

2,40 0,40 0,24 2,60 5,90

0,2 0,08 0,04 9,2 4,5

0,28 0,02 0,04 0,13 0,18

1,7 0,46 0,34 1,4 0,3

0,21 0,12 0,14 1,2 0,1

0,32 0,15 0,05 0,26 0,62

0,6 0,3 0,26 4,7 2,7

Saruri minerale Prezenta substantelor minerale este vitala in procesul de crestere a masei celulare, deoarece ele regleaza atat permeabilitatea tesutului celular, cat si echilibrul ionic. Rolul jucat de sarurile minerale in procesul de biosinteza e foarte important si se concretizeaza prin faptul ca acesti compusi pot reprezenta surse: -elemente constitutive ale biomaselor (Mg, P, S, Cl, Fe, Ca, etc.); -elemente constitutive ale produselor (P, S, Cl, etc.); -reglatori ai presiunii osmotice si ai permeabilitatii membranelor celulare (MgCl2, KCl, NaCl, etc.); -modificatori de pH (NaH2PO4); -intermediari ai reactiilor de oxido-reducere (Cu2+, Fe(CN)6, etc.); -cofactori ai sistemelor enzimatice-metaloenzime (Mg2+, Mn2+, Co2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+, Mo2+, etc.).

Precursori si vitamine Precursorii sunt compusi organici sau anorganici,adaugati in mediul de cultura,care intervin ca molecule intermediare in biosinteza,sau care dirijeaza biosinteza catre o anumita directie. De exemplu acidul fenil acetic dirijeaza procesul de biosinteza catre obtinerea penicilinei G, ambii precursori fiind inclusi in structura acestor antibiotice sub forma de catena laterala. [1, p.69] De asemenea precursorii pot accelera procesele de biosinteza,cum ar fi cisteina in obtinerea cefalosporinelor. Precursorii sunt specifici pentru anumite produse,dupa cum rezulta din tabelul 2.11. favorizand atingerea unor randamente ridicate de biosinteza. Tabel 2.11.Precursori specifici pentru unele produse de biosinteza

Precursor Acid fenilacetic

Microorganism producator Penicillum chrysogenum

Produs biosintetizat Penicilina G

Acid fenoxiacetic n-propanol Glicina Acid -cetobutiric

Penicillum crhysogenum Streptomyces erytheus Sarcina albida Claviceps purpurea

Penicilina V Eritromicina L-serina Alcaloizi din ergot Vitamina B12

Clorura de cobalt Pseudomonas thermophila

Prin activitatea lor extrem de eficienta ,in procesele de biosinteza, precursorii sunt componente care nu lipsesc din mediile de cultura. Pentru evitarea efectelor inhibitorii ada-ugarea acestora se face treptat,mentionandu-se o anumita concentratie la un nivel constant. Vitamine Vitaminele constituie o alta grupa de compusi organici cu un rol bine definit in procesele biochimice, atat in etapa de crestere cat si in cea de elaborare a produselor utile.Vitaminele reprezinta coenzimele sistemelor enzimatice cu activitate precisa in metabolismul celular, fapt dovedit de tabelul 2.12. Tabel nr.2.12. Randamentul de utilizare a surselor de carbon si energie de catre microorganisme.

Vitamina Acid nicotinic(vitamina PP) Acid pantotenic Riboflavina(vitamina B2) Piridoxina (vitamina B6) Tiamina(vitamina B1) Ciancobalamina(vit.B12) Vitamina K Biotina

Functia metabolica Precursor al NAD si NADP Precursor al coenzimei A Componenta a FMN si FAD Omplicata in reactiile de transaminare si decarboxilare Componenta a tiamin-pirofosfatului decarboxilaze, transaminaze Coenzima glutamat-mutazei Coenzima fumarat-reductazei Coenzima implicata in carboxilare din

Reglatori ai proceselor de biosinteza In procesele de biosinteza a unei serii numeroase de produse cum ar fi antibioticele,vitaminele,aminoacizii,este posibila utilizarea unor molecule organice sau anorganice care actioneaza ca inductori,activatori sau represanti. Un exemplu tipic il reprezinta ionul (PO -34),care dupa o anumita concentratie,devine un inhibitor pentru acumularea produselor utile. Pentru diminuarea efectului inhibitor,in mediu se adaoga CaCl2,MgCl2 sau ZnCl2 in scopul precipitarii excesului de fosfat. Culturile de actinomicete sunt extrem de sensibile la ionul fosfat. De asemenea,trebuie evidentiat faptul ca adaosuri mici de acid glutamic sau glutamat stimuleaza productia de peniciline,fara a interveni direct in biosinteza antibioticului. [1, p.69]

b)..Sterilizarea mediului de cultura si sterilizarea aerului tehnologic Procesele de biosinteza impun, in mare majoritate, absenta totala a sporilor de microorganisme straine, provenite din aer, apa sau materii prime, care s-ar putea dezvolta in faza de fermentatie, infectand cultura unica a microorganismului util. Sterilizarea reprezinta procesul prin care are loc distrugerea si indepartarea microorganismelor patogene sau apatogene (atat a formelor vegetative, cat si a sporilor) din substante, preparate, spatii inchise, obiecte, etc. [1, p.80] In industria de biosinteza, unde se obtin culturi microbiene pure, procesul de sterilizare este de neinlocuit si poate fi realizat prin: a) metode termice:

- sterilizarea cu aer cald la 140-200sC; - sterilizarea cu vapori de apa sub presiune la 120-140sC; - sterilizarea prin incalziri repetate la 70-100sC. b) metode fizice:

- filtrare prin umpluturi fibroase; - filtrare prin materiale poroase; - filtrare prin membrane; - utilizarea radiatiilor UV, IR, raze X, , , etc. c) metode chimice: -utilizarea agentilor chimici: oxid de etilena, formaldehida, fenol, ozon, etc. d) metode de preparare pe cale aseptica.

Sterilizarea termica uscata include si sterilizarea prin flambare folosita in faza de insamantare a inoculului si aprelevarii probelor. Acest gen de sterilizare consta in trecerea probelor sau a obiectelor prin flacara,timp de cateva secunde. In general,metoda de sterilizare se alege in functie de proprirtatile fizico-chimice ale materialelor supuse sterilizarii,astfel incat sa se evite modificarile calitative ale acestora. Intre incalzirea uscata si cae umeda,in procesul de sterilizare in metode termica,exista o deosebire importanta,ultima avand o eficienta sporita. Fenomenul se explica prin actiunea hidratanta,coagulanta si hidrolizanta a apei si a aburului asupra proteinei microbiene. Comparand performantele sterilizarii prin incalzire uscata si umeda,se constata ca sterilizarea cu aer cald necesita temperaturi si durate mult mai mari. Din aceste motive in tehnica se prefera sterilizarea umeda,care poate fi in functie de punctul termic si timpul termic mortal. Punctul termic mortal este definit prin valoarea temperaturii la care sunt omorate toate celulele unei anumite specii,in timp de 10 minute. Timpul termic mortal reprezinta acea valoare a timpului de expunere la oa anumita temperatura necesara distrugerii tuturor celulelor sporulante. Timpul termic mortal scade semnificativ odata cu cresterea temperaturii,ceea ce conduce la concluzia ca trebuie ales regimul de sterilizare rapid la temperaturi mai ridicate. In acest mod se asigura un grad sporit de siguranta in sterilizare si o conservare mai buna a acalitatilor nutritive ale mediului de cultura. [1, p.82] In concluzie studiul bazelor termodinamice ale sterilizarii termice reprezinta singurul criteriu concret in alegerea conditiilor de realizare a acestui proces.

Sterilizarea prin filtrare pe materiale poroase se utilizeaza frecvent in cazul preparatelor termolabile. Procedeul este preferat si atunci cand pretul prea mare al energiei si cheltuielile pentru aparatura exclud indepartarea microorganismelor prin metoda termica. In metoda de sterilizare prin filtrare se folosesc filtre poroase Jena Gs,filtre de azbest-celuloza,filtre cu membrana,filtre de profunzime si filtre absolute. Sterilizarea cu ajutorul radiatiilor ,desi,prezinta unele nejunsuri este aplicata din ce in ce mai mult in industrie,atat pentru sterilizarea produselor,cat si a aerului din boxele sterile. Prepararea produselor pe cale aseptica se utilizeaza atunci cand nu este posibila sterilizarea lor prin procedeele prezentate anterior. Tehnologia prepararii aseptice se realizeaza in boxe sterile,aerul din acestea fiin sterilizat prin filtrare,iradiere sau cu agenti chimici. In ultima perioada a fost extinsa la scara industriala sterilizarea aerului din boxe prin curgerea peliculara,controlul sterilitatii aerului facandu-se cu ajutorul filtrelor din membrana. Sterilizarea mediilor de cultura

Dintre toate aceste metode,aplicatii practice au gasit numai procedeele termice de sterilizare. Aceste procedee se caracterizeaza prin simplitate, usurinta in exploatarea utilajelor de sterilizare si siguranta in realizarea gradului de sterilizare dorit. Sterilizarea termica prezinta si o serie de conveniente, generate de reactiile secundare de degradare care au loc in timpul procesului de sterilizare:

- denaturarea proteinelor si inactivarea lor; - denaturarea vitaminelor si a unor factori de crestere; - supraincalzirea care initiaza reactii de oxidare a fenolilor si a acidului ascorbic,de polimerizare a aldehidelor nesaturate,de caramelizare a hidratilor de carbon si brunificarea mediului. In timpul sterilizarii termice se mai produc reactii de condensare a grupelor aldehidice, din zaharuri reducatoare, cu gruparile aminice libere din aminoacizi sau proteine, cu formare de produsi asemanatori bazelor Schiff, produsi toxici pentru majoritatea microorganismelor. Pentru a fi evitata aparitia acestor compusi, este recomandata sterilizarea separata a hidratilor de carbon si a compusilor cu azot. Aceasta recomandare este obligatorie in cazul in care se lucreaza cu medii de cultura concentrate, la care apar diferente semnificative intre energiile de activare ale reactiilor de degradare (80-100 kg/mol) si cele de distructie termica a sporilor microbieni (400-420 kg/mol). [1, p.83]
Procesul de sterilizare a mediului de cultura poate fi realizat pri procedee discontinue si continue utilizandu-se ca agent termic abur saturat sau energia electrica. Multe din nejunsurile sterilizarii cu abur sunt diminuate prin alegerea judicioasa a tehnologiei de realizare a acestui proces care ramane practic cel mai sigur. Din punct de vedere cinetic,procesul de distructie termica a microorganismelor poate fi descris prin diverse ecuatii,in functie de rata de distructie termica,care poate fi logaritmica sau nelogaritmica. Distructia termica logaritmica a microorganismelor este descrisa matematic de

ecuatia:

unde: N numarul de microorganisme viabile/ml mediu k constanta vitezei de distructie termica ,min-1; - timpul de sterilizare,min;

Prin integrarea ecuatiei in conditiile initiale:

se obtine:

sau

Viteza specifica de distructie termica a microorganismelor,k, este functie numai de temperatura si poate fi determinata cu ajutorul urmatoarelor ecuatii:

-ecuatia Eyring:

-ecuatia Arrhenius: Sterilizarea discontinua a mediilor de cultura

Analiza performantelor procesului de sterilizare discontinua a mediului de cultura se bazeaza pe cinetica distructiei sporilor bacterieni cu cea mai mare termostabilitate, precum si pe relatia timp-temperatura (tabelul nr.10). Sterilizarea efectiva se produce in perioada de incalzire, mentinere si racire a mediului, iar efectul total al sterilizarii este rezultatul cumulat al efectelor obtinute in fiecare din aceste etape. Ecuatia vitezei de distructie termica a microorganismelor in sterilizarea discontinua se obtine prin combinarea ecuatiilor:

unde: N numarul de microorganisme viabile/ml mediu k constanta vitezei de distructie termica ,min-1; - timpul de sterilizare,min; In acord cu Deindoerfer,raportul ln(N0/N) se noteaza cu si reprezinta criteriul de proiectere a procesului de

sterilizare discontinua: Acest criteriu adimensional descrie eficacitatea procesului de sterilizare si permite determinarea timpului optim de sterilizare in functie de sursa de incalzire folosita. Timpul total de sterilizare este egal cu suma timpilor de incalzire, mentinere, racire. Prin urmare,unele microorganisme vor fi distruse in faza de incalzire ,altele in faza de mentinere,iar un numar redus in perioada de racire. In aceste conditii ecuatiile pot fi scrise in forma:

,respectiv

unde : N1- nivel de contaminare la sfarsitul fazei de incalzire; N2- nivel de contaminare la sfarsitul fazei de mentinere; N - nivel de contaminare remanent. [1, p.88]

Rezolvarea acestor ecuatii se poate face prin utilizarea relatiilor timp-temperatura stabilite de Deindoerfer si Humphrey pentru diferite sisteme de incalzire,relatii prezentate in tabelul 2.13. Tabel nr.2.13. Relatia timp-temperatura in sterilizarea discontinua

Mod de incalzire Incalzire cu abur viu Incalzire cu abur in manta ncalzire electrica Racire prin manta

Relatia timptemperatura

Constante

T=Ta(1+e-)

T=T0(1+) T=Te(1+ e-) ;

T temperatura de sterilizare, K; T0 temperatura initiala a mediului, K; Ta temperatura agentului de incalzire, K; Te temperatura agentului de racire, K; D debit abur, kg/s; H entalpia aburului, KJ/kg; M cantitatea de mediu supus sterilizarii, kg; Cpm caldura specifica a mediului, KJ/kgK; Cpa caldura specifica a agentului de racire, KJ/kgK;

k coeficientul global de transfer de caldura, W/m2K; S suprafata de transfer de caldura, m2; W debit de agent de racire, kg/s; q flux termic, KJ/s; timp, s. Durata fiecarei etape din proces se poate determina cu usurinta prin alegerea modului de incalzire a mediului supus sterilizarii cu abur viu,durata fazei de incalzire se efectueaza cu ajutorul expresiei:

iar a fazei de racire din relatia:

Apoi cunoscandu-se contaminarea initiala,N0,si cea finala,N,se calculeaza contaminarea la sfarsitul perioadei de incalzire:

si la sfarsitul perioadei de mentinere,care corespunde inceputului etapei de racire:

In continuare se calculeaza durata fazei de mentinere,pe baza valorilor contaminarilor N1 si N2 determinate anterior:

2.7.)

Cu datele obtinute se traseaza diagrama timp-temperatura pentru procesele de sterilizare discontinue (figura [1, p.91]

Fig.nr.2.7.Diagrama timp temperatura pentru sterilizarea discontinua Pentru unele cazuri concrete, aportul perioadelor de incalzire si racire la distrugerea microorganismelor din mediul de cultura poate atinge 65%.Daca viteza de incalzire sau de racire peste 100 oC se abate de la valoarea indicata, 1grd/min, atunci criteriul sterilizarii, in faza de incalzire si de racire, se calculeaza cu expresiile:

unde:

- temperatura de sterilizare,oC;

ts la 100oC ;

durata

de

incalzire

de

la

100 oC,respectiv

de

racire

de

la

- valoarea tabelata a criteriului sterilizar In faza de mentinere temperatura de sterilizare fiind constanta criteriul sterilizariise determina cu relatia:

Pentru caracterizarea cantitativa a procesului de sterilizare in faza de mentinere si pentru determinarea limitelor inferioare care asigura siguranta in sterilizare,literatura propune utilizarea indicelui de eficacitate aseptica,S as si a valorii obligatoru necesare pentru criteriul sterilizarii, . Intre cele doua marimi exista dependenta data de relatia:

Sterilizarea continua a mediilor de cultura

Sterilizarea continua a mediilor de cultura se aplica atunci cand debitele de mediu sunt ridicate si ofera o serie de avantaje, comparativ cu sterilizarea discontinua, care sunt: -conservarea mai buna a proprietatilor nutritive;

-control superior al calitatii procesului; -aparatura cu gabarit redus; -reducerea duratei ciclului de sterilizare; -productivitate si eficienta sporita; -control automat; -realizarea de randamente superioare in faza de fermentatie. Cea mai dificila problema in proiectarea sterilizatoarelor continue, o constituie stabilirea timpului de stationare a mediului in zona de mentinere. Fiind un lichid real, viteza medie de curgere a mediului de cultura este in functie de distributia reprezentata in figura 9. Pentru curgerea tip piston, timpul mediu de stationare in zona de mentinere este egal cu timpul de mentinere, respectiv cu timpul de expunere a mediului la incalzire. Desi ar fi ideal sa existe curgerea tip piston, in practica insa, curgerea mediilor este turbulenta si ca urmare, timpul de stationare in zona de sterilizare difera de la centru la peretele aparatului, fiind necesara stabilirea unei valori med

Fig.nr 2.8. Viteza medie de curgere in functie de distributie Pentru sterilizarea continua a mediului de cultura a mediului de cultura la nivel industrial se folosesc instalatii care functioneaza la temperatura de 120-125sC. Parametrul care caracterizeaza cel mai exact gradul de amestecare respectiv dispersia,,in curgerea turbulenta a mediilor de cultura prin sterilizatoarele continuie este criteriul de dispersie al sterilizatorului (D- coeficient de dispersie,v- viteza medie de curgere,L- lungimea caracteristica). Acest criteriu reprezinta inversul criteriului Peclet notat Pe ,pentru transferul de masa axial si are valori cuprinse intre 0,pentru curgerea tip piston si infinit,pentru curgerea cu amestecare perfecta. Pentru a analiza modul in care criteriul dispersiei influenteaza procesul de distructie termica a microorganismelor,in regim stationar,se combina ecuatia bilantului de materiale din procesul de sterilizare cu ecuatia cinetica care descrie acest proces. In acest sens,se considera un element de volum din sterilzatorul tubular cu lungimea L si sectiunea S,prin care circula mediul de cultura cu viteza medie v si constanta si in care dispersia axiala este caracterizata prin coeficientul de dispersie D. [1, p.97]

Figura 2.9. Variabilele zonei de sterilizare Pentru acest element de volum,bilantul de materiale este descris de relatia :

Prin rearanjarea termenilor si impartirea ecuatiei la

si pentru (dN/dt) = kN se obtine:

iar prin trecerea la limita

(1)

Ecuatia (1) reprezinta expresia generala a bilantului de materiale la distructia termica a microorganismelor prin reactie si dispersie. Pentru rezolvarea ei se trece la o forma adimensionala,prin introducerea urmatoarelor

variable:

Prin utilizarea acestor variabile,ecuatia (1) devine:

(2) Rezolvarea ecuatiei se face pentru urmatoarele conditii de limita:

Solutia ecuatiei (2) in conditiile de limita descrise fiind:

(3)

in care :

Expresia (3) reprezinta ecuatia de proiectare a sterilizatorului continuu si permite determinarea timpului de stationare a mediului in zona de mentinere,in functie de criteriul de dispersie pentru un anumit nivel al contaminarii remanente . pentru cazul in care curgerea se aproprie de curgerea de tip piston solutia ecuatiei va fi :

Timpul mediu de stationare in zona de mentinere a instalatiei de sterilizare se determina in functie de viteza de curgerea mediului si lungimea zonei de mentinere,folosindu-se [1, p.97] dependenta

Instalatii pentru sterilizarea continua a mediilor de cultura

Pentru sterilizarea continua a mediilor de cultura la nivel in industrial se folosesc instalatii care functioneaza la temperaturi de 120-125oC,precum si instalatii care lucreaza la 135-140oC. Instalatia de sterilizare continua la 120-125sC prezentata in figura 10 este alcatuita din coloana de sterilizare (1), mentinator (2) si racitor (3). Coloana de sterilizare este conceputa din doua tevi concentrice, prin teava interioara fiind introdus aburul, mediul de cultura circuland prin spatiul dintre cele doua tevi. Incalzirea mediului se face prin barbotoarele aburului de 5 ata prin intermediul fantelor practicate pe teava interioara, acesta fiind dirijat tangential si uniform cu ajutorul unui snec montat pe exteriorul tev Mediul stationeaza in coloana 4-6 secunde, dupa care patrunde in mentinator, unde ramane 15-20 minute pentru perfectarea procesului de sterilizare. In final, mediul este racit printr-un schimbator de caldura tip teava in teava, la 35-40sC, temperatura cu care este introdus in fermentator.

Fig.nr 2.9. Instalatia continua de sterilizare la 120 125sC Din diagrama timp-temperatura, prezentata in figura nr.11, se observa ca, in aceasta instalatie, contributia fazei de incalzire si racire la performanta procesului de sterilizare este de 5 6%, astfel incat se poate considera ca sterilizarea se realizeaza aproape in totalitate in faza de mentinere.

Fig.nr 2.10. Diagrama timp-temperatura pentru sterilizarea continua la 100-125sC. In procesul de sterilizare continua la 135-140oC realizat industrial fie in instalatii cu injectii de abur,fie in schimbatoare de caldura cu placi,timpul de expunere este foarte scurt,racirea mediului trebuie realizata in cateva secunde. Din aceste motive,problemele tehnice care apar sunt legate,aproape exclusiv,de posibilitatile de realizare a racir In instalatia de sterilizare prin injectie,aburul este injectat prin ventilul (1),astfel incat temperatura mediului urca instantaneu la 140-142oC.

Figura 2.11 Instalatie de sterilizare a mediului de cultura la 140oC prin injectie de abur. Temperatura se mentine 2-3 minute in serpentina de mentinere (2), dupa care racirea se face prin trecerea prin valva de expansiune (3) in vasul de destindere (4). Prin expansiune si destindere la vid, temperature scade brusc. In acelasi timp,insa, se pierde o cantitate de apa prin evaporare, fenomen de care se tine seama la prepararea mediilor de cultura. Apa evaporate genereaza pierderi de energie termica, fapt care constituie punctual slab al instalatiei.

Figura 2.12. Instalatie de sterilizare la 140o C prin schimbatoare de caldura cu placi (1- racitor, 2- preincalzitor, 3- sterilizator, 4 serpentina de mentinere).

In instalatia de sterilizare prin schimbatoare de caldura cu placi, curgerea lichidului fiind peliculara, schimbul termic este intensificat, si in consecinta, incalzirea la 140 o C se face, in 15-20 secunde, iar dupa etapa de mentinere, racirea se produce in 20-30 secunde, in recuperatorul de caldura (2) si racitorul (1) (figura 4.14). Din diagramele timp temperature, redate in figurile 4.15.a. si b.,se constata ca,in aceste instalatii, contributia fazei de incalzire si racire, la ciclul de sterilizare, nu depaseste 1-2%.Din acest motiv, consideratiile teoretice prezentate anterior, referitoare la curgerea mediilor de cultura prin zona de mentinere, sint valabile si pentru aceste instalat In ultimul timp, au fost concepute noi instalatii de sterilizare a mediului de cultura la temperatura de 140 142 0C,care contin combinatii ale elementelor ce compun instalatiile de sterilizare prin injectie sau in schimbatoare de caldura cu placi. In instalatia prezentata in figura 4.16, incalzirea se face in recuperatorul de caldura (3) si prin injectie de abur in (1), iar etapa de mentinere se realizeaza in serpentinele de mentinere (2)

Figura 2.13. Diagrama timp temperature la sterilizarea prin injectie de abur (a) si in schimbatoare de caldura cu placi (b).

Figura 2.14. Sterilizarea mediului de cultura in instalatii cu schimbatoare de caldura peliculare si injectie de abur. Racirea se produce in schimbatoarele de caldura cu placi si decurge I doua etape : -racirea preliminara in recuperatorul (3) cu mediul supus sterilizarii -racirea in racitorul (4).

Instalatia din figura 2.15.. functioneaza pe principiul incalzirii combinate a mediului de cultura: -prin injectie de abur in (1) pina la temperature de 70 850C -in recuperatorul (2) pina la temperature de 100 105 0C -in schimbatorul de caldura cu placi (3) pina la 135 1400 C. Dupa mentinerea in serpentina de mentinere (4),racirea mediului sterilizat se realizeaza in doua etape, folosindu-se schimbatoarele de caldura cu placi(2) si (5).

Figura 2.15. Sterilizarea mediului de cultura in instalatii prin injectie de abur si schimbatoarea de caldura cu placi. Aceste tipuri de instalatii valorifica superior energia termica reziduala si asigura o sterilizare avansata, concomitant cu conservarea mai buna a calitatilor nutritive ale mediului de cultura. [1, p.105] Sterilizarea aerului

Procesele industriale de fermentatie sunt, aproape in totalitate, procese aerobe si, in marea lor majoritate, aseptice. Necesarul orar de aer steril variaza intre 60 120 m 3 aer/m3mediu de cultura. In sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificultati generate, pe de o parte, de varietatea microorganismelor prezente (virusi,bacterii, spori bacterieni, fungi), iar pe de alta parte, de rezistenta lor la temperaturi uscate. Tabel 2.14. Speciile reprezentative de bacterii si spori bacterieni din aer

Specia bacteriana

Dimensiunile caracteristice Lungime, Latime,

Bacterii: Aerobacter aerogenes Bacillus cereus Bacillus licheniformis Bacillus megaterium Bacillus subtilis Bacillus mycoides 1,0-2,5 8,1-25,8 1,8-3,3 2,0-10,0 1,6-4,8 1,6-13,6 1,0-1,5 1,3-2,0 0,5-0,7 0,9-2,1 0,5-1,1 0,6-1,6

Micrococcus aureus Proteus vulgaris Spori bacterieni: Bacillus megaterium Bacillus mycoides Bacillus subtilis

0,5-1,0 1,0-3,0

0,5-1,0 0,5-1,0

0,9-1,7 0,8-1,8 0,9-1,8

0,6-1,2 0,8-1,2 0,5-1,0

Studiind procesul de sterilizare a aerului, abia a determinat speciile representative de bacterii si spori care trebuiesc indepartate in mod obligatoriu, pentru a fi asigurate conditiile unei fermentatii aseptice. [1, p.110] Cu toate ca sterilizarea aerului se poate realize atit prin procedee termice,cit si prin filtrare, metoda cea mai utilizata in industrie este filtrarea. Pentru sterilizare prin filtrare se pot folosi urmatoarele materiale filtrante: -fibra de sticla cu diametru cuprins intre 5 si 8 -nitrat de celuloza, pentru filtrul cu membrane -teflon cu o mare rezistenta termica (pina la 300 0C) si character hidrofob,utilizat sub forma de folii de teflon sau in amestec cu polietilena -poliamida (nylon), caracterizata prin rezistenta termica, hidrofobicitate, elasticitate si durabilitate.

Figura 2.16.Filtru cu fibre de sticla pentru sterilizarea aerului Pentru sterilizarea aerului prin filtrare, in principiu, exista trei tipuri de filtre cu aplicabilitate practica. Primul tip, filtrul cu fibre de sticla, prezentat in figura 2.16, este alcatuit dintr-un strat de material filtrant fixat intre doua site, sustinute de doua placi perforate (diametrul perforatiilor este de 0,7 0,8 cm). Filtrul este prevazut cu manta de incalzire, care permite uscarea materilului filtrant sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru, indicat pentru industria de biosinteza, ofera posibilitatea sterilizarii unor debite ridicata de aer, realizarea unui grad avansat de purificare si durata

indelungata de functionare. Dezavantajele filtrului cu fibre sint ;operatii complicate la schimbarea fibrelor de sticla (durata 2,5 3 ore), manipularea neplacuta a fibrelor de sticla si anularea efectului de sterilizare dupa umezirea materialului filtrant fibros. Din a doua categorie fac parte asa-numitele filtre disc cu membrane (filtre absolute, filtre milipori), redate schematic in figura 2.17. Acest tip de filtre este indicat atit pentru sterilizarea aerului, cit si pentru sterilizarea lichidelor. Membranele folosite sint membrane microporoase ca dimensiuni ale porilor sub 0,2 Sterilizarea filtrului se face cu abur direct introdus pe directia fluxului de aer. Daca membrane filtrului este formata dintr-un material hidrofob, umiditatea aerului nu deranjeaza procesul de filtrare, reespectiv de sterilizare, ceea ce permite utilizarea lor si ca filtre de iesire.

Figura 2.17. Filtru disc cu membrane Dezavantajele acestor filtre constau in productivitatea redusa, datorita suprafetei mici de filtrare, si durata relative scurta de viata a membranei. A treia categorie de filtre include filtrele-luminare (figura 2.18). Carcasa filtrelor poate sa include unul sau mai multe elemente de filtrare(filtre-luminare). Filtrarea se realizeaza fie printr-o membrane, fie prin trei straturide fibre infasurate in jurul unei tevi poroase.Avantajele acestor filtre sint reprezentate de suprafata ridicata de filtrare, posib ilitatea sterilizarii unor debite mari de aer intr-un timp scurt, durata lunga de functionare, intretinere simpla si schimbare rapida a elementelor de filtrare (10-12 minute). Sterilizarea acestor filtre se face cu abur direct, iar condensul este indepartat prin suflare cu aer steril. Experienta practica a confirmat durata mare de functionare a filtrelor-luminare, care pot suferi 200 de sterilizari termice in timp de 3,5

Figura 2.18.Filtru-lumanare pentru sterilizarea aerului Schema de principiu a liniei de purificare si sterilizare a aerului prin filtrare pe material fibros este redata in figura 2.18. Conform acestei scheme, aerul, separate de impuritati in filtrul (1), trece prin compresorul(2), unde este comprimat adiabatic la 3 3,5 at, temperature crescind la 150 160 0 C. Dupa racire in (3), aerul este introdus in serparatorul de picaturi (4), filtrul principal cu material fibros (5) (prima treapta de sterilizare), filtrul individual cu material fibros (a doua treapta de sterilizare), dupa care patrunde in fermentator.

Figura 2.19.Schema de purificare si sterilizare a aerului. Sterilizarea pe material fibros poate fi descrisa printr-un model de curgere prin ocolire (figura 2.19), fenomen care impune absenta totala a umiditatiidin filtru (prezenta umiditatii transforma curgerea prin ocolire in curgere prin alunecare, anulind total proprietatile filtrante).

Figura 2.20. Modelul curgerii perpendiculare a aerului pe fibra.

Din aceste motive, racirea aerului in racitorul (3) se face pana la aparitia condensului, iar, dupa separarea lui, aerul saturat se preincalzeste cu aer fierbinte pina cind temperature de iesire din filtrul individual (6) depaseste cu cel putin 120C temperatura punctului de roua. Stabilirea parametrilor de functionare ai instalatiei de sterilizare se face numai in functie de parametrii termodinamici ai aerului. Retinerea microorganismelor pe fibrele de sticla, in procesul de filtrare a aerului, se realizeaza ca efect al combinarii urmatoarelor fenomene: impact inertial, interceptie, difuzie si atractie electrostatica. Analiza cantitativa a procesului de retinere a particulelor din aer pe filtre de fibra de sticla a evidentiat ca eficacitatea filtrarii depinde de caracteristicile materialului fibros si de parametrii operatiei de filtrare. Considerindu-se ca influenta atractiei electrostatice este foarte redusa,eficacitatea retinerii microorganismelor pe o fibra individuala, , poate fi calculata cu relatia urmatoare:

- randamentul retinerii prin impact inertial - randamentul retinerii prin interceptie - randamentul retinerii prin difuzie. Pentru cazul fibrei individuale cu sectiune sferica, aranjata perpendicular pe directia de curgere a aerului, astfel incat particulele microbiene care lovesc fibra sint retinute pe acesta, randamentul separarii prin impact inertial se determina cu expresia urmatoare:

unde b reprezinta latimea zonei de impact a fluxului de aer, iar df diametrul fibrei(figura 2.20.). Trebuie mentionat faptul ca retinerea microorganismelor prin impact inertial se anuleaza daca viteza aerului este mai mica decat viteza critica, eficienta totala de colectare reducindu-se. Viteza critica este dependenta de diametrul particulei si de diametrul fibrei,conform ecuatiei:

in care: c - factor de corectie Cunninghan,determinat cu ecuatii empirice dp - diametrul particulei - densitatea particulei - viscozitatea aerului Efectul diametrelor df si dp asupra vitezei critice este redat grafic in figura 2.21.

Figura 2.21.Efectul diametrului fibrei si a diametrului particulelor asupra vitezei critice de curgere a aerului prin filtrul cu fibre. Pentru determinarea randamentului de separare prin interceptie, a fost propusa urmatoarea relatie, cu conditia ca distanta dintre fibrele colectoare sa fie mai mica de dp/2:

unde :

R - parametrul interceptarii(R= dp /df ) Re - criteriul Reynolds (Re= df v. a / ) V - viteza medie a aerului a - densitatea aerului. Eficienta separarii prin difuzie se calculeaza cu expresie:

in care: x0- grosimea filmului de aer in jurul fibrei DB-coeficientul de difuzie al microorganismului kB- constanta Boltzman T temperatura, K.

Figura 2.22. Influenta vitezei liniare de curgere a aerului asupra performantelor procesului de sterilizare. Pentru primul domeniu de variatie, evolutia parametrului Keste rezultatul cresterii importantei retinerii microorganismelor datorita impactului.Insa,odata cu cresterea vitezei de curgere a aerului si depasirea unui anumit nivel,apare fenomentul de vibratie a fibrelor (scuturare) si de generare a canalelor prefentiale de curgere,ceea ce determina antrenarea microorganismelor retinuta pe fibra. [1, p.120] Parametrii principali ai procesului de sterilizare a aerului sint : -temperatura punctului de roua a aerului comprimat -temperatura aerului dupa filtrul individual -temperatura aerului dupa destinderea adiabatica la iesirea din barbotor. Figura 2.23.Dependenta dintre temperatura punctului de roua si continutul de umiditate al aerului in functie de presiune. Stabilirea regimului optim de exploatare a instalatiilor de sterilizare a aerului se face cu ajutorul diagramelor care redau dependenta dintre continutul de umiditate si temperature punctului de roua (figura 2.23).precum si dependenta dintre temperature aerului dupa scaderea presiunii si temperature initiala (figura 2.24). De exemplu, pentru aerul cu presiunea de 2,5 ata si cu continut de umiditate de 20 g/kg aer uscat, temperature punctului de roua, conform diagramei 4.28, este de 47,5 0C. In situatia in care aerul a fost racit pina la 75 oC,iar caderea de presiune este de 0,35 ata, temperatura dupa filtrul individual, determinate cu ajutorul diagramei 4.29, pentru P2/P1= (2,5-0,35)/2,5=0,86 este de 600C.Valoarea obtinuta depaseste cu 12,50C temperature punctului de roua ,fiind, astfel, asigurata buna functionare a filtrelor de aer.

Fig.2.24 Dependenta dintre temperature aerului comprimat dupa scaderea presiunii si temperatura initiala.

Aerul cu temperatura de 600C este barbotat in lichidul de fermentatie,la iesirea din barbotor temperature sa reducindu-se datorita destinderii adiabatice.Reducerea temperaturii nu trebuie sa afecteze desfasurarea in conditii optime a procesului de biosinteza, valoarea acesteia determinindu-se in functie de presiunea aerului dupa filtrul individual si presiunea din fermentator. Daca presiunea din fermentator este de 1,28 ata, atunci temperature aerului la iesirea din barbotor se stabileste din diagrama 2.24 pentru raportul P 3/P2=1,28/2,14= 0,6 si va fi 150C, valoare care nu perturba procesul de fermentatie (temperature procesului este cuprinsa, in general, intre 24 si 300C). [1, p.121] Datorita dificultatilor care apar in procesul de filtrare a aerului in filtre cu fibre, au fost studiate si alte posibilitati de sterilizare, dintre acestea impunindu-se sterilizarea prin membrane hidrofobe, cu pori de 0,2 0,45 ,adecvate pentru indepartarea bacteriilor. Aceste membrane au condos la crearea filtrelor de excluziune, de dimensiuni variabile, in functie de debate de fluide supuse sterilizarii (aer sau lichide). Studiind comparative sterilizarea aerului prin membrane si prin filtrare pe fibre de sticla, Scragg a evidentiat avantajele membranelor hidrofobe, recomandind utilizarea acestora in constructia filtrelor der aer (tabel 2.15). Tabel 2.15.Performantele sterilizarii aerului prin filtrare pe fibre de sticla si pe membrane

Caracteristicile filtrarii

Strat de fibre de sticle

Membrane de 0,2-0,45 Da

Retinerea absoluta a contaminantilor Capacitatea de indepartarea impuritatilor

Nu

Inalta

Scazuta

Eficacitatea retinerii particulelor mici Inalta Eficacitatea retinerii depinde de viteza de curgere si presiune Posibilitati de strapungere (trecere prin filtru) Da Da

Inalta Nu

Nu

Utilizarea filtrelor cu membrane inregistreaza costuri mai mari, ceea ce poate limita, in anumite situatii, extinderea in aplicarea practica. c). Fermentatia Fermentatia este faza fundamentala a procesului de biosinteza si desemneaza procesul de crestere a microorganismelor pe medii de cultura, in scopul biosintetizarii penicilinelor. Pentru aceasta, o etapa importanta o constituie selectia si ameliorarea genetica a suselor producatoare de penicilina. Cea mai eficienta metoda de obtinere a suselor inalt productive din tulpinile de microorganisme izolate din diverse surse (fructe, cereale, sol, deseuri alimentare etc.), o reprezinta selectia sub influenta factorilor mutageni. Mutantii apar fie in mod spontan, printr-un mecanism de modificare la nivelul genelor, fie ca rezultat al tratarii microorganismelor cu diferiti agenti fizici sau chimici. Selectia mutantilor se face prin metode repetate de tratament

mutagen, urmat de selectia celor mai vigurosi mutanti. Susele obtinute prin repetarea proceselor de tratare mutagena au produs cresteri semnificative ale randamentelor in prdusele biosintetizate. Spre exemplu, susa producatoare de penicilina (Penicillium crysogenum), care in conditii naturale produce 1-20 mg/l, prin tratamente se selectie permite obtinerea obtinerea unei productii de 55-60 g/l. [12, p.251] Dupa insamantarea susei pe mediul de cultura steril, are loc procesul de fermentatie biochimica care se realizeaza in trei trepte-fermentatia in inoculator, intermediar si regim- care corespund anumitor stadii de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, in inoculator se realizeaza aclimatizarea microorganismelor la noile conditii de dezvoltare, in intermediar are loc acumularea de masa celulara, iar in regim se desavarseste procesul de crestere a masei celulare si de elaborare a penicilinei. Aceasta etapizare este oarecum idealizata deoarece elaborarea de penicilina incepe inca din fermentatorul intermediar, ca rezultat al distributiei varstei microorganismului. Fazele metabolice ale procesului de biosinteza a penicilinelor sunt urmatoarele: -faza de crestere: se caracterizeaza prin acumulare de masa miceliana si utilizarea intensiva a componentelor mediului de cultura; glucoza este asimilata foarte rapid atat pentru formarea materialului celular cat si pentru furnizarea energiei necesare, cerintele de oxigen sunt maxime, iar activitatea respiratorie, caracterizata prin degajarea de CO2 este ridicata; -faza de producere a penicilinelor: se caracterizeaza prin incetinirea cresterii miceliului, fie datorita epuizarii constituientilor usor asimilabili, fie altor conditii existente, scaderea consumului de oxigen si acumularea de penicilina; in aceasta etapa lactoza este folosita lent de catre miceliu si furnizeaza energia proceselor de biosinteza sau pentru formarea constituientilor celulari; -faza autolitica: corespunde stadiului in care microorganismul se epuizeaza ca urmare a activitatii metabolice prelungite si consumarii surselor de carbon si energie din mediu; continutul de azot al miceliului creste considerabil si incepe procesul de autoliza al acestuia, cu eliberare de amoniac si cresterea valorii pH-ului peste 8. Producerea penicilinelor inceteaza si apare un proces de hidroliza alcalina a acestora. Eficacitatea procesului de biosinteza a penicilinelor depinde de urmatorii factori: -conformatia genetica a tulpinii, care decide capacitatea de producere a penicilinelor; -folosirea unui echilibru rational intre componentii mediului de cultura; -dozarea corecta a raportului dintre glucoza (sursa de energie pentru cresterea masei celulare) si lactoza (sursa de energie pentru eliberarea penicilinei); -dozarea corecta (cantitativ si in timp) a precursorului (acid fenilacetic pentru penicilina G si acid fenoxiacetic pentru penicilina V); -asigurarea necesarului de substante minerale; -asigurarea necesarului de oxigen, respectiv mentinerea rH-ului intre anumite valori; -folosirea unui sistem de agitare adecvat, care sa permita dizolvarea oxigenului in mediu cu viteza corespunzatoare cerinetelor de oxigen ale microorganismelor; mentinerea temperaturii si pH-ului la valorile prescrise. Parametrii procesului de biosinteza a penicilinelor in cele trei stadii, sunt redati in tabelul 2.16. Tabel 2.16. Parametrii procesului de fermentatie biochimica a penicilinelor Etapa de Temperatura Agitarea Debit aer Presiunea Durata

fermentatie Inoculator Intermediar Regim 261 261 261

[C]

[rot / min] 270 170 120

[laer / lmediu x min] 1,0 1-1,2 0,6-1,0

[ata] 1,2-1,3 1,2-1,3 1,2-1,3

[h] 30-40 20-40 90-120

Alimentarea cu oxigen a mediului de cultura este unul din factorii decisivi ai dezvoltarii microorganismului aerob Penicillium, producator de peniciline. Pentru intensificarea procesului de dizolvare a oxigenului in lichidele de cultura se recomanda combinarea barbotarii aerului cu amestecarea mecanica. Deoarece acumularea biomasei conduce la reducerea pronuntata a coeficientului de transfer de masa al oxigenului (in cazul culturilor de Penicillium chrysogenum viteza de dizolvare a oxigenului se reduce cu 90% in prezenta a 3% s.u. miceliu) se recurge la modificarea regimului hidrodinamic al fermentatorului, prin intensificarea agitarii, in scopul atingerii unor timpi convenabili pentru realizarea egalizarii concentratiei in toata masa de lichid din fermentator. Durata fermentatiei este de 120-125 ore iar procesul de crestere a microorganismelor poate fi urmarit prin determinarea masei celulare sau a densitatii celulare si prin determinarea numarului de microorganisme sau a concentratiei celulare. Masurarea cresterii se face prin metoda tubidimetrica sau cu analizor continuu in infrarosu (prin determinarea CO2 din gazele care parasesc culura aerata in timpul procesului de fermentatie). In practica, este foarte comod sa se urmareasca ciclul de crestere prin determinarea numarului de microorganisme sau a acumularii acestora in timp. Din punct de vedere al modului de realizare a culturilor microbiene, biosinteza penicilinelor se efectueaza, printr-un procedeu de cultura in profunzime. Instalatiile folosite pot functiona in regim discontinuu sau continuu. Fermentatia discontinua (sistem de cultivare batch) se caracterizeaza prin faptul ca microorganismele parcurg intr-un singur bioreactor toate etapele de dezvoltare, dupa care procesul se reaia de la capat. In acest sistem de fermentatie nu se poate asigura de la inceput intreaga cantitate de substrat limitativ (o concentratie mare a acestuia in mediul de cultura manifesta un efect inhibitor pentru cresterea microorganismelor, fenomen cunoscut sub denumirea de inhibitie de substrat) si, de aceea, se impune adaugarea de substrat, precum si de precursori, pe parcursul procesului fermentativ, fapt ce genereaza probleme suplimentare in mentinerea conditiilor de sterilitate in bioreactor. Fermentatia continua poate fi realizata intr-un singur bioreactor, intr-o baterie de bioreactoare, cu debit constant (viteza de dilutie constanta) sau in mai multe bioreactoare aranjate liniar, cu variatie a vitezei de dilutie sau a debitului de alimentare prin baterie. Ambele sisteme pot functiona fie cu recircularea unei parti din biomasa, fie cu recircularea fazei apoase, daca aceasta contine cantitati apreciabile din componentele nutritive Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza deoarece in dezvoltarea lor microorganismele au nevoie de hudrati de C,N2, substante minerale si precursori. Sursele de hidrati de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor si producerea antibioticului. Biosinteza penicilinelor se poate realiza numai daca se desfasoara simultan procese de oxidare ale hidratilor de C care constituie sursa principala de energie. Dirijarea proceselor de biosinteza spre o anumita penicilina se face cu ajutorul unor substante care sunt inglobate in catena laterala a penicilinelor si poarta numele de precursori. Penicilina G utilizeaza ca precursor fenilacetamida, iar pentru procesul de fermentatie se realizeaza in fermentatoare cilindrice verticale construite din otel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau turbina, serpentina pentru racire, conducta pentru aerare, dispozitive sparge val, teca termocuplu, filtru individual de aer. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un grad sporit de securitate impotriva infectiilor iar stuturile cu garnitura metalica pe toata suprafata flanselor de legatura.

d).Filtrarea solutiilor native Penicilinele obtinute prin biosinteza sunt produse extracelulare si, ca urmare, acestea se ragasesc, la sfarsitul etapei de fermentatie, in lichidul de fermentatie. Culturile de Penicillium produc, in urma fermentatiei, mase celulare cu caracter fibros, motiv pentru care filtrarea lichidelor de fermentatie este o operatie relativ usoara, deoarece miceliul nu colmateaza materialul filtrant si se desprinde usor de pe acesta. In cazul filtrarii lichidelor de fermentatie rezultate in urma procesului de biosinteza a penicilinelor, se recomanda, la nivel industrial, filtrele rotative cu vid (filtre celulare Oliver). [2, p.38] Solutia rezultata in urma filtrarii, se raceste la 3-5C, in scopul evitarii reactiilor de degradare a penicilinelor, dupa care se depoziteaza intr-un rezervor de asteptare, de unde este trimisa la separarea prin extractie a penicilinei respective. In unele tehnologii, solutia racita este tratata cu cetazol 10% pentru coagularea albuminelor, se refiltreaza si abia apoi este trimisa la extractie. Alegerea utilajului pentru filtrare este determinata de factorii: caracterul suspensiei, productivitate, rezultatele cerute si materialul de constructie. Pentru filtrarea lichidelor care contin masa celulara fibroasa provenita din culturile diferitelor specii de microorganisme din clasa Penicillium si Aspergillus, sunt recomandate filtrele rotative cu vid; acestea ofera o suprafata de filtrare mare si posibilitati de spalare a miceliului pe filtru fara a necesita operatii normale iar caracterul fibros permite detasarea usoara de pe suprafata filtrului. Alegerea materialului de constructie este determinata de caracterul agresiv al solutiilor ce se supun filtrar Alegerea materialelor filtrante pentru diferite suspensii se face in mod empiric. In calitate de materiale filtrante se pot folosi tesaturi din bumbac, lana sau fibre sintetice, iar la alegerea panzei este necesar sa se tina seama de de natura chimica a mediului, temperatura, precum si de conditiile de functionare ale diferitelor tipuri de filtre. Filtrul rotativ cu vid este construit dintr-un tambur rotativ compus din doi cilindri orizontali coaxiali. Cilindrul exterior este perforat si acoperit cu material filtrant iar spatiul dintre cei doi cilindri este impartit in 10-12 celule etanse, fiecare celula functionand succesiv, independent ca filtru nuce. Legatura dintre aceste celule si conductele de vid, cu aer comprimat se realizeaza prin intermediul capului de distributie,iar indepartarea miceliului de pe tambur se face cu ajutorul unui cutit razuitor. Suprafata tamburului este impartita in mai multe zone in care se realizeaza operatiile de filtrare, uscare si indepartare a stratului de miceliu depus. In timpul unei rotatii fiecare celula trece prin toate aceste zone. Tamburul filtrului rotativ cu vid are un grad diferit de scufundare in suspensia ce se filtreaza. Stabilirea adancimii de scufundare se face functie de caracterul stratului filtrant si a necesitatilor de spalare si uscare. In productia de antibiotice se utilizeaza filtre cu adancime de scufundare a tamburului de 50%.

Figura 2.25. Schema filtrului rotativ cu vid 1- tambur;2- capul distribuitorului;3- cutit razuitor;4- buncar;5- cuva;6- conducta de apa pentru spalare;6- conducta de apa pentru spalare;7- celule filtrante;8- strat depus;I- zona filtrarii;II si IV- zonele uscarii;III-zona de spalare;V- zona de indepartare a sratului depus.

Daca produsul se gaseste numai in solutia nativa, spalarea masei celulare dupa filtrare este usoara. Titusi, aici pot avea loc pierderi mari, pentru prevenirea lor trebuie ales cu grija locul de amplasare a jeturilor cu apa si debitul apei de spalare, pentru a nu dilua prea mult filtratul. Filtrele rotative cu vid pot fi construite din otel carbon, otel inoxidabil, otel captusit cu cauciuc,sau epoxid, aliaje etc. Alegerea tipului de filtru se face in functie de suprafata de filtrare determinata prin raportul dintre volumul total de lichid V, filtrat in timpul si volumul de filtrat V ce trece prin 1 m 2 suprafata de filtrare in timpul . Valoarea V se determina cu ecuatia filtrarii functie de constantele experimentale k si c.

unde: k- constanta de filtrare,m2/h c- constanta de filtrare care caracterizeaza rezistenta materialului filtrant. C<k poatefi neglijata, iar in aceste conditii cantitatea de filtrat V se calculeaza cu relatia :

unde:

- caderea de presiune in filtru,N/m2; - vascozitatea filtratului Ns/m2; - rezistenta stratului depus,m/kg - continutul de faza solida,kg/m3.

Pentru filtre continui care lucreaza cu suprafete reanoite de relatia:

reprezinta durata unui ciclu de filtrare si este data

unde: n- turatia filtrului tambur - gradul de scufundare a filtrului in suspensie. Viteza de filtrare pe filtre tambur se determina functie de cantitatea de filtrat pe 1 m 2 suprafata si durata de filtrare a unui ciclu, cu relatia:

La filtrarea lichidelor de cultura , valoarea lui V se determina fie cu ecuatia monograma pentru determinare conditiilor de filtrare.

fie cu

Calitatea lichidelor filtrate depinde de alegerea corecta a mediului filtrant. Daca filtratul initial este usor opalescent acesta trebuie returnat in rezervorul filtrului pentru clarificare. Filtratul de la ultima parte a ciclului de filtrare este limpede datorita efectului de clarificare al stratului de miceliu depus. Pentru evitarea filtratului opalescent se

recomanda utilizarea unui vid mai redus pentru prima parte a filtrarii cand se obtine un strat filtrant pe suprafata materialului. Viteza de filtrare pe filtre tambur se determina functie de cantitatea de filtrat / m2 suprafata. Viteza de filtrare experimentala (vf) determinata pentru lichidele de fermentatie in cazul biosintezei penicilinelor G este redata in tabelul 2.17. Tabel 2.17.Viteza de filtrare a lichidului de fermentatie rezultat la biosinteza penicilinelor V si G Lichid de fermentatie (produs) Cs [kg/m Caracteristicile filtratului Tipul filtrului vf [l/m2 x h] rp [m/kg] 3,1 x 10 Filtru rotativ cu vid Filtru rotativ cu strat adjuvant Cs - continutul de faza solida al mediului, - vascozitatea filtratului, rp - rezistenta precipitatului depus pe filtru Extractia Separarea penicilinelor G din lichidul de fermentatie, se realizeaza industrial prin extractie fizica. Concentratia finala a penicilinelor in lichidele de fermentatie este cuprinsa intre 3 si 6%, in functie de tulpina utilizata. Datorita dilutiei foarte mari, este necesara concentrarea solutiei prin extractie si reextractie. Penicilinele pot fi extrase fie din solutia apoasa rezultata in urma filtrarii biomasei, fie direct din lichidul de fermentatie. Pentru separarea penicilinelor prin extractie lichid-lichid au fost studiati diferiti solventi (tabelele 2.18 si 2.19.), dintre care cel mai eficient s-a dovedit a fi acetatul de butil (s-au avut in vedere coeficientul de distributie a penicilinei intre cele doua faze, caracteristicile fizico-chimice, toxicitatea, pretul de cost etc.). Tabel 2.18. Coeficientii de distributie ai penicilinei G intre solutia apoasa si diversi solventi organici la 0C Solvent Coeficient de repartitie pH=0 Metiletilcetona Dimetilciclohexan Metilciclohexan Ciclohexan Furfurilacetat Metilizobutilcetona Dimetilftalat Acetata de amil 180 160 80 62 44 33 30 20 pH=4,0 19 15 7 4 4 3 2,7 1,8 238 - 256 1413 - 1848

[Pa x s] Penicillium (peniciline G si V) 50 10,3

Dietiloxalat

20

1,8

Tabel 2.19. Coeficientii de distributie ai penicilinei G intre solutia apoasa si diversi solventi organici la Solvent Coeficient de repartitie titrimetric Acetat de izobutil Acetat de butil Acetata de amil Cloroform Eter etilic Dicloretan Diizopropileter Toluen Tetraclorura de carbon 63 30 27 24 14 7,8 0,12 0,1 0,03 microbiologic 67 35 39 37 14 8,6 0,11 0,06 0,015

Extractia penicilinelor in acetat de butil decurge cu randamente maxime numai daca moleculele de antibiotic din faza apoasa sunt in forma nedisociata, deoarece solventii nepolari sau cu polaritate redusa (cazul acetatului de butil) pot solubiliza numai compusi nepolari (extractia este moleculara). Din analiza procesului de extractie fizica a penicilinelor G si V cu acetat de butil s-a constatat ca: -in solvent sunt extrase numai moleculele de penicilina nedisociate, fapt ce impune mediu puternic acid; -intre moleculele de penicilina sub forma acid liber nu au loc asociatii moleculare in conditiile in care se realizeaza extractia; -in acetatul de butil penicilinele nu disociaza. Deoarece contin o grupare carboxilica, penicilinele vor disocia in faza apoasa conform echilibrului:

Schema de operatii pentru separarea penicilinelor prin extractie fizica cu acetat de butil este redata in figura 2.25.

Figura 2.25. Schema de operatii la separarea prin extractie fizica a penicilinelor G Datorita dilutiei mari, separarea penicilinelor se poate realiza rentabil prin extractii repetate cu solventi. In aceste conditii echilibrul de faza la extractia penicilinei cu acetat de butil depinde numai de temperatura si pH iar distributia intre faza apoasa si solvent este descrisa prin coeficienti cu repartitie k0 si k.

unde: coeficent de repartitie penicilinei nedisociate; k coeficient efectiv de repartitie; cs concentratia penicilinei in solvent; ca, - concentratia penicilinei nedisociate in faza apoasa; ca concentratia totala a penicilinei in faza apoasa. Din ecuatia bilantului de materiale si a legii actiunii maselor rezulta:

unde: cH+- concentratia ionilor de hidrogen ca- - concentratia penicilinei disociate ka- - constanta de disociere a penicilinei. Reextractia-pentru a mari viteza de procesului de reextractie se transforma penicilina acid in sare de potasiu care , fiind insolubila in solvent trce cantitativ in apa. Procesul de extrcatie impune un pH la care penicilinele sufera procese de degradare. [2, p.64] Pentru a reduce la minim posibil procentul de degradare a penicilinei se folosesc extractoare centrifugale orizontale sau verticale capabile sa realizeze amestecarea fazelor, transferal de masa si separarea fazelor in cateva secunde. Timpul de contact scurt si o temperature redusa (0-5 0C) asigura obtinerea unor randamente de 70-75% in faza de extractie. Separarea penicilinei se realizeaza in trei stadii: - in primul stadium al extractiei are loc trecerea penicilinelor din solutia nativa in acetat de butil la un pH de 2 2.5( acidulare cu acid sulfuric 4-5%) folosind un raport volumetric intre solutia apoasa si acetate de butil 3:1. - in al doilea stadiu are loc trecerea penicilinei din acetate de butil in solutie apoasa de fosfat monosodic (4%) la pH=7-7.2 folosind raportul volumetric intre acetatul de butil si solutia apoasa de 3:1 -in al treilea stadium are loc trecerea penicilinei in acetate de butil, din nou in aceleasi conditii ca in primul stadiu. Final se obtine o solutie de penicilina in acetate de butil cu concentratia de 80-90.000UI/ml care se supune uscarii in vederea cristalizarii penicilinei. Pentru aceasta, solutia concentrate se raceste la (-10-12 0C) temperature la care apa din acetate de butil ingheata iar cristalele se filtreaza pe filtru de presiune. Solutia de penicilina in acetate de butil rezultata de la filtrare se trateaza cu acetat de sodiu sau potasiu , cand precipita penicilina sare care se filtreaza , apoi se aduce in vasul de spalare cu butanol. Dupa spalare penicilina sare se filtreaza si se purifica pe filtru cu cloroform pentru indepartarea butanolului. Intr-un stadiu mai recent se recomanda extractia penicilinei din solutia apoasa rezultata de la fermentatie sa se realizeze intr-un singur stadiu. Din solutia apoasa penicilina este extrasa in acetat de butil iar extractul organic se trateaza cu acetate de potasiu sau cu carbonat de potasiu. Penicilina sare precipita, se filtreaza si se spala cu butanol si cloroform. Solventii se recircula iar penicilina sare se dizolva in apa se purifica cu carbine active dupa care se anhidreaza prin distilarea apei sub forma de azeotrop cu butanol la un vid 4-6 mmHg. Produsul solid obtinut se caracterizeaza prin puritate foarte mare si activitate biologica conform normelor prevazute de Farmacopee. Cristalizarea este operatia de separare dintr-o solutie sau topitura a cristalelor mono sau pluri componente. Este o metoda de baza in purificarea principiilor active solide prin recristalizare din solutii purificate de substante brute. Atunci cand o solutie devine supraconcentrata ( concentratia mai mare decat concentratia de saturatie, (C>C S), pe germenii de cristalizare se depun noi molecule si ioni si are loc cresterea cristalelor. Germenii de cristalizare sunt impuritati solide, microcristale generate spontan sau microcristale introduse deliberat. Depunerea are loc depinzand de potentialul chimic al elementelor geometrice cristaline. Viteza creste in seria suprafata mare< suprafata mica<muchie < varf. Viteza de cristalizare , dimensiunile cristaline, forma cristalelor si puritatea lor sunt riguros correlate. La viteze mari de cristalizare, cresterea cristalelor este dezordonata, in forme cu suprafete specifice mari, cu inglobarea in structura cristalina a suprafetelor nedorite, de unde defectele de retea si cocristalizarile. Rezulta cristale mici imperfecte, impure care aglomereaza in aggregate cristaline. O viteza foarte mare duce la precipitare , cand rezulta o masa de microcristale atat de mici ca nu pot fi identificate prin metode fizice.

Vitezele mici de cristalizare se inregistreaza la: -numar mic de germeni de cristalizare; -concentratia solvitului cu putin mai mare decat cea de saturatie; -solvent de polaritate similara solvitului si solutii pure. La cristalizarea lenta edificiul cristalin se dezvoltafara defecte, impuritatile au timp sa se desoarba, potentialul chimic favorizeaza mai putin anumite fete deoarece cristalizarea- dizolvarea sunt cele doua componente ale unui echilibru. Cristalele sunt mai mari, translucide, continutul inert de microcristale este mic si puritatea remarcabila. Un rol esential il joaca solventul. El trebuie sa fie inert chimic de polaritate corespunzatoare, volatile si netoxic, de vascozitate mica, ieftin si disponibil. Trebuie sa asigure o solubilitate de saturatie destul de mare pentru economicitate darn u prea mare pentru asigurarea cristalelor. La solubilitati mici sunt necesare volume mari de solvent care trebuiesc recuperate ceea ce incarca costurile. La solubilitate mare din solutia concentrata vor cristaliza greu cristalele mici si impure din cauza cocristalizarii inerte. Principalii parametrii ai opereratiei de cristalizare sunt agitarea si programul de temperature. Agitarea trebuie sa fie continua si lenta. La turatie mare cristalele se sfarma prin frecare iar la una mica se depun pe fundul cristalizorului si formeaza un depozit compact nedorit. Programul de racire se coreleaza cu dimensiunea dorita. Racirea masei de recristalizare a acidului acetilsalicilic de exemplu cu 3-50C /h conduce la o pulbere omogena iar cu 1-2 0C /h rezulta cristale mari, translucide. Solubilitatea diferentiata a componentelor unui amestec permite separarea prin cristalizare fractionate. Mai intai se creaza conditii pentru cristalizarea componentei majore apoi se face o noua concentrare si cristalizeaza componenta secunda. La viteze mici de cristalizare se reuneste o impurificare minima cu co-componente. Pe aceste diferente de solubilitate se bazeaza purificarea prin recristalizare. Un produs brut se dizolva la cald, se purifica de obicei prin tratare cu carbine active pentru absorbtia impuritatilor colorate si la racirea controlata cristalizeaza in cristale pure, lasand in solutia numai impuritatile care nu-si gasesc locul in edificiul cristalelor formate. De putine ori in industria de medicamente se folosesc aparate speciale de cristalizare. Sunt utile doar reactoarele emailate, de sticla sau otel inalt aliat deoarece cristalizarea este o operatie de purificare finala a produselor. Sunt dotate cu agitatoare lente, manta de racire si robinete vana de descarcare. Se evita serpentinele pe care s-ar putea depune criatalele formate. Cristalizoarele sunt asociate cu filtre eficiente, dupa filtrare facandu-se uscarea si spalarea produselor de pe filtru centrifuga. Solutiile de spalare se racesc pentru pentru a limita pierderile prin dizolvarea unei faze solide de pe filtru. Filtrare/ Spalare In urma cristalizarii, solutia concentrate se raceste la (-10-12 0C), temperatura la care apa din acetatul de butil ingheata iar cristalele se filtreaza pe filtru de presiune. Solutia de penicilina in acetat de butil rezultata de la filtrare se trateaza cu acetate de sodiu sau potasiu, cand precipita penicilina sare. Penicilina sare obtinuta, care se filtreaza, este adusa in vasul de spalare cu butanol. Dupa spalare penicilina sare se filtreaza si se purifica pe filtru cu cloroform pentru indepartarea butanolului. Uscarea Este operatia de indepartare a umiditatii din gaze, lichide sau solide. Apa din cauza reacivitatii sale poate produce o serie de reactii secundare nedorite de hidroliza si hidratare.

Uscarea gazelor se face prin trecerea peste agenti deshidratati lichizi sau solizi plasati in vase de spalare sau coloane. Agentul se alege functie de natura gazului, care nu trebuie sa reactioneze cu agentul. Agentii de uscare uzuali sunt: H2SO4 conc; NaOH solid si silicagenul. Toti agentii sunt caracterizati de intensitatea si capacitatea de uscare: - cu acidul sulfuric se usuca clorul si acidul clorhidric - cu hidroxidul de sodium 65% practice nu mai sunt utili si urmeaza sa se foloseasca in alte scopuri. Silicagenul, alumina, sitele moleculare se pot regenera prin incalzire 30 min la 120 0C si refolosi. Acestea devin albastre cand silacagenul este epuizat. Uscarea se face pana la decolorarea granulelor albastre. O modalitate laborioasa de uscare a aerului este racirea sa la (-100 0C) cand continutul de apa scade foarte mult. Eliminarea umiditatii continute de lichidele utilizate drept reactanti sau solventi si din masele de reactie spalate cu apa se face prin distilare azeotropica cu benzene sau toluen iar pentru urmele de apa cu reactivi deshidratati cu sulfat de sodium, clorura de calciu si chiar sodium si hidroxid de sodium. [6, p.55] Uscarea materialelor solide se face pe cale termica. Chiar substantele labile termic se usuca prin evaporarea umiditatii dar in conditii menajante( la 20 0C/1 atm sau 20-300C / 50 torri). Utilizarea agentilor deshidratanti, ca in laborator la uscare in exicator peste acid sulfuric sau pentoxid de fosfor este scumpa si se aplica exceptional la produse termosensibile cum sunt enzimele cristalizate si hormonii polipeptidici. Umiditatea materialelor se exprima procentual si prin metode industrial. O uscare nu ar necesita temperaturi prea ridicate care ar afecta produsele. Uscarea prin mijloace termicese realizeaza in uscatoare de cele mai variate constructii sub actiunea unui current se aer. Are loc o evaporare a umiditatii dintre granule / cristale, apoi o difuzare lenta a apei ( solventului) din interiorul granulelor sau agregatelor cristaline spre suprafata acestora si o evaporare rapida. Vehicularea aerului o realizeaza un ventilator. Aerul este antrenat de ventilator, filtrate de impuritati mecanice intr-un filtru( cu saci), incalzit in bateria de incalzire de la temperature exterioara la cea de intrare cu umiditatea 0, trece pe deasupra materialului, evapora apa, se raceste partial isi mareste umiditatea si iese cu parametric finali. Pentru economicitate, o parte din aerul cald de iesire se recircula si se amesteca cu cel proaspat. Cel mai frecvent folosit este uscatorul camera sau dulap denumire data de forma camerei de uscare. Materialul de uscat este depus pe tevi de dimensiuni manipulabile, confectionate din materiale rezistente chimic si termic la conditiile de uscare(tabla de otel inoxidabil sau aluminiu).

4.2 Caracteristicile mareriilor prime, intermedilor si auxuliarilor

Penicillium Crysogenium face perte din categoria fungilor. Fungii sunt organisme filamentoase saprofite (care cresc pe suprafata substantelor intrate in putrefactie si nu produc boli). Ei se produc pe cale asexuata (fara participarea unor gameti de sexe diferite). Sunt organisme cu o mare capacitate de adaptare laq conditiile variate, nefavorabile ale mediului in care isi desfasoara activitatea. Ele cresc in conditii extrem de acide, presiune osmotica, uscaciune etc [10, p.65] Are structura celulara de tip eucariot: Aparatul lor vegetal (formele de crestere si dezvoltare) este diferit de la o specie la alta. El poate fi: a).- un gimnoplast sau un plasmodiu b).- dermatoplast

c).- sifonoplast d).- talc tipic a).- Plasmodiu este forma de existenta a fungilor cu organizarea cea mai inferioara. El este alcatuit dintr-o masa citoplasmatica multinucleata lipsita de peretele celular rigid. Este caracteristic fungilor primitivi. b).- Dermatoplastul este aparatul vegetativ intalnit la cele mai multe levuri. El este format dintr-o singura celula cu perete celular rezistent. Citoplasma si nucleu tipic eucariotelor. c).- Sifonoplastul este aparatul vegetativ intalnit la multe ciuperci filamentoase. El este alcatuit din numeroase filamente subtiri cunoscute sub numele hife a caror impletire da un miceliu. Hifele miceliene au forma tubulara, sunt rigide, prezetand diametre relativ egale pe toata lungimea lor. La exterior sunt delimitate de peretele hifal, rigid iar in interiorul hifei se afla citoplasma in care sunt inglobati nucle La aceste ciuperci numarul nucleilor este variabil. Hifa are lungimi diferite si nu prezinta septuri intracitoplasmatice (figura A). d).- Talul este aparatul vegetativ intalnit la ciupercile superioare. El este format din numeroase hife care se impletesc si formeaza un miceliu cunoscut sub numele de tal. Hifele talului pot fi septate complet sau incomplet (figura B,C) prezentand impletituri mai mult sau mai putin compacte. La ciupercile din clasa Dasidiomycetes hifele se impletesc compact formand un tal maxim. La toate ciupercile la care aparatul vegetativ este un miceliu, se constata in mod obligatoriu 2 parti: 1. o portiune formata din hife fine bogat ramificate care patrund complet in substrat, ele formand miceliu de substrat. Aceste hife sunt cunoscute sub numele de rizoizi si formeaza sistemul rezoidal al miceliului. 2. o portiune aeriana alcatuita din hife lungi, mai putin ramificate si mai rezistente. Ele formeaza miceliul aerian.

Figura2.26. Tipurile de hife intalnite la ciuperci cu organizare superioara A-hifa neseptata; B-hifa septata cu pereti incompleti; C-hifa septata cu pereti completi Structura interna desi este tipica eucariotelor, exista totusi si unele deosebiri de la o forma la alta de mucegaiuri. Deosebirile ce pot apare se refera la prezenta sau absenta septului sau peretelui hifal. In general in structura unor hife se pot distinge urmatoarele formatiuni structurale tipice celor mai multe eucariote: peretele celular (hifal), membrana plasmatica, citoplasmatica si constituientii citoplasmatici si nucleu.

Figura 2.27. Reprezentarea schematica a structurii interne ale mucegaiurilor (sectiune printr-un fragment de hifa) - Perete celular Hifa este delimitata la exterior de un perete rigid in structura careia intra chitina, celuloza, polizaharide si unii acizi grasi. [10, p.66] Peretele hifal acopera membrana plasmatica si tot el este cel care participa la formarea septului hifal. - Membrana plasmatica Are o structura tristratificata si se presupune ca ar avea un rol important in formarea aparatului Golgi. Are totodata importante roluri in transportul unor substante din mediu in celula si din celula in mediu. - Citoplasma Se prezinta sub forma de masa granulata, in care suspectate vacuole,picaturi de grasimi, numeroase granule de incluziuni si particule. In citoplasma se gasesc de asemenea, reticulul endoplasmatic rugos bine dezvoltat, aparatul Golgi, mitocondrii, ribozomi liberi sau fixati de reticolul endoplasmaic si lizozomi, formatiuni structurale cu rol in liza unor substante. Fiziologie si metabolism. Mucegaiurile au o nutritie de tip heterofob, adica necesita pentru crestere si dezvoltare medii bogate in substante organice. Sursa de carbon poate fi glucoza sau oricare alta substanta glucidica,alcooli si acizii organici. Ca sursa de azot fungii pot utiliza sarurile de amoniu si nitrati. Fungii cresc bine in atmosfera umeda, iar pH lor optim este 5-6. sunt mocroorganisme cu capacitate biosintetica mare putand sintetiza pe cai metabolice diferite polizaharide, lipide, acizi organici, pigmenti, substante antibiotice sau alte substante biologie active. Temperatura optima de crestere este de 22-32oC. Insa ei pot creste la temperaturi de 5-10oC, dar si la temperaturi de 35-40oC. Aproape toti fungii de interes industrial sunt aerobi, necesitand o concentratie ridicata de O2. Prin activitatile lor metabolice si de posibilitatie de a transforma cu usurinta o gama mare de substante mucegaiurile au devenit unul dintre factorii biologici cei mai utilizati in industria alimentara si industria biotehnologica. . Extract de porumb STAS-1445/88 Extractul de porumb are urmatoarele caracteristici:

Aspect: lichid cremos de culoare galben inchis. Miros: caracteristic unei fermentatii lactice. Sedimentare: dupa 24 de ore intr-un cilindru de 100 ml de 100%. Aspect microscopic: in frotiu colorat prezinta o masa bacteriana tipica bacteriilor lactice, in proportie de peste 90. Substanta uscata: minim 50%. pH=3,5-4. Continutul in acid lactic: minim 20g la 100g substanta uscata Zahar total: maxim 2,5%. Tabel . 2.18.

Constituienti g/100g extract de porumb Substanta uscata Cenusa N total Zahar total (exprimat x g glucoza) Acid lactic

Domenii de valori 46-49,6 8,04-10,43 3,33-3,67 4,00-4,70 0,74-4,39

Aciditate (ml sol.NaOH 0,1N/100g extract de 11,6-19,3 porumb) Fe P Ca Zn K SO2 Sedimente solide
Butanolul STAS-903-62 Identificare: - formula chimica C4H10O - masa moleculara 74,12 Proprietati fizice: - p.f.= 98oC

0,009-0,02 1,5-1,9 0,02-0,07 0,05-0,012 2,0-2,5 0,22 38,4-52,9

densitate relativa indice de refractie 1,3975 aciditate exprimata in CH3COOH, %max= 0,02 aspect: lichid limpede, incolor miros: caracteristic

Acetatul de butil Identificare : - formula chimica CH3CO(CH2)3CH3 - masa moleculara 116,16 Proprietati fizice : - aspect : lichid limpede, fara substante in suspensie, inflamabil. Se fabrica in trei tipuri functie de continutul de eter. - tipul 98 pentru industria antibioticelor (interval distilare 123-127 CH3CO(CH2)3CH3 o C) - tipul 92 - tipul 88 - miros caracteristic - d= 0,878g/cm3 Lactoza-este un dezaharid reducator (4-B-D-galactozido-D-glucoza) care se foloseste in stare pura numai pentru biosinteza antibioticelor. Solutia tehnica de lactoza, rezultata ca subprodus in industria branzeturilor se utilizeaza in concentratie de 70=75% pentru obtinerea alcoolului etilic, a drojdiei pentru panificatie, a proteinelor monocelulare(SCP), a acidului citric. Solutia aceasta mai contine, pe langa lactoza, 12-14,5% proteine si 8-9 % saruri minerale.[1, p 63] Glucoza-este o sursa excelenta de carbon si energie, foarte mult utilizat pentru sti-mularea cresterii microbiene, uneori constituind chiar precursorul de biosinteza. Insa glu-coza poate genera si efecte nedorite, de tipul inhibitiei de substrat, indezirabbile la produ-cerea unor metaboliti secundari, efecte care pot fi diminuate prin doua cai: -modelarea adaosului de glucoza pe intreaga durata a etapei de crestere a bioma-sei, astfel incat sa se realizeze viteze maxime de crestere sis a se reduca la minim concen-tratia glucozei; -utilizarea zaharurilor cu viteza lenta de metabolizare, cum ar fi lactoza care prin hidroliza enzimatica elibereaza glucoza si galactoza in concentratii departe de valoarea inhibitorie. Glucoza (cunoscuta si sub numele de sinonima de dextroza) este folosita ca sursa de carbon si energie pentru producerea antibioticelor, steroidelor, aminoacizilor, acizilor organici mono si policarboxilici, a polizaharidelor microbiene. Sursele comerciale de glucoza sunt: -siropul de glucoza 32-40% glucoza; -glucoza solida 65-66%; -glucoza cristalizata cu 99-100% glucoza Tabel .2.19.Proprietati fizice si chimice ale glucozei [1, p.61]

Tipul Categoria

Glucoza Glucoza solida lichida aromatizata nearomatizata -

Metoda analiza

de

Culoare, cm3 iod 1,5 solutie 0,1n la 100 cm3, max Aciditate, grade, max Umiditate %max 2,5 18,5

Pct 4.2

2,8 20,0 Min 87 Lipsa 1 5 0,050

2,8 20,0 Min 75 Lipsa 1 5 0,050

Pct 4.3 Pct 4.4 Pct 4.5 Pct 4.6 STAS 2213/1369 STAS 2213/1469 STAS 2213/1569

Dextroza raportata la 3949 substanta uscata % Aciziminerali liberi Plumb, mg/kg, max Cupru, mg/kg, max Arsen, mg/kg, max Lipsa 1 5 0,050

Tabel .2.20.Proprietati organoleptice

Tipul Categoria Aspect Culoare Miros Gust Corpuri straine

Glucoza lichida Aromatizata

Glucoza solida Nearomatizata

Lichid vascos Incolora pana la galben Lipsa Dulce, specific Lipsa

Masa solida, cristalizata, subMasa solida forma de tablete Alba pana la galben Caracteristic aromei ,adaugate lipsa

Dulceag, slab amarui Lipsa lipsa

4.3Cinetica proceselor biochimice

Cinetica proceselor de fermentatie discontinua Studiul mecanismului reactiilor enzimatice, a proceselor metabolice si a vitezei de transformare a substratului in produs se face prin metoda cinetica. Aceasta metoda repre-zinta singura posibilitate de studio a proceselor enzimatice, deoarece numarul enzimelor pure separate pana in present este relative redus.

Intratarea problemelor de cinetica enzimatica, referitoare la viteza de formare a produsului sau de crestere a biomasei, se vor utiliza definitiile date de Gaden pentru vite-za de fermentatie, viteza volumetrica si viteza specifica. [1, p.144] Viteza de fermentatie este definite prin variatia momentana a concentratiei pro-dusului, a intensitatii respiratiei sau a concentratiei masei celulare, iar viteza volumetrica este definite prin cantitatea de produs obtinuta, cantitatea de substrat utilizata, consumul de oxigen sau cantitatea de celule obtinute pe unitatea de volum de mediu de cultura si in unitatea de timp. Vitezele volumetrice calculate in functie de masa celulara, de consumul de zaharuri, de cantitatea de produs biosintetizat si de consumul de oxigen la fermentatia penicilinei sunt redate grafic in figura .

Figura 2.31 .Vitezele volumetrice la fermentatia penicilinei ABCDviteza de utilizare a oxigenului, g/l.h. viteza de crestere a masei celulare, g/l.h viteza de consum a zaharurilor, g/l.h viteza de producere a penicilinei, g/l.h

Viteza specifica se defineste prin raportul dintre viteza volumetrica si densitatea bacteriana, fiind exprimata in grame produs obtinut in unitatea de timp si pe gram de masa celulara. Pentru cazul concret al fermentatiei penicilinei, vitezele specifice sunt prezentate in figura 2.34 . Procesele metabolice care au loc in interiorul celulelor vii sunt reactii fizico-chi-mice foarte complexe care se produc cu viteze mari si sunt catalizate de enzime. Refe-ridu-se la acest aspect, Gaden defineste fermentatia ca reprezentandreactiile chimice catalizate de sisteme care, la randul lor, sunt produse de catre microorganisme in timpul cresterii.

Figura 2.32. Vitezele specifice la fermentatia penicilinei ABCDviteza de producere a penicilinei, g/g.h viteza de utilizare a oxigenului, g/g.h. viteza de consum a zaharurilor, g/g.h viteza de crestere a masei celulare, g/g.h

Enzimele sunt macromolecule cu structura proteica care catalizeaza procesele biochimice. Din punct de vedere structural, enzimele sunt compusi de natura hetero-proteica cu sensibilitate deosebita la toti factorii care afecteaza proteinele. Activitatea enzimelor este influentata de temperatura, ph, presiune osmorica, concentratia substra-tului, concentratia produsilor rezultati in reactie. Activitatea enzimatica este inhibata de anumiti agenti specifici, printre care: sulfamide, antibiotice, narcotice, coloranti, apa oxigenata, dioxid de carbon, dezinfectante.Substanta asupra careia se exercita actiunea enzimelor se numeste substrat . Prezenta enzimelor permite transformarea substratului la temperatura normala a materiei vii, oferind, in acest fel, energia necesara desfasurarii procesului debiosinteza. Functia esentiala a enzimelor consta in accelerarea vitezei reactiilor metabolice la temperature normala a organismelor. Avand activitatea catalitica foarte ridicata, enzimele reduc considerabil barierele de potential ale reactiilor de transformare a substratului, facilitand astfel deplasarea echilibrului spre formarea de produs. Mecanismul prin care enzimele transforma substratul poate fi descris cu ajutorul teoriei starii de tranzitie. Aceasta teorie presupune ca substratul se combina cu enzima formand un complex activat, instabil, care ulterior se descompune in produs si enzima. Enzima eliberata reia ciclul de transformare a substratului, conform schemei:

in care: E-enzima libera;

S-substrat;

P-produs.

E-S*- complex activate enzima-substrat; K+ - constanta de viteza a reactiei de formare a complexului enzima- substrat; K-1- costanta de viteza a reactiei de formare a substratului si enzimei din com-plexul enzima-substrat K2- constanta de viteza a reactiei de formare a produsului din complexul enzima- substrat.

De asemenea, se poate admite ca intre enzima si substrat, pe de o parte, si com-plexul enzima-substrat, pe de alta parte, exista un echilibru descries prin ecuatia:

(1) Iar viteza de descompunere a complexului enzima- substrat in produs esteredata prin intermediul expresiei:

(2) unde; CE-S*-concentratia complexului enzima-substrat in stare activate. Kc*-constanta de echilibru KB-constanta Boltzman h-costanta Planck Viteza reactiei de formare a produsului este redata de expresia (3): Vp =[viteza specifica de descompunere a complex. Activate]x[conc. complex. activat ]

(4) Prin combinarea ecuatiilor (1) si (4) se obtine:

(5) Exprimand constanta de echilibru a formarii complexului activate functie de energia libera standard figurii ,rezulta: (6) Din aceasta ecuatie, constanta de echilibru se poate determina cu expresia:

,conform

(7) Introducand valoarea din ecuatia (7) in ecuatia (5) se obtine expresia vitezei de reactie:

(8)

Teoretic, atat variaza putin cu temperature, iar termenul este foarte putin influentat de temperatura, astfel incat poate fi considerat constant. In aceasta ipoteza, prin diferentiarea ecuatiei (8) in raport cu temperature, se obtine:

(9) In care reprezinta energia de activare a reactiei enzimatice, determinate cu expresia: (10)

Figura 2.33.Variatia energiei intr-o reactie enzimatica.

Eroarea comisa prin aproximarea lui cu nu este grava, deoarece in cele mai multe sisteme biologice, la circa 300 K, valoarea termenului RT=2500j/mol este foarte mica comparativ cu valoarea entalpiei de activare, care, in mod obisnuit, depaseste 45000 j/mol. Cu aceste consideratii, ecuatia (8) devine:

(11) Valorile vitezei de reactie V din aceasta ecuatie redau o imagine generala a activitatii enzimelor implicate intr-un proces biologic. Prin urmare, utilizand teoria starii de tranzitie, s-a stabilit ca viteza procesului enzimtic este determinate de viteza de formare a produsului din complexul activat. Aceasta concluzie este confirmata si de datele practice. Astfel, reprezentand viteza reactiilor enzimatice in functie de concentratia substratului (figura.2.34.), se obtine intotdeauna o curba, spre deosebire de reactiile chimice pentru care aceasta variatie este liniara. Abaterea aparenta de la legea actiunii maselor se explica prin formarea, in prima etapa, a complexului enzimasubstrat si transformarea acestuia in produs, in etapa a doua. In final, enzima se reface, iar produsul obtinut difuzeaza in mediul de fermentatie sau in masa celulara.

Figura 2.34.Variatia vitezei reactiilor enzimatice in functie de concentratia substra-tului, C . Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului Michaelis si Menten dezvolta modelul cinetic al vitezei de formare a produsului in functie de concentratia substratului si a enzimei. Dupa acesti autori, reactia dintre enzima si substrat se desfasoara in doua etape. In prima etapa, viteza de reactie este dependenta direct de cantitatea de substrat, iar in etapa a doua, in care are loc fermentarea produsului si eliberarea enzimei, care este capabila sa reia ciclul descries de sistemul de reactie, viteza depinde de concentratia complexului enzima-substrat:

Viteza de formare a produsului in procentul enzimatic descris de sistemul (12) este:

(13) Pentru determinarea concentratiei complexului enzima-substrat, a acestuia, pentru cazul in care : , se utilizeaza expresia vitezei de formare

(14) In regim stationar, concentratia complexului nu variaza in timp, iar expresia ante-rioara devine: (15) Prin explicitarea ecuatiei (15) functie de , se obtine:

(16) Combinand ecuatia (16) cu ecuatia (13) rezulta:

(17) -viteza maxima de formare a produsului si corespunde stadiului in care intreaga cantitate de enzima formeaza complexul enzima-substrat.

- constanta de echilibru la disocierea complexului enzima-substrat.

- constanta Michaelis-Menten. Constanta este egala cu constanta de echilibru numai atunci cand . Cu cat valoarea in ecuatia

lui este mai mica, cu atat este mai mare afinitatea enzimei pentru substrat. Introducand constanta (17) se obtine:

(18) Aceasta ecuatie este denumita ecuatia Michaelis-Menten si descrie viteza de formare a produsului intr-un proces enzimatic, reprezentand modelul ideal pentru viteza proceselor enzimatice in regim stationar, lipsite de procese secundare de inhibitie. Ecuatia Michaelis-Menten a fost stabilita in ipoteza ca si Cresterea con-centratiei enzimei in mediu de fermentatie peste o anumita limita atrage dupa sine anula-rea acestei ipoteze si, in consecinta, viteza reactiei enzimatice nu va mai fi direct propor-tionala cu concentratia enzimei. Din reprezentarea grafica a ecuatiei (18)(figura 2.35.), se observa ca substratului C pentru care reactia porneste cu jumatate din viteza maxima, V. este acea valoare a concentratiei

Figura 2.35.Reprezentarea grafica a ecuatiei Michaelis-Menten Deoarece valoarea vitezei maxime de reactie este limita asimptotei la curba, ea nu poate fi determinate cu exactitate. Pentru determinarea constantei si a vitezei maxi-me V, se utilizeaza metodele de liniarizare. Una dintre acestea este metoda Lineweaver-Burk, care foloseste inversul ecuatiei (18):

(19)

Prin reprezentarea grafica a ecuatiei (19) in coordinatele (figura 2.36. ), care permite determinarea constantelor V si valorile experimentale ale vitezei de formare a produsului.

si

se obtine dia-grama Lineweaver-Burk

in functie de variatia concentratiei substratului si de

Figura 2.36. Reprezentarea grafica a ecuatiei Lineweaver-Burk. In literartura de specialitate se intalnesc si alte reprezentari ale ecuatiei Michaelis-Menten. Astfel, EadieHofsee obtin prin impartirea ecuatiei (18) la C :

(20)

Reprezentarea grafica a acestei ecuatii in coordinate

si

este o dreapta, redata in figura 2.37.

Figura 2.37.Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice dupa metoda Eadie-Hofsee. O alta reprezentare a ecuatieie Michaelis-Menten a fost propusa de Woolf. Autorul porneste da la ecuatia Lineweaver-Burk pe care o inmulteste cu C ,obtinand ecuatia (21), redata in figura 2.37.

(21)

Figura 2.37. Reprezentarea grafica a ecuatiei Michaelis-Menten dupa metoda lui Woolf. Modelul Michaelis-Menten a fost conceput ca un model ideal si descrie viteza de formare a produselor in procese de fermentatie perfecte. Insa, acest model, care abor-deaza cinetica enzimatica in regim stationar, poate fi extins si la procesele in care, alaturi de transformarea enzimatica a substratului in produs, intervin reactii de inhibitie com-petitiva sau necompetitiva a enzimelor. Prezenta inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare a degradarii mediului nutritiv in timpul sterilizarii, a unor reactii secun-dare sin nu numai. Principalele tipuri de inhibitii intalnite current in procesele fermentative sunt: - inhibitia competitiva; - inhibitia necompetitiva; - inhibitie de substrat; - inhibitie de produs. Procesul de transformare enzimatica a substratului in produs insotit de inhibitie competitive este descries prin reactiile:

(22) Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatica insotit de inhibitie competitiva este faptul ca enzima pusa in libertate prin disocierea complexului enzima-inhibitor, E-I, isi pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului in produs. [1, p.153] Viteza de formare a produsului este proportionala cu concentratia complexului enzima-substrat, de aceea este nacesara cunoasterea valorii acesteia, in regim stationar. In acest scop, se scriu constantele de echilibru, pentru situatia in care :

(23) si(24) unde: - concentratia inhibitorului; - concentratia complexului enzima-inhibitor. Se reduce termenul din ecuatiile (23) si (24) si se expliciteaza in functie de , obtinandu-se:

(25) Ecuatia vitezei de formare a produsului devenind:

(26) in care: = deoarece.

Ecuatia (26) descrie viteza de formare a produsului intr-un proces de fermentatie insotit de inhibitie competitiva a enzimei. Diferenta dintre aceasta ecuatie si ecuatia Michaelis-Menten consta in prezenta la numitor a

termenului datorat efectului generat de inhibitor. In concluzie, viteza de formare a produsului fiind invers proportionala cu concentratia inhibitorului, se impune ca la sterilizarea mediului sa se evite, pe cat posibil, degradarea acestuia, degradare care conduce la aparitia inhibitorilor. De asemenea, trebuiesc evitate toate reactiile chimice generatoare de inhibitori enzimatici in procesul de fermentatie.

Figura 2.38. Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice insotita de inhibitie competitiva dupa metoda Lineweaver-Burk. Determinarea constantelor scrie inversul ecuatiei (26): se face prin aplicarea metodei Lineweaver-Burk. In acest scop, se

(27)

Si se reprezinta grafic in coordonatele dreptei obtinute si din intersectia cu ordonata.

si

(figura), valorile constantelor calculandu-se din panta [1, p.155]

In cazul in care inhibitorul nu actioneaza competitiv, afinitatea enzimei pentru substrat sau inhibitor ramane neschimbata, indifferent daca enzima este libera sau fixa in complex. Reactiile care au loc in sistemul cu inhibitie necompetitiva sunt:

Pentru cazul in care

constantele de echilibru ale siste-mului (28) se

calculeaza cu expresiile urmatoare:

(29), (30),

(31), (32) in care : - concentratia complexului enzima-substrat-inhibitor. prin combinarea ecuatiilor anterioare se obtine concentratia

Admitandu-se ca complexului enzima-substrat:

(33) Iar ecuatia vitezei de formare a produsului devine:

(34) in care: = deoarece.

Din ecuatia (34) rezulta ca viteza de formare a produsului intr-un proces de fermentatie insotit de inhibitie necompetitiva este mai mica decat viteza procesului fara inhibitie (ecuatia Michaelis-Menten) si a procesului de fermentatie insotit de inhibitie competitiva (ecuatia 35). Aplicandu-se si acestei expresii metoda de liniarizare Lineweaver-Burk, se obtine ecuatia unei drepte:

(35)

Iar prin reprezentarea in coordonatele si constantelor cu ajutorul pantei si a intersectiei cu ordonata.

se obtine figura 2.39, care permite determinarea

Figura 2.39. Reprezentarea grafica a vitezei reactiei enzimatice insotita de inhibitie necompetitiva dupa metoda Lineweaver-Burk. Un alt model care descrie viteza de formare a produsului a fost elaborate de Luedeking si Piret. Conform acestui model, viteza de formare a produsului este functie de viteza de crestere a masei celulare. Studiind fermentatia lactica, autorii au stabilit urmatoarea ecuatie:

(36) in care: - coeficienti de crestere functie de pH

- viteza volumetrica de formare a produsului.

- viteza volumetrica de crestere a masei celulare. Aceasta ecuatie poate fi si in functie de viteza specifica de crestere a microorga-nismmelor, in acest caz devenind:

(37)

Posibilitatea aplicarii relatiilor (36) si (37) la diferite procese de fermentatie a fost cercetata de Humphrey si Reilly. In functie de legatura dintre formarea produsului si cresterea masei celulare, autorii deosebesc trei tipuri cinetice de fermentattii, stabilind ecuatiile corespunzatoare ale vitezei de reactie. Astfel, in tipul I, formarea produsului este independenta de viteza de crestere a biomasei, ecuatia vitezei de formare a produsului fiind:

(38) Tipul II corespunde formarii produsului in paralel cu cresterea masei celulare, iar ecuatia vitezei de formare a produsului devine:

(39) In cazul tipului III, viteza de elaborare a produsului este descrisa de ecuatia (36), la formarea sa participand atat masa celulara existenta, cat si cea care se dezvolta in timp. Shu a conceput un model mult mai general pentru viteza de formare a produsului functie de masa celulara. Conform acestui model, acumularea de produs pe unitate de masa celulara poate fi exprimata prin una sau mai multe functii exponentiale de forma:

(40)

(41)

(42) in care: A- coeficintul modelului de formare a produsului dupa Shu. q- constanta modelului de formare a produsului dupa Shu. Pentru a descrie acumularea produsului in cursul unei fermentatii, se combina acest model cu functia de distributie a varstei celulelor din biomasa. Daca domeniul de distri-butie a varstei celulare din fermentator este cuprins intre 0 si , atunci cantitatea de produs obtinuta din unitatea de masa celulara este:

(43) Iar concentratia celulelor cu varsta masei celulare din fermentator va fi: este reprezentata de o functie X( ), astfel incat concentratia totala a

(44) Daca se combina ecuatiile anterioare, se obtine expresia de calcul a concentratiei totale a produsului din lichidul de fermentatie:

(45) Constanta q si coeficientul A sunt determinate de caracteristicile microorganismului si ale modelului propus. La descrierea proceselor de fermentatie ale antibioticelor cu ecuatia (45), valoarea lui n este 3. aceasta ecuatie poate fi aplicata si proceselor continue de fermentatie. In functie de modelul de formare a produsului, au fost propuse diferite criterii de clasificare a proceselor de biosinteza. Astfel, Deindoerfer a realizat, pe baza datelor din literature, o clasificare cinetica, in functie de tipul reactiilor care desciu procesul: reactii simple, reactii simultane, reactii consecutive, reactii in trepte si reactii complexe. [1, p.159] In acest cadru, Gaden a clasificat procesele de fermentatie in functie de corelatia dintre formarea produsului si consumul substratului in trei tipuri (figura a ): a).formarea produsului este raportata direct la substratul utilizat (figura b );

b).formarea produsului este raportata indirect la substratul utilizat (figura c ); c).formarea produsului nu are aparent legatura cu substratul utilizat (figura d).

Figura 2.40.Tipuri de fermentatie dupa Gaden ( formarea produsului; substrat; crestere masa celulara).

consum de

Analizand diagramele din figura 2.40, se constata ca in tipul a de fermentatie produsul se formeaza in paralel cu cresterea microorganismelor, respectiv viteza de formare a produsului variaza liniar cu viteza de crestere a masei celulare pe parcursul fermentatiei. Tipul c indica faptul ca formarea produsului are loc dupa incetarea cresterii biomasei si consumul total al substratului (fermentatia penicilinelor, streptomicinei, tetraciclinei etc.). Tipul beste intermediar si se poate exemplifica prin fermentatia lactica. Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare Cinetica proceselor de biosinteza poate fi studiata si sub aspectul cresterii masei celulare functie de concentratia substratului. Astfel, Monod, analizand procesul de crestere bacteriana in corelatie cu variatia concentratiei unui singur substrat, a stabilit pentru faza de crestere logaritmica a masei celulare (figura 2.41) urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice:

(46) in care: - viteza specifica de crestere a masei celulare cand substratul este limitat:

- viteza maxima de crestere a masei celulare cand substratul nu este limitat: - constanta de saturatie. Dependenta dintre viteza specifica de crestere a masei celulare si concentratia substratului limitativ este redata in figura 2.41, din care se constata ca viteza specifica de crestere tinde asymptotic catre valoarea maxima.

Figura 2.41. Dependenta dintre viteza specifica de crestere si concentratia substratului limitative. Substratul limitative poate fi sursa de carbon si energie, un aminoacid essential, oxigenul, fosforul sau azotul anorganic. Tinand cont de faptul ca viteza specifica de crestere este definita prin relatia:

(47) Si combinand aceasta relatie cu expresia (46), se obtine ecuatia de crestere a masei celulare in functie de concentratia substratului limitative, :

(48) Relatia (48) este cunoscuta in literature de specialitate sub denumirea de ecuatia Monod. Teissier si Spicer au modificat ecuatia Monod, dandu-I urmatoarea forma:

(49) In functie de valoarea concentratiei substratului, se pot distinge urmatoarele situatii:

1.daca raportul si exista o relatie liniara:

are o valoare mica, atunci relatiile (48) si (49) sunt egale, ceea ce arata ca intre

2.la valori ridicate ale .

, viteza specifica de crestere,

, se apropie de valoarea maxima, [1, p.161]

Trebuie remarcat faptul ca ecuatia Monod este valabila numai in cazul in care cresterea este limitata de un singur substrat, ceea ce in conditiile industriale se intampla foarte rar. De obicei, in aceste procese intervine si un doilea substrat, care, de cele mai multe ori, este chiar oxigenul. In aceste conditii, vitezele specifice de crestere a masei celulare sunt descries prin ecuatia Monod modificata (50) sau prin ecuatia Monod-Cantois (51):

(50) si (51) in care: - concentratiile substraturilor limitative; - constantele de saturatie corespunzatoare substraturilor limitative; B- constanta Cantois. Pentru culture industriale continue, Monod a introdus o constanta caracteristica Y, denumita constanta de exploatare sau de crestere:

(52) Mark a aratat ca relatia (52) poate fi modificata functie de respiratia endogena, devenind:

(53) unde: a- factorul respiratiei endogene, - constanta reala de exploatare. Constanta de exploatare poate fi determinate cu ajutorul expresiei: .

(54) In functie de valorile constantelor cinetice microbiene discontinue. stabilite de Monod, se pot caracteriza cantitativ culturile

Totusi, in unele cazuri s-a observat ca valorile vitezelor de crestere calculate cu relatiile propuse de Monod se abat considerabil de la valorile obtinute experimental. Aceasta abatere evidentiaza faptul ca descrierea matematica a procesului de crestere a masei celulare trebuie sa cuprinda intregul ciclu de crestere, si nu doar faza de crestere exponentiala, ca in cazul ecuatiei Monod.pe baza acestei premise, Kono si Asai au impar-tit curba de crestere a microorganismelor in patru faze (figura2.42): I. faza de inductie faza de trecere I faza de crestere exponentiala IV. faza de scadere

Pentru fiecare faza, autorii au propus urmatoarele ecuatii pentru viteza de crestere a microorganismelor:

I.

(55)

I in care: - coeficientul Kono

IV.

- concentratia maxima a masei celulare - concentratia critica a masei celulare

Figura 2.42. Curba de crestere a microorganismelor dupa Kono si Asai. Formele integrate ale vitezelor de crestere a masei celulare, prezentate mai jos, redau concentratiile biomasei in fiecare etapa, iar prin insumare permit obtinerea valorii totale a concentratiei microorganismelor: I. (56)

(57) I (58)

IV. unde: - concentratia finala a microorganismelor; - durata de crestere a microorganismelor.

(59)

In faza de inductie =0, in faza exponentiala =1, iar in faza de trecere valoarea lui se modifica treptat de la 0 la1. Kono si Asai au demonstrate ca relatiile stabilite de ei ofera, in comparative cu relatiile Monod, o concordanta mult mai buna cu datele experimentale.

Modelele cinetice prezentate anterior sunt aplicabile in special pentru procese de fermentatie discontinua, in care cresterea microorganismelor are loc ca rezultat al conversiei fermentative a substraturilor nutritive. Din punct de vedere stoechiometric, procesul de crestere a biomasei prin utilizarea hidratilor de carbon, ca sursa de carbon si energie, poate fi reprezentat prin ecuatia: (60) Eficacitatea conversiei este caracterizata prin randamentul de utilizare a substratului pentru cresterea biomasei, , definit prin raportul dintre masa microbiana obtinuta, substanta uscata, si masa de hidrati de carbon

consumata:

(61) 0,07-0,10).

r- reprezentand fractia din masa celulara corespunzatoare cenusii (r

In mod curent,

se determina experimental prin masurarea masei celulare formate si a cantitatii de

substrat consumat intr-o anumita perioada de timp:

In functie de valoarea lui se poate selecta cel mai potrivit substrat pentru cresterea masei celulare, in scopul optimizarii si maximizarii performantelor proceselor biotehnologice. Performanta proceselor discontinue de crestere a biomasei microbiene este determinate de productivitatea volumetrica, definite prin cantitatea de produs obtinuta in unitatea de volum de lichid de fermentatie in unitate de timp. Durata procesului de fermentatie, , se refera nu numai la timpul efectiv cat dureaza fermentatia, ci include si timpii auxiliari, , pentru golirea si umplerea bioreactorului, pentru sterilizarea lui, pentru eventualele interventii mecanice. Durata totala a unui process discontinuu de fermentatie se poate calcula cu relatia urmatoare:

(63) Iar productivitatea, Pd , in aceste procese, cu exceptia:

(64) Ultima ecuatie evidentiaza faptul ca performanta proceselor discontinue este controlata de factori obiectivi si subiectivi, prin termenul referitor la timpii auxiliari, termen care poate fi influentat de conditiile tehnice si de gradul de specializare al personalului tehnic.

4.4 Aspecte termodinamice ale proceselor de fermentatie

Procesul de fermentatie se incadreaza, din punct de vedere termodinamic, in categoria sistemelor termodinamice deschise, sisteme specifice organismelor vii, caracterizate prin schimb de energie si de materie cu mediul inconjurator, pe care il transforma. Sistemelor deschise le este specific faptul ca ele nu sant in echilibru cu mediul lor. Organismele vii se afla, de obicei, intr-o stare stationara, care reprezinta conditia de baza a sistemelor deschise, si in care viteza transferului de materie si energie din mediu in sistem este compensata total de viteza transferului de materie si energie din sistem in afara lui.

Faptul ca celula este un sistem deschis, care nu se afla in echilibru cu mediul sau, un mecanism care capteaza energie libera din mediu, producandu-i simultan o crestere oarecare a gradului de dezordine, adica a entropiei, face parte din logica moleculara a starii v In plus, sistemele deschise aflate in stare stationara pot efectua un lucru, deoarece sant departe de conditia starii de echilibru. In starea stationara, viteza de producere a entropiei are o valoare minima, iar sistemul opereaza cu maximum de eficienta in conditiile date. Semnificatia acestei relatii a fost discutata pertinent, punandu-se in evidenta faptul ca viata este o continua lupta impotriva tendintei de a produce entropie. Sinteza unor molecule mari, bogate in informatii, formarea structurilor intracelulare, cresterea biomasei sant puternice forte antientropice. Insa, organismele vii, fiind obligate sa se supuna principiului al doilea al termodinamicii, si anume sa produca entropie, au ales calea de a produce entropie cu viteza minima, mentinandu-se astfel in stare stationara, stare in care reactiile din celulele vii decurg cu o viteza foarte mare. Ca urmare, studiul entalpiei capata o importanta deosebita. In acelasi context, trebuie subliniat faptul ca fluxul de energie ce trece printr-un sistem termodinamic deschis determina autoorganizarea acestuia, astfel incat viteza de producere a entropiei sa se mentina la valori minime. [1, p.127] De asemenea, microorganismelor le este caracteristica eficienta deosebita in prelucrarea energiei si materiei, eficienta care depaseste cu mult majoritatea masinilor cunoscute de omenire. Analiza aprofundata a acestor aspecte evidentiaza ca celulele vii functioneaza ca masini izoterme care absorb energia din mediul lor, energie pe care o transforma in energie chimica, folosita apoi pentru realizarea functiei chimice, de biosinteza a componentelor celulare, a functiei osmotice, necesara transportului de materiale in celula, si a functiei mecanice, de contractie si locomotie, toate acestea la temperatura constanta. Sursa de energie a sistemelor termodinamice deschise o reprezinta hidratii de carbon, lipidele, alcoolii, proteinele etc, care prin combustie chimica elibereaza o mare cantitate de energie. O parte din aceasta energie se elimina din sistem, iar o parte este inmagazinata de sistem in compusi organici macroenergetici, dintre care se remarca acidul adenozintrifosforic (ATP), compus care asigura, practic, rezerva energetica a celulei. Din structura ATP-ului, prezentata mai jos, rezulta ca legaturile dintre gruparile fosfat adiacente din ATP si ADP (acidul adenozindifosforic) sant legaturi de tip anhidrida, notate cu ~, in timp ce legatura dintre acidul fosforic si riboza din AMP (acidul adenozinmonofosforic) este o legatura esterica, notata cu linie dreapta. In acest context, trebuie subliniat faptul ca energia libera standard de hidroliza a legaturilor tip anhidrida este mult mai mare comparativ cu cea a legaturilor esterice. Desi ATP-ul contine doua legaturi macroenergice (~), in reactiile enzimatice intervine, de obicei, numai fosfatul terminal. De asemenea, este necesar de precizat ca ATP-ul nu este numai un rezervor de energie chimica, ci este In primul rand, un transmitator de energie chimica in celulele v Transportand energia sa la alte molecule, acest compus pierde gruparea fosfat terminala, trecand in ADP, care, la randul sau, poate accepta energie chimica si reface ATP-ul, primind o grupare fosfat.

Prin reunirea acestor observatii, ca si a multor altora, s-a constatat ca ATP-ul functioneaza ciclic ca transportor de energie chimica de la reactiile de ardere, care furnizeaza energia chimica, la diferitele procese celulare care necesita un consum energetic.(fig.2.43.).

Figura 2.43.Ciclul ATP ADP si modalitatile de utilizare a energiei eliberate de ATP S-a evidentiat experimental ca, indiferent de natura substratului limitativ considerat ca sursa de energie sau molecule combustibil (exceptiile fiind foarte rare), raportul dintre cantitatea in grame a celulelor microbiene obtinute in stare uscata si numarul de molecule de ATP sintetizate este aproximativ constant si are valoarea de 10,5. De asemenea, s-a demonstrat ca in procesul de cultivare a bacteriilor in conditii aerobe 605% din cantitatea de carbon din mediu este asimilata de celule si numai 405% este oxidat la CO2. Din punct de vedere energetic, circa 62% din energia libera de ardere a componentelor masei bacteriene, astfel incat Hc=22KJ/g s.u. (masa bacteriana). Daca substratul furnizor de energie este glucoza, care se consuma intr-un proces de fermentatie aerob prin catabolism, atunci se formeaza, conform reactiei de mai jos, 38 moli ATP, care pot inmagazina 1159 kJ din cei 2870 obtinuti prin combustia unui mol de glucoza: Glucoza + 6O2 6CO2 + 6H2O + 38 moli ATP Pentru alte sisteme de fermentatie sau alte substraturi utilizate, numarul de moli de ATP formati este diferit, dupa cum rezulta din tabelul 2.21: Tabel 2.21.Numarul de molecule de ATP formate in procesele de fermentatie aeroba si anaeroba cu diverse substraturi.

Substrat Glucoza

Conditii de fermentatie Aeroba (cu formare 3 de

Moli ATP/moli substrat 38

Anaeroba formiat+acetat)

Anaeroba (cu formare de etanol+CO 2 Piruvat Aeroba (cu formare 1 de 30

Anaeroba formiat+acetat)

Anaeroba (cu formare de etanol+CO 0

Palmitat (C16)

Aeroba

130

Moleculele de ATP si ADP fiind puternic ionizate, datorita faptului ca pH-ul lichidului intracelular are valoarea 7, formeaza in prezenta ionilor de Mg2+ (aflat in cantitate ridicata in lichidul intracelular) complecsi de tipul celui prezentat mai jos, complecsi care constituie, de altfel, chiar forma activa a ATP-ului:

Mg ATP2Pentru analiza termodinamica a sistemelor biochimice si a reactiilor pe care le induce ATP-ul, este necesar sa se precizeze cateva conventii, si anume: a) in sistem apos diluat in care apa apare ca produs sau reactant, activitatea sa termodinamica (sau concentratia) se stabileste arbitrar la valoarea 1, desi concentratia molara a apei este 55,5 M; [1, p.129] b) in energetica biochimica, starea de referinta este pH = 7,0 si nu pH = 0 (corespunzatoare unei concentratii de ioni de hidrogen de 1,0 M), cum se considera in termodinamica chimica; c) variatia energiei libere standard la pH = 7,0 si 25C se noteaza cu Go iar cea de la pH = 0 cu Go d) deoarece la pH = 7,0 starea standard este un amestec de forme ionizate si neionizate, rezulta ca valorile lui G depind de valoarea pH-ului, care influenteaza direct raportul dintre formele ionizate si neionizate ale reactantilor sau produsilor de reactie.
o

Variatia energiei libere standard in sistemele biochimice poate fi determinata fie prin utilizarea datelor de echilibru ale reactiilor care au loc sub influenta diverselor sisteme enzimatice, fie din energiile standard de formare ale reactantilor si produselor acelor react Ultima cale este mult mai accesibila, deoarece literatura ofera, in general, date pentru energiile libere standard de formare ale principalilor compusi organici in solutii apoase cu concentratia lM la pH = 7,0 si 25C, precum si pentru energiile libere standard ale unor reactii biochimice in medii apoase. In aceste conditii, variatia energiei libere standard la pH = 7,0 si 25C poate fi calculata, cu suficienta precizie, din energiile libere standard de formare ale produselor si reactanti1or, cu ajutorul ecuatiei: Go = Gof
produsi

- Go f reactanti

(1)

In acelasi timp, Go, poate fi calculata si din constantele de echilibru K' ale reactiilor biochimice desfasurate la pH = 7,0 si 25C , folosind relatia: Go =-2,303 RT ln K (2)

Dupa cum s-a mentionat mai sus, ATP-ul prin hidroliza trece in ADP, eliberand energia necesara biosintezei masei microbiene si a produselor utile. Pentru determinarea reala a marimii G oATP se tine seama de faptul ca hidroliza enzimatica a A TP-ulul se realizeaza printr-o succesiune de reactii catalizate de hexachinaza sau glutaminsintetaza, precum si de natura aditiva a lui Go, pentru reactiile care decurg succesiv.

Astfel, in prezenta hexachinazei, hidroliza ATP-ului se realizeaza prin urmatoarele reactii succesive: hexachinaza 1) ATP + glucoza pentru care K' = 661 si Go= -16,72 kJ/mol glucozo-fosfataza 2) glucozo-6-fosfat + H2O pentru care K' = 171 si Go= -13,79 kJ/mol care prin insumare duc la : ATP + H2O ADP + Fosfat glucoza + fosfat ADP + glucozo-6-fosfat

Deoarece valorile Go pentru cele doua reactii sunt aditive, energia libera standard pentru hidroliza ATP la ADP va fi: Similar, s-a determinat energia de hidroliza a ADP la AMP(G oADP=-30,53kJ/mol) si AMP la adenozina si acid fosforic (GoAMP = -14,2 kJ/mol), confirmandu-se faptul ca legatura esterica din AMP are energia libera standard de hidroliza mult mai mica comparativ cu legatura tip anhidrida din ATP si ADP. Valorile evidentiaza transferul simplu de energie pe care il realizeaza ATP-ul. Dar ATP-ul poate juca si rol de stocare sau conservare a energiei care se degaja in reactiile biochimice de oxidare, ca in exemplul urmator: Glicerida-3-fosfat + NAD+ + H2O Go 1 = -43 kJ/mol ADP + Pi ATP + H2O 3-Fosfoglicerat + NADH+ + H+

Go2 = 30,5 kJ/mol iar prin insumare se obtine: Glicerida-3-fosfat + NAD+ + ADP + Pi 3-Fosfoglicerat + NADH + H++ATP

Go total = -12,5 kJ/mol, sau sursa de energie pentru realizarea unor reactii chimice, precum aminarea acidului glutamic: acid glutamic + NH3 glutamina + H2O

Go 1 = 14,2 kJ/mol ATP + H2O ADP + Pi

Go2 = -30,5 kJ/mol iar prin insumare se obtine: acid glutamic + NH3 +ATP G o total = -16,3 kJ/mol, Pentru aceasta ultima reactie, mecanismul detaliat este: glutamina + ADP+ Pi

acid glutamic + ATP glutamilfosfat + NH3 Procesul total fiind descris de reactia globala: acid glutamic + NH3 +ATP

glutamilfosfat + ADP glutamina + Pi ,

glutamina + ADP+ Pi

Energia libera schimbata in reactiile biochimice poate fi utilizata ca indicator al eficientei lucrului chimic sau al randamentului de utilizare a energiei sistemului in reactiile biochimice. Astfel, tinand seama ca energia libera de formare a ATP-ului este de -30,5 kJ/mol, eficienta stocarii in ATP a energiei rezultate la oxidare este de 71 %: E = 30,5 x 100 =71% , 43 iar utilizarea energiei continute (aduse) de A TP la formarea glutaminei este: E= 14,1x100 = 46,55% 47% 30,5 In acest mod se poate calcula eficienta utilizarii energiei rezultate in reactiile oxidative din procesele biochimice. De exemplu, in cazul fermentatiei alcoolice, reactia teoretica este: C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2

G o = -236,17 kJ/mol In realitate, reactiile biochimice care au loc in celule pot fi descrise prin reactia globala: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2 C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP

G o = -175,14 kJ/mol E= 2 x 30,5 x 100 = 25,84% 26% 236,15 In procesele de fermentatie aeroba, la arderea totala a glucozei, reactia teoretica este: C6H12O6 + O2 6CO2 + 6H2O (respiratie)

G o = -2867,5 kJ/mol C6H12O6 + O2 + 38ADP + 38Pi G o = -1822 kJ/mol E= 38 x 30,5 x 100 = 40,4% 41% 22867,5 Intr-o fermentatie lactica a glucozei, reactia decurge teoretic conform reactiei: C6H12O6 2 acid lactic 6CO2 + 44H2O + 38ATP

G o = -196,5 kJ/mol

In celula, reactia decurge, insa, dupa modelul urmator: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2 lactat + 2H2O + 2ATP

G o = -135,4 kJ/mol, fapt care evidentiaza ca numai 61 kJ din energia degajata pentru un mol de glucoza consumata este conservata prin formarea a celor 2 moli ATP, iar eficacitatea E are valoarea : E= 2 x 30,5 x 100 = 31% 196,5 Aceste diferente ale valorificarii eficacitatii utilizarii energiei degajate la oxidarea glucozei pentru a explica de ce performantele procesului de fermentatie aeroba sunt dependente de eficacitatea aerar Valoarea energiei libere standard de hidroliza a ATP este influentata de o serie de factori, printre care pH-ul mediului, concentratia ionilor de Mg2+si determinate de exponentul de aciditate si energia libera standard de ionizare a acizilor existenti in mediu. Energia libera standard de hidroliza a ATP, ADP, AMP este afectata de valoarea pH-ului, fenomen redat in figura pentru ATP, ceea ce explica diferentele dintre pK-urile ionizarilor ATP, ADP si a fosfatului: HATP3HADP2H2PO ATP4- + H+ ADP3- + H+ HPO42 - + H+ pK'l = 6,95 pK'2 = 6,88 pK'3 = 7,20

De asemenea, trebuie remarcat faptul ca la hidroliza HATp3- la pH = 7 si 25C se formeaza numai HADP 2- + H2P04-. La valori ale pH-ului mai ridicate decat 7, cea mai mare parte din ATP se gaseste in forma ATP 4-, care la hidroliza conduce la ADP3- si HPO42-, conform reactiei: ATP4- + H2O ADP3- + HPO42- + H+

pentru care G o = 5,4 kJ/mol si H o = -19,7 kJ/mol (la 25C si taria ionica 0,25).

Figura 2.44.Variatia energiei libere de hidroliza a ATP-ului in functie de pH-ul mediului. Constanta de echilibru a reactiei de mai sus este dependenta de temperatura si poate fi calculata, in functie de concentratie, cu relatia: (3)

Daca in reactia de hidroliza a ATP4- se elibereaza numai un proton, atunci energia libera de hidroliza a ATP, dependenta de temperatura, se determina cu ajutorul expresiei: G = G o -5,708 pH , kJ/mol (la 250C) (4)

Relatia clasica G' = -RT ln K' nu se poate aplica pentru calculul valorii energiei libere de hidroliza a ATP-ului, deoarece in relatia de definitie a constantei de echilibru K' (3) nu intervine concentratia protonilor, marime dependenta de valoarea pH-ului. Din aceste motive, literatura recomanda deseori utilizarea altor conditii standard, in care constanta de echilibru K' se substituie cu constanta de echilibru observata (Kobs) care se exprima in functie de concentratia totala a tuturor formelor ionice ale componentelor participante la reactie, la un pH oarecare:

(5) Variatia energiei libere Gobs poate fi corelata cu G' utilizandu-se dependenta dintre constantele de echilibru Kobs si K'. Pentru hidroliza ATP-ului in intervalul de pH = 2 - 8, constanta de echilibru Kobs poate fi calculata cu relatia:

(7) in care: KHATP3-, KHADP2-, etc. - constantele succesive de disociere a ATP,ADP si H3P04. Aceste relatii permit determinarea energiei schimbate in reactia de hidroliza a ATP in alte conditii decat cele standard pentru sistemele biologice. Pentru valori diferite de 25C, aceasta energie variaza si in functie de temperatura. In acest caz este obligatorie cunoasterea entalpiei reactiei de hidroliza a ATP-ului (HATP). Ecuatia care permite determinarea marimii Go la diferite temperaturi are forma:

(8) in care Go 1 si Go 2 corespund temperaturilor T1 si T2. De asemenea, trebuie subliniat faptul ca ATP, ADP si H 3P04 formeaza complecsi cu ionii metalici aflati in celula, in mod deosebit cu Mg2+, dar si cu Ca2+, Mn2+ sau chiar cu K+, care modifica valorile energiei libere schimbate in reactiile ATP-ului. Concentratia ionilor Mg2+ modifica valoarea G0'ATPdeoarece Mg2+ formeaza complecsi cu toate formele ionice prezente: Mg2+ + ATP4Mg2+ + ADP3Mg2+ + HPO42Mg2+ + HATP3Mg2+ + HADP2Mg2+ + H2PO4MgATP2MgADPMgHPO4 MgHATPMgHADP Mg(H2PO4)2

Deoarece afinitatea Mg2+ fata de cei sase atomi este diferita si dependenta de pH, rezulta ca efectul pH-ului si al concentratiei ionului Mg2+asupra GoATP este foarte complex. Cu toate acestea, valorile calculate in literatura au permis trasarea grafica a dependentei marimii GoATP in functie de concentratia ionilor Mg2+, la pH = 7 (figura ), precum si functie de valoarea pH-ului (in intervalul de pH = 4 - 10) la diverse valori ale concentratiei ionilor Mg2+ (figura 2.45.).

Figura 2.45.Efectul concentratiei ionilor Mg2+ asupra energiei libere de hidroliza a ATP (pH=7). Valorile Go ale reactiilor chimice de hidroliza a ATP sunt calculate in conditii standard, admitandu-se ca toti reactantii si produsii au concentratia 1M, conditii care nu se intalnesc in celulele intacte. Este foarte posibil, insa, ca o reactie care are Go, negativ sa se desfasoare in celula spre stanga si nu spre dreapta (ca in sistemele termodinamice inchise), daca concentratiile reactantilor sant foarte mici, iar a produsilor ridicate. Acest fenomen se produce atunci cand reactantul se consuma rapid si in alte reactii biochimice care au loc in celula. [1, p.143]

Figura 2.46.Dependenta energiei libere Go obs de hidroliza a ATP functie de pH si concentratia ionilor Mg2+. In concluzie, o analiza termodinamica pertinenta a reactiilor metabolice impune cunoasterea concentratiilor intracelulare reale ale metabolitilor, precum si vitezele lor de formare si utilizare. In acest sens, se poate sublinia ca viteza de formare a ATP-ului in celule este determinata de viteza de utilizare a ATP-ului in cadrul unei stari stationare dinamice. Cunoscandu-se numarul de molecule de ATP sintetizate, functie de cantitatea de hidrati de carbon consumata, se poate determina, suficient de exact, performanta procesului de biosinteza.

5 Bilantul de materiale

Productivitatea tulpinei :

- temperatura de fermentatie la temperatura de fermentatie

1. Pregatirea mediului de cultura

Nr. Materiale ctr. intrate

Kg/s

Materiale iesite

Kg/s

1. Extract porumb 1121,22 2. Lactoza 3. Glucoza 4. Faina de soia 5. CaCO3 6. KH2PO4 7. NH4NO3 8. Na2SO4 9. ZnSO4 10. MnSO4 2699,23 1083,16 124,58 498.32 207,63 124,58 24,91 0,83 0,83

2,7 6.5 2,5 0,3 1,2 0,5 0,3 0,06 0,002 0,002 0,4 0,8 84,73

Extract porumb 427,1307 Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 MnSO4 Ac. Fenilacetic Na2S2O3 Apa Total 1107,7359 474,589 47,4589 205,65 94,9179 47,4589 9,4917 0,3163 0,3163 63,2789 126,5572 13215,1146 41526,68

2,7 7 3 0,3 1,3 0,6 0,3 0,6 0,002 0,002 0,4 0,8 83,54

11. Ac. fenoxiacetic 166,1 12. Na2S2O3 13. Apa Total 332,21 35188,08 41526,68

O parte din componentii mediului de cultura la sterilizare se degradeaza. De aceea urmatorii compusi se iau in exces fata de cantitatea xcalculata in etapa 1:extract de porumb,lactoza ,glucoza, faina de soia.

2. Sterilizarea

Nr. Materiale ctr. intrate

Kg/s

Materiale iesite

Kg/s

1. Extract porumb 1233,34 2. Lactoza 3. Glucoza 4. Faina de soia 5. CaCO3 6. KH2PO4 7. NH4NO3 8. Na2SO4 9. ZnSO4 10. MnSO4 2969,15 1141,98 137,03 498.32 207,63 124,58 24,91 0,83 0,83

2,7 6.5 2,5 0,3 1,2 0,5 0,3 0,06 0,002 0,002 0,4 0,8 84,73

Extract porumb 427,1307 Lactoza Glucoza Faina de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 MnSO4 Ac. Fenilacetic Na2S2O3 Apa Total 1107,7359 474,589 47,4589 205,65 94,9179 47,4589 9,4917 0,3163 0,3163 63,2789 126,5572 13215,1146 41526,68

2,7 7 3 0,3 1,3 0,6 0,3 0,6 0,002 0,002 0,4 0,8 83,54

11. Ac. fenoxiacetic 166,1 12. Na2S2O3 13. Apa Total 332,21 35188,08 41526,68

3.Fermentatia
Calculul necesarului de aer

timpul de fermentatie =140 h=8400 min

Calculul apei evaporate

Calculul biomasei

Nr.crt. Materiale intrate 1. 2. 3. Mediu de cultura Inocul maer

Kg/s 37374,01 4152,66 454227,31

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5.

Materiale iesite Biomasa Lichid de fermentatie H2O evaporata maer

P.V

Kg/s 4166 32818,4 4542,77 454227,31 847,918

Total
4.Filtrarea

495753,98

Total

495753,98

Umiditatea precipitatului este 20%.

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. Biomasa Lichid de fermentatie 3. PV 4166 32818,4 847,918

Nr.crt. 1. 2. 3.

Materiale iesite Precipitat Filtrat P.V

Kg/s 5207,5 31776,9 678,33

Total
5. Extractia

36984,4

Total

36984,4

H2SO4 100%= 89,35+0,0406 = 89,39

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. 3. 4. Filtrat PV AcOBu H2SO4 31776,9 678,33 10592,3 2234,76

Nr.crt. 1. 2. 3.

Materiale iesite Extract PV Rafinat

Kg/s 10592,95 637,63 33651

Total
6.Reextractia

44603,96

Total

44603,96

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. Extract P.V. 10952,95 637,63

Nr.crt. 1. 2. 3.

Materiale iesite Solvent P.V. Sol carbonat

Kg/s 10167,234 573,87 2168,824

K2CO3(sol.10%) 1383,113

Total
7. Cristalizare

12336,063

Total

12336,058

100kg HCl.80kgH2O 329,2432kgHCl..mH2O

mH2O=263,3945kg H2O din solutia de HCl

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. Sol. carbonat Sol. HCl 329,243 2168,824

Nr.crt. 1.

Materiale iesite P.V. precip Ape acide

Kg/s 516,48 1981,587

2.

Total

2498,067

Total

2498,067

8. Filtrare/spalare
Butanolul si cloroformul reprezinta 20% din cantitatea de P.V.precipitata:

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. 3. 4. P.V.pp Ape acide Butanol Cloroform 516,48 1981,587 51,648 51,648

Nr.crt. 1. 2. 3. 4. 5.

Materiale iesite Precipitat (P.V.) Filtrat apos Butanol 1 Cloroform 1 Total

Kg/s 613,32 (490,656) 1884,747 51,648 51,648 2601,363

Total

2601,363

9. Uscarea

mcloroform evapor t =0,2 x mpp + mPV pierduta mPvpierduta = 0,02 x 490,656=9,813 mcloroform evaporat = 0,2 x 613,32 + 9,813 = 132,477

Nr.crt. Materiale intrate Kg/s 1. 2. Precipitat (P.V) 613,32 490,656

Nr.crt. 1. 2. 3.

Materiale iesite PV CHCl3 evap

Kg/s 480,842 132,477

Total
Bilant termic

613,32

Total

613,32

Bilant termic pentru etapa de fermentatie Procesul de fermentatie este un proces exoterm,mentinerea temperaturii constante a mediului realizandu-se prin preluarea caldurii de catre apa racita.Pentru calculul debitului necesar de agent termic,se intocmeste bilantul termic total pentru bioreactorul discontinuu,corespunzator perioadei de degajare maxima a caldurii:

in care:

- caldura degajata de reactia biochimica; - aportul termic al agentului termic; - caldura generata de agitarea mecanica sau pneumatica; - caldura introdusa in sistem de aerul barbotat; - aportul termic al efluentului; - aportul termic al bioreactorului; - caldura acumulata; - caldura preluata de agentul termic; - caldura preluata prin evaporarea apei din mediul de cultura; - caldura preluata de gazul care paraseste bioreactorul; - caldura preluata de efluent;

- caldura preluata de bioreactor; - pierderi de caldura in exterior. Mentinearea unui regim izoterm de functionare a bioreactorului necesita evident,ca valoarea caldurii acumulate sa fie 0.Ecuatia generala a bilantului termic se poate simplifica,in functie de particularitatile procesului biochimic, astfel: [1, p.377] - daca temperatura bioreactorului este aceeasi la inceputul si la sfarsitul procesului de biosinteza - proces discontinuu - in cazul in care compozitia aerului la iesire din bioreactor nu se modifica semnificativ fata de intrare,iar aerul intra si paraseste bioreactorul la temperature de lucru

Astfel,caldura schimata cu agentul termic(caldura utila) va fi:

se calculeaza P.Chrysogenum.Astfel:

cu

ajutorul

vitezei

specifice

de

utilizare

oxigenului

de

catre

tulpina

de

Se considera ca aportul agitarii mecanice la amestecarea madiului este determinant:

unde:

- factor de putere(0,3

0,4 valori mai mari pentru volume mai mici sau

vascozitata mai mari); , f=factor de corectie = 0,3

d - diametrul agitatorului, se calculeaza cu ajutorul rapoartelor geometrice specifice fiecarui sistem de agitare. Diametrul agitatorului bioreactorului, D, se determina din volumul geometric al bioreactorului pentru un coeficient de umplere ;

- densitatea lichidului de fermentatie,

; se admite

Kg/m

Caldura pierduta prin evaporarea apei se calculeaza cu relatia:

unde:

- debitul masic de are barbotat,Kg/s; , Pg = 0,901 Kg/s - caldura latenta de vaporizare a apei, KJ/Kg; la temp de 260 C - umiditatea preluata de aer; = 0,01 Kg apa/Kg aer uscat

Pierderile de caldura se admit intre 3

5% din caldura utila:

Capitolul 3. Controlul fabricatiei

3.1. Controlul, reglarea si automatizarea procesului tehnologic

3.1.1. Automatizarea pompelor

Reglarea automata a pompelor se reduce in cele mai multe cazuri la mentinerea la valoare constanta a debitului de refulare.

Reglarea debitului la pompe centrifuge. Caracteristica principala a reglarii pompelor centrifuge este faptul ca, datorita constructiei lor, care face practic independenta presiunea la refulare de debit, ventilul de reglare se aplica pe conducta de refulare. [15, p.66] In figura 4.1 este reprezentata schema de reglare a debitului pompei centrifuge P , antrenata de un motor electric M. Regulatorul R este un regulator de presiune diferentiala cu caracteristica PI.

Figura.4.1.

Figura.4.2.

In figura 4.2 se reprezinta schema de reglare a debitului pompei centrifuge P, antrenata cu o turbine de abur T. Spre deosebire de cazul precedent, ventilul de reglare este plasat pe conducta de alimentare cu abur a turbinei. Reglarea debitului pompelor cu roti dintate Prin constructia lor, pompele cu roti dintate nu pot fi reglate prin strangularea refularii, datorita cresterii excessive a presiunii, care duce rapid la deteriorari.reglarea debitului refulat in instalatia tehnologica se realizeaza prin reglarea unui debit de recirculare pe o conducta de ocolire (fig.nr.4.3). Elementele de sesizare, comanda si executie sunt cele din exemplele precedente. La cresterea debitului refulat, regulatorul comanda cresterea debitului recirculat, iar scaderea debitului principal, actiunea de reglare face sa scada debitul recirculat.

Figura.4.3.

3.1.2. Reglarea automata a nivelului

Schemele de reglare a nivelului, precum si tipul de regulator utilizat, depend de:

1. obiectivul urmarit prin reglarea automata: a)pentru mentinerea, cu precizie ridicata, a unui nivel constant (in reactoare, tamburele cazanelor de abur, s.a.) se va folosi un regulator PI; [15, p.61] b)pentru reglarea nivelului in limite largi (vase tampon, rezervoare de depozitare, rezervoare de decantare din instalatiile de tratare a apelor uzate) se utilizeaza regulatoare P, montate ca in fig.nr.4.4. ;

Figura.4.4. Aici, nivelul va fi mentinut intre limitele date de pozitiile A si B;in aceste cazuri, mai importanta decat stabilizarea nivelului este stabilizarea debitului de iesire din rezervoare; 2. marimea manipulata disponibila: debitul fluxului de intrare,Fi,sau debitul fluxului de iesire, Fe,din rezervor. Alegerea variabilei manipulate este dictate de pozitia rezervorului in schema tehnologica din care face parte.Astfel, daca principala perturbatie apare pe calea de evacuare a lichidului (rezervor intermediar care alimenteaza alte utilaje), ventilul de reglare se plaseaza pe conducta de intrare (fig.nr.4.5) si invers, daca variatia debitului de intrare este perturbatia majora (rezervoare de depozitare, rezervoare tampon in coloane de distilare, reactoare cu amestec) variabila manipulate va fi debitul de evacuare (fig.nr.4.6).

Figura.4.5.

Figura.4.6.

La scaderea nivelului sub valoarea de referinta, de pilda, regulatorul va comanda deschiderea, in plus, a ventilului de reglare (fig.nr.4.5) sau inchiderea lui (fig.nr.4.6) pana la anularea abater 3.presiunea din rezervor. In cazul unui rezervor inchis, cu sectiune transversala mare si cu suprapresiune depasind considerabil presiunea hidrostatica, variatii ale suprapresiunii vor induce abateri relative mici ale nivelului dar modificari inseminate ale debitului de iesire.

Figura.4.7.

Pentru aceste situatii se recomanda reglarea nivelului cu SRA evaluate, in cascada si nivel-debit ca in figura.4.7. Daca perturbatia este modificarea debitului Fi, atunci abaterea nivelului este eliminata prin actiunea cascadei nivel-debit daca perturbatia este variatia suprapresiunii, atunci bucla de debit reactioneaza rapid, modificand debitul Fe, inainte ca perturbatia sa provoace abateri semnificative ale nivelului; 4. tipul de proces-cu autostabilizare (rezervoare deschise cu evacuare libera sub influenta presiunii hidrostatice) sau fara autostabilizare (rezervoare cu evacuare fortata asigurata de o pompa cu debit constant sau sau rezervoare inchise cu suprapresiune) nu modifica schemele de reglare si este luat in considerare doar la alegerea regulatorului si la acordarea acestuia.

3.1.3.Reglarea automata a temperaturii

In procesele din industria chimica, caldura este transferata prin radiatie, prin amestecarea fluidelor reci si calde sau, cel mai frecvent, prin conductie prin peretii utilajelor. Variabila manipulata este, de regula, debitul de agent termic. [15, p.75]

Pentru schimbatoarele de caldura montate orizontal se recomanda plasarea ventilului de reglare pe conducta de alimentare cu abur (figura.4.8.), iar pentru cele montate vertical, pe conducta de evacuare a condensului (figura.4.9.). In primul caz, (figura.4.8.) la o micsorare a temperaturii lichidului incalzit, sub valoarea de referinta, regulatorul comanda cresterea debitului de abur.Aceasta crestere conduce la ridicarea rapida a presiunii in spatial de abur si, ca urmare, la o marire a temperaturii de condensare si la un transfer de caldura mai intens catre lichidul tehnologic. In al doilea caz (figura.4.9.), daca temperature lichidului incalzit depaseste referinta, regulatorul comanda inchiderea partiala a ventilului de reglare de pe conducta de condens.In consecinta, creste nivelul condensului, acesta acoperind o suprafata mai mare a tuburilor incalzitoare.

Figura.4.8.

Figura.4.9.

Deoarece timpul de retentie a condensului este apreciabil, raspunsul sistemului de reglare este mai lent decat al celui din primul caz. Daca reglarea automata a temperaturii trebuie realizata rapid si schimbatorul de caldura este supradimensionat, se recomanda utilizarea schemei din figura.4.10. Aici 10% pana la 30% din fluxul de lichid tehnologic este trimis pe o cale ocolitoare si amestecat, la iesire, cu lichidul incalzit.

Figura.4.10. Pentru stabilizarea temperaturii in vaporizatoare se foloseste o schema de reglare in cascada: temperatura (bucla supraordonata)-debit (bucla subordonata) ca in figura.4.11.Bucla de debit stabilizeaza debitul de abur (la valoarea de referinta data de regulatorul de temperatura) inainte ca abaterea acestui debit (ca perturbatie pentru vaporizator) sa influenteze temperature care este parametrul reglat principal.

Figura .4.11. Sisteme de reglare evoluata (mai ales in cascada) sunt curent utilizate si pentru stabilizarea temperaturii in reactoare chimice.

3.1.4.Reglarea automata a concentratiei

Reglarea automata a concentratiei in reactoare este realizata de cele mai multe ori indirect, stabilizand direct alti parametri care influenteaza desfasurarea procesului de reactie: temperature, debitele de reactanti, timpii de stationare in reactor, etc.Deseori nici nu este nevoie de o reglare a concentratiei in reactor deoarece se urmareste obtinerea conversiei maxime posibile. [15, p.81] Reglarea automata directa a concentratiei este justificata in cazurile in care viteza de reactie fluctueaza, datorita modificarii activitatii catalizatorului, a temperaturii sau a puritatii fluxurilor de alimentare si abaterile concentratiei produsului au efecte economice semnificative.De exemplu, concentratia unui produs poate trece printr-un maximum dupa care, cresterea conversiei reactantilor duce la descompunerea acestuia intr-o serie de produse secundare.In acest caz, reactorul trebuie automatizat avand ca scop obtinerea unei concentratii optime a produsului care, in mod obisnuit, poate fi mai mica decat valoarea maxima. Utilizarea schemelor de reglare bazate pe masurarea automata a concentratiei este, inca, putin practicata deoarece:

 Analizoarele automate au, de regula, un domeniu limitat de aplicare; ele pot analiza numai concentratia intr-un anumit component pe cand aparatele care masoara temperature, debite, presiuni, etc, functioneaza indifferent de natura mediului masurat; Analizoarele introduc in bucla de reglare intarzieri mari de transport (timpi necesari pentru prelevarea probei, analiza ei si comunicarea rezultatului), chiar daca sunt montate in flux si nelinearitati; De regula, analizoarele sunt aparate putin robuste cu fiabilitate redusa si intretinere pretentioasa. Se prefera reglarea concentratiei masurand alti parametric care descriu, cu aproximatie, compozitia sau gradul de conversie: densitatea, indicele de refractie, vascozitatea, etc. Mai des intalnim reglarea concentratiei amestecurilor de lichide sau de gaze.Dam in figura.4.12 schema stabilizarii concentratiei solutiei la iesirea dintr-un amestecator de lichide si in figura.4.13 schema reglarii concentratiei produsului unui amestecator de gaze.

Figura.4.12 In figura.4.12 masurarea concentratiei se realizeaza cu un analizor ca aparat de masura pe ramura de reactie a buclei 1, montat in flux pe o cale ocolitoare variabila manipulata este debitul de concentrate la intrarea in amestecator.

Figura.4.13 In figura.4.13 se foloseste drept aparat de masura un analizor de compozitie a amestecurilor de gaze analizor specific tipurilor de componente care se amesteca montat, deasemenea, pe o derivatie a conductei de iesire a produsului; variabila manipulate in bucla I este debitul unuia dintre componenti (gaz A). In ambele situatii, stabilizarea concentratiei este usurata adaugand, la buclele I, circuite de stabilizare ale debitelor componentelor care nu sunt marimi de executie (diluant, respective gaz B, buclele II); in acest fel se elimina fluctuatiile de debit ale acestor componente, fluctuatii care se manifesta ca perturbatii pentru sistem.

3.1.5.Reglarea automata a pH-ului

Pentru obtinerea pH-ului dorit al unei solutii se recurge la adaugarea, in aceasta, ca medii de reglare, a unor reactivi sub forma altor solutii de acizi sau baze, substante pulverizante (CaCO 3, CaO etc), substante gazoase (CO2, SO2, NH3 )sau a unor solutii tamponsau agenti de precipitare. [15,p.84] Sistemele de reglare pentru pH pot fi impartite in 2 categorii, dupa scopul urmarit: 1. reglarea pH-ului este o actiune suplimentara, avand scop realizarea unei conditii necesare pentru buna desfasurare a procesului; un exemplu bun il constituie procesul de fermentatie discontinuu unde, datorita unui timp indelungat de stationare a masei de reactie in reactor si a consumului lent de reactive adaugat pentru stabilizarea pHului, reglarea este destul de usor de indeplinit si un regulator simplu, bipozitional, da satisfactie. 2. stabilizarea pH-ului in reactoarele de neutralizare in care se amesteca solutia principala cu un reactive, cu scopul de a se realize un anumit pH; exemplul cel mai des intalnit este cel al tratarii continue al unor solutii sau al neutralizarii produselor reziduale. Reglarea automata a pH-ului este afectata de o serie de dificultati specifice, dintre care remarcam: 1. spre deosebire de reglarea altor parametric (nivel, debit, presiune, etc), unde se foloseste un singur mediu de reglare, in cazul stabilizarii pH-ului la o anumita valoare vor fi necesare, uneori, 2 medii de reglare diferite ; este cazul, de pilda, al neutralizarii unor ape reziduale, al caror pH se poate abate in ambele sensuri, in raport cu valoarea prescrisa care, de regula, este 6-7; o atare situatie poate fi rezolvata adaugand fie reactive acid, fie reactive basic in functie de sensul in care se abate, initial, pH-ul. 2. precizia cu care se poate regal pH-ul este dependenta de valoarea de referinta (figura.4.14), de faptul daca mediul reglat este puternic sau slab acid sau basic (fig.nr.4.14), de valoarea abaterii primare si, bineinteles, de precizia cu care se adauga reactivul de neutralizare, in cm3 [reactiv/l solutie], la aceeasi valoare prescrisa. Pentru a ne explica aceasta comportare, sa plecam de la forma tipica, neliniara, a curbelor de titrare care are aspectul unui S. In figura.4.14 observam ca, datorita acestui aspect, cu cat este mai departata de valoarea pH=7, cu atat creste precizia de reglare; astfel, daca referinta este (pH)r1 (punctual 1), plasata in apropierea punctului de echivalenta, la o imprecizie de adaugare a reactivului de +/-(V), abaterea valorii reglate de la cea de referinta este evident mai mare decat abaterea corespunzatoare referintei (pH)r2 (punctual 2), pentru aceeasi imprecizie de adaugare a reactivului.

Figura 4.14. 3. existenta, in bucla, a unor intarzieri (timp mort si intarzieri de capacitate) apreciabile.

Intarzierea pura este data, in principal, de timpul necesar transmiterii semnalului de la punctual de adaugare a reactivului de neutralizare (punctual A) pana la punctul de masurare (punctual B ). Apropierea celor 2 puncte, ca in schema de reglare din figura.4.15, in scopul reducerii timpului mort, este limitata de necesitatea de a asigura un timp de reactie suficient de lung.

Figura 4.15 Intarzierea de capacitate este introdusa atat de traductorul de pH cat, mai ales, de capacitatea rezervorului tampon de amestec, impus de acea necessitate de a asigura timpul de reactie, ca in schema de reglare din figura.4.16.

Figura.4.16. Daca timpul de reactie este tr [s] atunci volumul rezervorului tampon, Vr [m3], se calculeaza cu relatia : Vr=F tr unde : F[m3/s] - este debitul de solutie ce intra in vas. Marind volumul vasului tampon atenuam oscilatiile pH-ului solutiei reglate, avand ca rezultat cresterea preciziei de reglare; in acelasi timp, insa, creste intarzierea de capacitate introdusa de rezervor in bucla de reglare, ceea ce mareste dificultatea reglarii; O calitate buna a reglarii pH-ului este conditionata de o buna amestecare a solutiei cu reactivul de neutralizare si, in fine, de o curatire periodica a electrodului de masura a pH-ului. Schema de reglare din figura.4.17. este utilezabila, indeosebi, in situatiile in care debitul solutiei al carei pH trebuie stabilizat este constant si reactia de neutralizare este rapida. Daca reactia de neutralizare este lenta si este insotita de variatii mari de debit ale mediului reglat se utilizeaza schema de reglare in cascada din figura.57.

Ambele regulatoare ale cascadeisunt regulatoare de pH; cel din bucla supraordonata, pHC-1, care este informat asupra valorii masurate la punctual final, B, furnizeaza referinta celui din bucla subordonata, pHC-2, care stabilizeaza pH-ul in punctual A, imediat dupa iesirea din vasul tampon.

Figura .4.17. Pentru cazuri mai dificile, cum sunt cele intalnite in neutralizarea apelor reziduale al caror pH se poate abate in ambele sensuri, ceea ce impune utilizarea a 2 medii de reglare diferite se poate folosi schema de reglare din figura.4.18, o combinatie de reglare in cascada cu o reglare cu divizrea comenz Regulatorul supraordonat pHC-1, informat asupra pH-ului in punctual final B, comanda debitul de reactiv bazic, ca variabila manipulata si, in acelasi timp, furnizeaza referinta pentru regulatorul subordonat pHC-2 care stabilizeaza pH-ul in punctual intermediar A. Regulatorul subordonat va comanda, in regim de divizare, doua marimi de executiedebitele celor 2 reactivi disponibili.

Figura .4.18.

3.1.6.Reglarea nivelului spumei

Aeratia si agitarea interna necesara a se efectua in procesele biochimice industriale, are ca efect formarea de spume, uneori deosebit de abundente. In orice biosinteza industriala este absolut necesar efectuarea unui control al formarii spumei pe toata durata desfasurarii procesului. Operatiile de control si reglare sunt efectuate automat sau continuu pe toata durata procesului biochimic respectiv. [15, p93] Aceasta problema este rezolvata relativ simplu prin cuplarea controlului analitic al formarii spumei, cu introducerea in bioreactor a agentilor de antispumare cu o viteza care trebuie sa depinda de nivelul spumei. Senzorii sau electrozii de contact reprezinta cea mai simpla solutie pentru controlul formarii spumei. Aceste sisteme (figura 4.19) sunt constituite din doua fire metalice fixate intr-un corp izolant a caror capete sunt plasate la o foarte mica distanta unul de altul (asemanator brejiilor de la automobile). Acest tip de senzor se plaseaza la o anumita inaltime deasupra mediului lichid din interiorul bioreactorului. Prin ajungerea spumei la extremitatile capetelor neizolate ale firelor metalice, se realizeaza practic un contact electric cu aparitia unui semnal analitic, care dupa o prealabila amplificare poate declansa un sistem de avertizare optic (un bec luminos), acustic (o sonerie sau sirena) sau ambele. Simultan, semnalul dat poate actiona spargatorul mecanic de spuma sau dupa un anumit interval de timp sistemul de adaugare a agentului antispumare. 1.- nivelul lichidului mediu de cultura 2.- spuma 3.- corpul senzorului 4.- sursa electrica 5.- avertizor optic 6.- avertizor acustic Figura .4.19.Principiul constructiv al unui senzor de contact pentru controlul formarii spumei In cazul sistemelor de contact, de control al formarii spumei, au fost descrise si dispozitive bazate pe utilizarea unor electrozi capacitivi acoperiti cu teflon. La toate aceste sisteme cu electrozi de contact, dupa scaderea nivelului spumei, prin actionarea mecanica, fizica sau chimica, se produce implicit deschiderea circuitului electric si intreruperea sistemelor de combatere a formarii spumei. In acest mod, ori de cate ori are loc o crestere a nivelului spumei peste o anumita limita la care este plasat senzorul, are loc declansarea sistemelor de avertizare si combatere a spumei, iar dupa scaderea nivelului spumei, sunt deconectate sistemele respective (figura 4.20). Bazat pe utilizarea electrozilor de contact au fost realizate si sisteme de control automat al formarii spumei si conectare gradata a diferitelor dispozitive de combatere a formarii spumei. Un asemenea sistem, utilizabil in procese de culturi microbiene, se prezinta sub forma unei scheme bloc, in figura 4.21.. Cand in bioreactorul 1 spuma ajunge la nivelul senzorului 2, apare un semnal care ajunge apoi la blocul de control 3, care pune in functiune dispozitivul 7, ce controleaza primul mecanism de spargere a spumei 4 (de exemplu un disc rotitor rapid). Daca formarea spumei la nivelul senzorului 2 se intrerupe, atunci elementele finale de combatere chimica a spumei 5 si 6, nu se comuta. Daca sistemul mecanic 4 nu reuseste sa opreasca formarea spumei sau spuma se formeaza din nou, atunci prin linia ulterioara 10, semnalul de iesire ajunge la circuitul logic 12 (de tip AND), cand se

conecteaza cu senzorul 2, cea de a doua linie de combatere a formarii spumei, prin intermediul dispozitivului 8. Se activeaza (prin furnizarea unui impuls la o valva solenoida) dispozitivul auxiliar 5, de introducere a unor antispumanti din rezervorul 14. Daca si acest caz combaterea spumei nu este eficienta, astfel incat nivelul acesteia sa scada la o pozitie sub senzorul 2, se activeaza intr-un mod similar sistemul final de reglare 6, care introduce in bioreactor un antispumant de mai mare eficienta. Dispozitivele 10 si 11 are rolul de a preveni conectarea simultana a tuturor sistemelor finale de reglare si combatere a formarii spumei, atunci cand spuma intra in contact cu senzorul 2. De asemenea, dispozitivul este prevazut si cu un sistem pentru intreruperea ansamblului 7, dupa un anumit interval de timp (5 sau 30 minute) dupa care revine la pozitia initiala. Partile operatorii ale sistemelor mecanice de distrugere a spumei, pot fi bineinteles diferite.

1.-senzor 2.-spuma 3.-lichid 4.-sistem de amplificare 5.-electrovalva 6.- rezervor de lichid antispumant 7.-sisteme de egalizare a presiunii Figura .4.20.Reprezentarea schematica a unui sistem automat de control al formarii spumei si reglare automata a antispumantilor

Figura 4.21. Schema unei instalatii de control al formarii spumei 1 bioreactor; 2 senzor de contact; 3 blocul de control; 4 dispozitiv de conectare a sistemului mecanic de spargere a spumei; 5, 6 sisteme finale de introducere a antispumantilor; 7, 8, 9 declansatoare ale dispozitivelor de combatere a formarii spumei; 10, 11 dispozitive de prevenire a conectarii simultane a tuturor sistemelor de reglare si combatere a formarii spumei;12, 13 circuite logice; 14, 15 rezervoare cu antispumanti.

3.1.7.Reglarea concentratiei oxigenului

In cazul masuratorilor de oxigen dizolvat in lichide biologice ale diferitelor procese biochimice industriale, moleculele sau monomoleculele deranjeaza masuratorile de oxigen ce utilizeaza senzori cu membrane permeabile pentru oxigen sau senzori galvanici pentru determinarea oxigenului in flux (figura 4.22). Acesti senzori aui de lucru ai celulei izolati de mediul de masurat prin intermediul unei membrane din material plastic care este permeabila pentru oxigen si impermeabila pentru marea majoritate a substantelor care ar putea fi reduse la catod odata cu oxigenul. 1.-catod 2.-anod 3.-membrana 4.-electrolit 5.-proba

Figura .4.22. Aparat pentru determinarea oxigenului dizolvat Membrana intinsa la partea inferioara a senzorului retine un film de elecrolit la suprafata catodului. Senzorii galvanici pentru determinarea oxigenului dizolvat sunt diferiti de cei amperometrici prin faptul ca nu necesita o sursa externa de voltaj (figura 4.22.). In acest caz diferenta de potential necesara, se asigura prin alegerea convenabila a anodului si a electrolitului, astfel incat, dupa scurtcircuitarea electrozilor sa se produca o electroliza interna, este necesar ca tensiunea generata prin dizolvarea anodului sa fie suficienta pentru reducerea spontana a oxigenului la suprafata catodului. Ca anozi se folosesc metale mai active, cum ar fi: Zn, Cd, Pb, etc., iar catozii se constituiesc din metale mobile cum ar fi: Pt, Au, Ag. astfel, pentru un senzor galvanic cu catod de argint si anod din plumb, reactiile electrochimice care au loc pe electrozi sunt date de ecuatiile: Catod: O2 + 2H2O + 4e 4HO Anod: 2Pb 2Pb2+ + 4e Iar in solutia de electrolit se produce reactia secundara: 2Pb + 4HO 2Pb (OH)2 Reactia globala a senzorului se obtine prin insumarea reactiilor de mai sus: O2 + 2Pb + 2H2O 2Pb (OH)2

1.-catod; 2.- anod; 3.-oxigen dizolvat; 4.-electrolit;

5.-ampermetru sensibil Figura .4.23.Principiul de realizare al unui senzor galvanic pentru oxigen In cazul senzorilor galvanici, se observa ca electrolitul nu participa la reactiile electrolitice, in schimb suprafata anodului oxideaza treptat. Variatia senzorului depinde astfel de suprafata disponibila a anodului. Intrucat nu exista o sursa externa de voltaj pentru producerea reducerii electrolitice a oxigenului din solutie, senzorii galvanici sunt mai simpli in constructie comparativ cu cei amperometrici. In general, senzorii amperometrici sau galvanici pentru determinarea oxigenului, prezinta un curent rezidual de baza mai mare decat in cazul celulelor polarografice cu electrod de Hg. Aceasta se datoreaza depunerii sau desprinderii a diferiti compusi (ex: oxizi), pe sau de pe suprafata electrozilor. Din aceste considerente, pentru obtinerea unor rezultate reproductibile, se impune un pretratament chimic sau mecanic al electrozilor inaintea utilizarii acestora. De asemenea sunt necesare recalibrari periodice ale celulelor respective. Pe baza principiilor de functionare ale senzorilor pentru oxigen acoperiti cu membrane, s-au realizat si comercializat cateva tipuri constructive mai importante. Unul din acesti senzori este senzorul Clark. Senzorul Clark, a carei reprezentare schematica este redata in figura 4.24, este realizat dintr-un catod de platina sub forma unui disc plat si o incinta cu electrolit (solutie KCl), in care se gaseste imersat anodul din argint. Membrana, din teflon, cu o grosime de 25m, se intinde la partea inferioara a senzorului prin intermediul unui inel din cauciuc, retinand astfel intre aceasta si catod un film de electrolit furnizat din rezervorul cu electrolit al senzorului. Senzorii de acest tip prezinta adesea, la inceputul perioadei de lucru, o variatie a curentului de difuzie. Dupa scurt timp insa, curentul se stabilizeaza, desi calibrarea se poate modifica lent in decursul folosir Aceste variatii in functionare se datoresc depozitarii in timp a AgCl pe suprafata anodului, depunerii de argint pe suprafata catodului, sau reducerii pana la eliminarea totala a clorului din electrolit. Curatand insa din timp in timp electrozii, schimband electrolitul si inlocuind periodic membrana, senzorul poate functiona timp indelungat. Evident, dupa fiecare conditionare in acest fel a senzorului, se impune o recalibrare a masuratorilor. 1.-catod 2.-anod 3.-electrolit 4.-membrana 5.-corpul senzorului 6.-inel de cauciuc

Figura .4.24.Reprezentarea schematica a unui senzor pentru oxigen tip Clark Prin utilizarea corecta a unui senzor de tip Clark cu membrana din teflon, cu o grosime de 25m, aproximativ 95% din semnalul analitic in regim stationar se obtine in 15 20 secunde. Acest senzor prezinta insa un raspuns histerezis; raspunsul este mai rapid pentru masuratori ale unor concentratii crescatoare fata de masuratori ale unor concentratii descrescatoare in oxigen (figura 4.25). Aceasta comportare, care consta in stabilizarea mai inceata a raspunsului senzorului la efectuarea masuratorilor unor solutii cu

un continut mai mic de oxigen fata de proba precedenta, a fost explicata prin difuzia laterala a O 2, catre rezervorul de electrolit, care este foarte aproape de catod. Pentru eliminarea acestui fenomen au fost realizati o serie de senzori cu cantitati mici de electrolit in rezervor, sau prin localizarea rezervorului intr-o pozitie mai departata de catod.

Figura 4.25.Raspunsul histerezis al unui senzor O2 1).concentratii crescatoare 2).concentratii descrescatoare 3.2. Controlul de calitate 3.2.1. Metode de analiza a materiilor prime si a materialelor intermediare 1. Extractul de porumb Metoda de analiza a aminoacizilor aminoacizii, in prezenta ninhidrinei, formeaza un compus albastru violet, care prezinta un maxim de absorbtie la 570 nm sau prin descompunere enzimatica ionii de amoniu formati pot fi dozati spectrofotometric, permitand dozarea directa a azotului din aminoacizi (metode spectrofotometrice). Cromatografia cu gradient de pH sta la baza functionarii unor analizoare automate pentru aminoacizi (figura nr.65.).

Figura nr.65.Principiul constructiv al unui analizor de aminoacizi cu elutie in gradient de pH 1 coloana cromatografica termostata; 2 rezervor cu solutie tampon de pH;

3 solutie cu reactiv de culoare pentru determinarea spectrofotometrica a aminoacizilor (ninhidrina); 4 camera de amestecare; 5 serpentina pentru racire; 6 spectrofotometru ; 7 inregistrator; 8 pompe; 9 proba de analizat. Aceste analizoare folosesc in general separarea pe o coloana cromatografica termostatata (1) umpluta cu schimbatori de ioni, iar eluarea se face cu solutie tampon (2), cu diferite valori ale pH ului, dupa un program prestabilit obtinerea unui gradient de pH cu rezolutie maxima, intr-un timp minim. Detectia se efectueaza spectrofotometric, pe baza reactiei de culoare pe care o dau aminoacizii eluati de pe coloana, cu ninhidrina.

Absortia optica a compusului dorit se masoara la 440 si 570 nm cu un spectrofotometru cu dublu fascicul (6), iar semnalul analitic obtinut care e direct proportional cu concentratiile diferitilor aminoacizi din proba de analizat, se inregistreaza grafic cu ajutorul unui inregistrator. 2. Glucoza Reactivii folositi pentru analiza trebuie sa fie de calitateapentru analiza(p.a.) sau de calitate echivalenta. Apa trebuie sa fie distilata. 2.1.Examenul organoleptic Examenul organoleptic se face asupra probei aduse la temperatura de 20oC. Pentru verificarea aspectului, culorii si a corpurilor straine, o parte din proba de glucoza lichida se introduce intr-un vas de sticla incolora cu diametrul de 7-12 cm, iar proba de glucoza solida se sectioneaza cu un cutit in bucati de cca. 250 g. Verificarile respective se fac la lumina naturala a zilei sau la o sursa de lumina, pe fondul unei hartii albe. Gustul si mirosul se apreciaza asupra probei respective prin degustare si mirosire. 2.2. Determinarea culorii glucozei Principiul metodei. Se adaoga solutia de iod 0,1 n in apa, in conditii determinate, pana se obtine o culoare identica cu cea a glucozei lichide de analizat. Mod de lucru. Intr-un pahar de laborator se introduc 100 ml din proba de glucoza lichida. Intr-un alt pahar identic se introduc 100 ml apa, in care se adaoga cu ajutorul unei biurete, picatura cu picatura, solutie de iod, pana cand coloratia din cele doua pahare este identica. Compararea se face la volume egale de lichid. Coloratia celor 2 pahare se constata cu ochiul liber la lumina zilei, pe fondul unei hartii albe.

Exprimarea rezultatelor. Culoarea se exprima prin volumul solutiei de iod 0,1 n folosit pentru egalarea culorii, in ml. 2.3. Determinarea aciditatii Principiul metodei. Proba de analizat, dizolvata in apa, se titreaza cu hidroxid de sodiu, solutie 0,1 n in prezenta de FF solutie 1% in alcool etilic 70% vol. Mod de lucru. Se masoara cu pipeta 100 ml din solutia de lucru obtinuta anterior si se introduc intr-o capsula de portelan. Se titreaza cu solutie de hidroxid de sodiu in prezenta FF, pana la aparitia coloratiei roz, care persista timp de 1 minut. Se executa in paralel 2 determinari din aceeasi solutie de lucru. Calcul. Aciditatea se exprima in grade de aciditate. 1 grad de aciditate reprezinta volumul in ml de solutie de NaOH n, necesar pentru neutralizarea acizilor liberi din 100 g produs. Aciditatea se calculeaza cu relatia:

unde : V- volumul solutiei de NaOH 0,1 n, folosit la titrare,ml. 2.4. Determinarea umiditatii Determinarea umiditatii se face prin: metoda picnometrica, obligatorie in caz de litigiu si metoda refractometrica, rapida. Metoda picnometrica

Principiul metodei. Se determina cu ajutorul picnometrului densitatea solutiei de glucoza de 20 g/100 ml si in functie de aceasta se stabileste continutul de substanta uscata si respectiv de umiditate. Mod de lucru. Se umple picnometrul cu solutie de lucru obtinuta anterior si se tine in termostat 30 min la temperatura de 20oc. se determina densitatea relativaconform STAS 184/2-71, iar din tabel se deduce continutul in substanta uscata, corespunzator densitatii relative determinate. Calculul : %s.u.= 100-Su in care s.u. reprezinta continutul de substanta uscata , in % citit in tabelul din anexa A. Metoda refractometrica

Principiul metodei. Se citeste la refractometru continutul de substanta uscata solubila (exprimat in zaharoza) din solutia de glucoza cu concentratia de 20 g/100 ml si in functie de acesta se stabileste continutul de substanta uscata si respectiv de umiditate. Mod de lucru. Pe prisma fixa a refractometrului se picura cu ajutorul unei baghete 2 sau 3 picaturi din solutia de lucru obtinuta anterior si se inchid prismele imediat. Se deplaseaza ocularul pana la suprapunerea reperului cu linia de separare a celor doua campuri. Apoi se citeste direct continutul de substanta uscata a substantei de lucru. Se efectueaza doua determinari din solutia de lucru. Calcul . continutul de substanta uscata al probei de analizat, exprimat in %, se calculeaza cu relatia:

in care: c- continutul de substanta uscata citit la refractometru. %.

v- volumul solutiei obtinute, ml. m- masa probei de analizat luate pentru pregatirea solutiei de lucru. G. 2.5. Determinarea continutului de dextroza Principiul metodei. Se reduce la cald o solutie alcalina de sare cuprica, cu ajutorul zaharurilor reducatoare din proba de analizat. Oxidul cupros rezultat din reactie se titreaza indirect cu solutie de tiosulfat de sodiu (metoda LuffSghoorl). Mod de lucru. Intr-un balon cotat de 1000 ml se introduc cca 5 g glucoza sau cca 3 g glucoza solida, se dizolva prin agitare cu apa si se aduce la semn cu apa. Intr-un vas Erlenmeyer de 200-300 ml se introduc 25 ml solutie cuprica si 25 ml din solutia de analizat obtinuta anterior, masurati cu pipeta, peste care se adaoga cateva bucatele de piatra ponce. Vasul se ataseaza la un refrigerent cu reflux, se aseaza pe o sita de azbest avand o deschidere cu diametrul de 6,5 cm si se aduce la fierbere in 2-3 minute, dupa care se mentine in fierbere moderata exact 10 minute. Se raceste imediat la temperatura camerei. Se adaoga solutia de KI,apoi 25 ml acid sulfuric in proportii mici pentru a evita spumarea, dar cat mai repede posibil si agitand continuu. Se titreaza cu solutie de tiosulfat de sodiu pana la culoarea slab galbuie, se adaoga pana la 2-3 ml solutie de amidon si se continua titrarea pana la disparitia culorii violet. Se executa o determinare martor cu aceeasi reactivi, inlocuind cei 25 ml de solutie de analizat cu apa. Se efectueaza doua determinari din aceeasi proba. Calculul . Continutul de dextroza, exprimat in % si raportat la s.u., se calculeaza cu formula:

in care: c- cantitatea de dextroza, mg; m- masa probei luate pentru determinare, %; U- continutul de umiditate a probei, %. 3.Butanol Analiza butanolului presupune determinarea aciditatii acestuia prin titrarea aciditatii unei probe de analizat cu o solutie volumetrica standard de NaOH (0,1 mol/l), in prezenta FF ca indicator. Pentru analiza se folosesc numai reactivi de calitate analitica recunoscuta si numai apa distilata. Mod de lucru. Se cantaresc intr-un pahar conic de 250 ml, 100 g esantion pentru laborator. Se adaoga 0,5 ml solutie de FF in vasul care contine proba de analizat si se titreaza cu solutie de NaOH pana ce culoarea roz persista timp de 15 s. dupa fiecare adaugare de solutie de NaOH, dupa ce a fost pus dopul, se agita continutul vasului conic. Aciditatea exprimata in procente de masa de acid butiric este data de formula :

in care: V- volumul de solutie de NaOH folosit pentru determinare, ml. m- masa probei de analizat, g. 4.Acetat de n-butil

Principiul metodei. Saponificarea esterilor cu solutie alcoolica de KOH si titrarea excesului de KOH cu HCl, in prezenta FF ca indicator. Mod de lucru. Intr-un vas conic de 250 ml cu gatul slefuit se introduc 50 ml solutie de KOH si se cantareste la balanta analitica. Se introduc apoi 5 ml proba si se cantareste din nou la balanta anlitica, determinandu-se prin diferenta, cantitatea de proba. Vasul se racordeaza la un refrigerent cu reflux, racit cu apa si se incalzeste la fierbere timp de 1 ora pe baia de apa. Apoi se raceste vasul si se spala interiorul refrigerentului si sliful de doua ori cu cate 20 ml apa, care se prinde in vasul cu proba. Se adaoga 0,5 ml solutie de FF si se titreaza excesul de KOH cu HCl pana la disparitia culorii roz. Calculul. Continutul de acetat de n-butil se exprima in % si se calculeaza cu relatia:

in care: 0,1162- cantitatea de acetat de n-butil, g la 1 ml HCl; V1- volumul de HCl folosit la titrarea probei de control a reactivilor, ml; V2- volumul de HCl folosit la titrarea probei de analizat, ml; m- masa probei luate pentru determinare, g; A- aciditatea probei, %. 5.Carbonat de potasiu Pregatirea probei. Intr-o fiola de cantarire cu capac slefuit, de dimensiuni corespunzatoare, adusa in prealabil la masa constanta (m 1) se cantaresc cca 20 g din proba,astfel incat stratul de produs sa nu depaseasca latimea de 3 mm. Se usuca in etuva timp de 2 ore la 105 oC, se raceste apoi in exicator si se cantareste din nou (m2). Diferenta dintre fiola cu produs si fiola goala (m1-m2), reprezinta cantitatea de carbonat de potasiu, in g. Continutul fiolei se trece cantitativ, cu apa lipsita de CO 2, intr-un balon cotat de 250 ml, se agita pentru dizolvare, se aduce la semn cu apa si se omogenizeaza. 6.Cloroform Principiul metodei. Continutul de cloroform se determina prin metoda gazcromatografica. Componentii din proba de analizat se identifica prin compararea timpilor de retinere a fiecarui component de pe cromatograma probei cu cei ai unui amestec etalon cu compozitie cunoscuta si care contine toti componentii prin metoda normarii interne. Mod de lucru. Intr-o eprubeta colorimetrica cu dop slefuit, spalata in prealabil cu aici sulfuric, se introduc, cu ajutorul unei pipete, 10 ml proba. Se adaoga 10 ml acid sulfuric, se agita 30 minute, apoi se lasa in repaus la intuneric timp de 60 minute, dupa care se examineaza stratul de acid sulfuric.

3.2.2. Metode de analiza a produsului finit

Pentru analiza Penicilinei G sare de potasiu se foloseste ca microorganism: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P. Medii de cultura pentru: - intretinerea tulpinii de microorganisme-test (A) I-A

- obtinerea suspensiei-stoc de spori (B) - treceri zilnice (C)

I-C

Medii de cultura pentru determinarea activitatii microbiologice a antibioticului: - strat inferior (i) - strat superior (s) Concentratia suspensiei de microorganisme-test (in microorganisme-test/ml): Antibiotic-standard: Benzylpenicillium potassium Solventi pentru prepararea solutiei-stoc (standard si proba): tampon fosfat pH = 7,0 Solventi pentru prepararea dilutiilor de lucru (standard si proba): tampon fosfat pH = 7,0 Timp de conservare a solutiei stoc(standard si proba) la 4oC: 3 zile Concentratia dilutiilor de lucru (standard si proba) in sau U.I./ml: 1 U.I. 2 U.I.

In mediul de cultura prevazut mai sus pentru a forma stratul inferior al mediului de cultura folosit pentru determinarea activitatii microbiologice a antibioticului, topit si raci la 50oC, in cazul suspensiei de microorganisme-test in forma vegetativa sau racit la 60 oC in cazul suspensiilor de microorganisme-test in forma sporulata, se introduce un ml de suspensie de microorganisme-test pentru 100 ml mediu de cultura si se amesteca pentru omogenizare. Concentratiile suspensiilor de microorganisme-test, obtinute prin dilutie, conform prevederilor anterioare, necesare insamantarilor sunt prevazute mai sus. 5 ml mediu de cultura insamantat se aduc peste stratul inferior de mediu de cultura solidificat in placile Petri, astfel incat sa se formeze un strat superior uniform ca grosime. Dupa solidificarea stratului superior se aseaza pe suprafata acestuia la o distanta de aproximativ 28 mm de centrul placii Petri si la o distanta egala unul fata de celalalt, patru cilindri din hotel inoxidabil sau dintr-un alt material adecvat, cu diametrul interior de 7 mm si cu inaltimea de 10 mm. Se efectueaza cate 3 cantariri atat din antibioticul standard cat si din cel de analizat. Din fiecare cantarire se prepara solutiile-stoc si solutiile de lucru. Se folosesc cate 6 placi Petri. Dilutiile de lucru se introduc in cei 4 cilindri din fiecare din placile Petri, dupa cum urmeaza: in primele 6 placi Petri, in cei 2 cilindri se introduc cate 0,4 ml din prima solutie standard de lucru si in ceilalti 2 cilindri cate 0,4 ml din prima dilutie proba de lucru. In celelalte 6 placi Petri se procedeaza in mod odentic cu cea de-a doua dilutie de lucru (standard si proba). Placile Petri se inchid, se incubeaza la termostat la 35-37 oC timp de 18 ore si se masoara diametrul zonelor de inhibitie a cresterii microorganismelor-test, produse atat de dilutiile standard de lucru cat si de dilutiile-proba de lucru. Determinarea se efectueaza cu o precizie de 0,1 mm, folosind un instrument adecvat de masurare. Intrepretarea rezultatelor. Se calculeaza meda aritmetica a diametrelor zonelor de inhibitie pentru fiecare dilutie de lucru si se procedeaza conform prevederilor de la Evaluarea statistica a determinarilor biologice-Calculul activitatii biologice prin evaluarea indirecta-Metode bazate pe raspunsuri gradate. Proba de analizat este corespunzatoare daca activitatea microbiologica a acesteia este de cel putin 90% si de cel mult 110% fata de activitatea microbiologica a antibioticului studiat. Limitele de eroare sunt cuprinse intre 80 si 125%.

Capitolul 4. Produse secundare. Deseuri de fabricatie si epurarea apelor reziduale

Produsele secundare si deseurile de fabricatie ce rezulta din tehnologia obtinerii prin biosinteza a Penicilinei G sare de potasiu sunt urmatoarele: biomasa, solutia apoasa epuizata de la etapa de extractie, azeotrop apa-butanol rezultat de la etapa de cristalizare si butanol cu urma de cloroform. Biomasa rezultata in urma efectuarii operatiei de filtrare va fi utilizata ca adaos nutritiv, necesar cresterii animalelor. Azeotropul apa-butanol va fi tratat cu sulfat de sodiu anhidru in vederea eliminarii apei, recuperandu-se astfel butanilul ce va putea fi distilat pentru obtinerea butanolului pur. Butanolul cu urme de cloroform se va distila fractionat recuperandu-se astfel si acesasta cantitate de solvent. Solutia apoasa epuizata in urma extractiei este o apa acida, care va trebui mai intai neutralizata cu hidroxid de sodiu tehnic, dupa care va fi trimisa catre statia de epurare a apelor reziduale. Procesul de epurare consta in indepartarea din apele uzate a substantelor toxice, microorganismelor, etc., in scopul protectiei mediului inconjurator; o epurare corespunzatoare trebuie sa asigure conditii necesare dezvoltarii in continuare a tuturor folosintelor (alimentare cu apa, pisicultura, agricultura, etc.). Evacuarea apelor reziduale neepurate in mod corespunzator poate prejudicia, printe altele, in primul rand sanatatea publica. Ca optima masura, STAS 1481-76 ca apele uzate sa fie evacuate intotdeauna in avalul punctelor de folosinta. De asemenea, STAS 4706-74 syabileste o serie de conditii tehnice de calitete pe care trebuie sa le indeplineasca anestecul dintre apa uzata si a emisarului in aval de punctul de evacuare a apelor uzate, astfel incat folosintele in aval sa nu fie afectate. Epurarea apelor reziduale se realizeaza in statii de epurare, acestea facand parte integranta din canalizarea orasului sau a industriei. Apele uzate industriale sunt admise in reteaua de canalizare a orasului numai daca indeplinesc anumite conditii, stabilite de Normativul privind conditiile de descarcare a apelo uzate in retelele de canalizare a centrelor populate N-2-70(C-90-70). Acest normativ interzice evacuarea in retelele de canalizare orasenesti a apelor reziduale industriale care contin: suspensii sau alte materiale care se pot depune; pacura, uleiuri, grasimi care pot genera aderenta pe peretii colectorului; substante cu agresivitate chimica asupra materialului de constructie a colectorului si a statiei de epurare; substante ca; benzeb, eter, cloroform, acetilena, etc., care prin evaporare pot provoca amestecuri detonante; substante nocive care pot pune in pericol personalul de deservire a statiilor de epurare; ape calde cu temperaturi pest 50oC.

Capitolul 5. Transport, depozitare, ambalare

5.1. Aparate de transport
In industria chimica, problema trnsporturilor are o importanta deosebita prin cantitatile si varietatea materialelor de transportat. La construirea unei fabrici chimice trebuie sa se tina seama de problema transportului, urmarindu-se, in dezvoltarea ei, sa se analizeze economia de munca si o productivitate maxima; aceasta se obtine prin mecanizarea

transportului si a intregului proces chimic. Problema transportului trebuie studiata de la aducerea materialului in fabrica, la transportul intre sectii si pana la expedierea produselor finite. Costul miscarii materialelor reprezinta partea principala a salariilor neproductive; rezolvarea rationala a problemei transportului reduce simtitor pretul de cost al produselor. Mijloacele de transport pot duce insa si la o imbunatatire a modului de fabricatie, prin faptul ca asigura alimentarea locului de lucru cu material, in momentul in careeste necesar, evitandu-se astfel pierderile de timp. Se vor evita, in general, transportul inutil prin fabrica, ridicarea si transportul manual al greutatilor mai mari de 50 kg si utilizarea unui numar mare de oameni pentru transportul fara dispozitive de protectie si de usurare a munc In general, se evita transportul materialului in sens invers fluxului normal de fabricatie, dupa cum si folosirea unor sisteme de transport invechite. Circulatia materialelor determina asezarea si orientarea sectiilor, si directiile de dezvoltare viitoare, in functie de succesiunea operatiilor, cum si de repartizarea aparatelor. Mijloacele de transport adoptate nu conditioneaza numai dispozitia cladirilor, dar si gradul de soliditate al constructiilor sectiilor.in general, se utilizeaza aparate de transport numai acolo unde ele sunt absolut necesare, preferandu-se pe cat posibil, transportul pe sol. Principial, solutiile cele mai simple sunt si celemai bune si de aceea se recurge la aparate speciale numai in cazuri exceptionale. La productiile continue, in punctul terminus al unui mijloc de transport trebuie sa inceapa un altul, pentru ca nici o distanta sa nu ramana nedeservita; mijloacele de transport suprapuse vor fi limitate la minimum, deoarece ele maresc costul instalatiilor fara a aduce un folos real. La alegerea utilajului pentru manipularea materialului se tine seama de obiectivul reducerii pretului de cost, al reducerii consumului de munca umana si de materiale, al usurarii si al protectiei muncii, al evitariii degradarii utilajului, si al prevenirii incendiilor. In functie de procesul tehnologic si de felul utilajului de productie se studiaza: 1. miscarea care trebuie executata, pentru a se constata daca este o miscare orizontala sau verticala sau o combinatie a acestor 2 miscari; se apreciaza distanta care urmeaza sa fie parcursa; 2. cantitatea de material care trebuie transportata pe ora, pe zi sau pe orice unitate de timp, exprimata in unitati de greutate, in numar de piese sau unitati de volum; 3. 4. 5. 6. 7. 8. cum urmeaza sa fie adus materialul la aparatul de transport; cum urmeaza sa fie descarcat materialul de catre aparatul de transport; daca este necesar un transport continuu sau intermittent si daca materialul poate fi depozitat; modul de ambalare a materialului si descrierea completa a materialului; precizarea daca materialul de transportat este in forma de pulbere, de bucati, etc; caracteristicele speciale ale materialului: umiditatea, corozivitatea si inflamabilitatea.

Utilajul pentru manipularea materialului trebuie sa serveasca, pe cat posibil, in mai multe scopuri, dar uneori acest utilaj devune o parte componenta a utilajului de productie. Cele mai multe instalatii pentru manipularea materialului din indusrtia chimica apartin anumitor grupe clasice de aparate de transport; in cadrul acestor grupe se selectioneaza utilajul cel mai indicat pentru rezolvarea problemelor tehnologice.

In general, aparatele de transport se construiesc fara sa se tina seama de umiditatea si corozivitatea care constituie conditiile specifice instalatiilor chimice si se aleg utilaje normale, recomandandu-se ca materialul sa fie transporta ambalat. Cand aceasta nu este posibil, se recurge la utilaje de constructie speciala. Factorii care influenteaza alegerea utilajului special pentru aparate de transport sunt: 1. 2. 3. 4. 5. pericolul de coroziune provocat de substante chimice sau umiditate excesiva; pericolul de dergradare prin incalzirea provocata de substante fierbinti; pericolul de foc sau de explozie; pericolul de otravire; masurile de igiena a munc

Coroziunea este factorul cel mai important si de aceea transportoarele trebuie examinate cu atentie, preferandu-se utilizarea aparatelor de transport care pot fi manipulate fara a fi degradate prin corodarea lor de catre materialele care se transporta. Cand acest lucru nu e posibil se vor proteja punctele expuse degradarilor, ca de exemplu lagarele rolelor de la transportoare. In mod curent, lagarele se protejeaza prin efectuarea ungerii sub presiune care evita intrarea substantei corozive in lagar. Se va evita corodarea si prin captusirea materialului de constructie normala. Problema mijloacelor de transport poate fi rezolvata in trei feluri: A.alegerea celui mai ieftin utilaj, fara sa se tina seama ca el va fi supus coroziunii dat fiind ca urmeaza sa fie inlocuit periodic, daca cheltuielile de investitie vor fi compensate prin economie de intretinere; B. alegerea unui utilaj special anticoroziv, care va necesita, deci, cheltuieli mari de investitie si cheltuieli mici de intretinere; C. folosirea unui utilaj de transport obisnuit, dar cu transportul materialului ambalat. Cand coroziunea este datorita gazelor sau vaporilor, se vor utiliza dispozitive auxiliare de protectie si un sistem de ventilatie. Fiecare problema de manipulare a materialelor trebuie studiata separate pentru a se verifica daca exista pericolul coroziunii; in caz afirmativ, pericolul coroziunii va determina alegerea utilajului. Deteriorarile prin incalzire cu materiale fierbinti se produc la manipularea produselor scoase din cuptoare si se evita prin captusirea cu placi de fonta a transportorului sau prin utilizarea unor recipiente de ambalaj. Materialele topite se transporta in caldari captusite cu material refractar. Pericolul de foc si de explozie apare adeseori in diferite ramuri ale industriei chimice. In astfel de cazuri trebuie evitat contactl materialului manipulate cu scantei sau cu flacari. Cand acest lucru nu este posibil, materialul se depoziteaza intr-o incapere etansa sau in incaperi speciale. Aparatul de transport se leaga de obicei la pamant, pentru a se evita descarcarile electrice sau electrostatice. Cand exista praf inflamabil, pericolul de foc sau de explozie se evita prin urmatoarele mijloace: incaperile prin care se face manipularea se ventileaza puternic, pentru a reduce concentratia prafului sub procentul critic; se evita producerea scanteilor sau a flacarilor in aceste incaperi; materialul se manipuleaza intr-o atmosfera cu continut redus de oxigen pentru a nu alimenta arderea;

 materialul se manipuleaza in ambalaje care fac imposibile raspandirea prafului. Substantele toxice sau care emit vapori toxici prezinta un pericol pentru muncitorul care deserveste aparatul de transport; in asemenea cazuri se adopta un ambalaj care poate fi manipulat de la distanta si daca este posibil, in mod automat. Avand de rezolvat probleme foarte diferite, aparatele de transport sunt numeroase si variate. O prima clasificare a acestor mijloace de transport este urmatoarea: mijloace de transport pe sol; mijloace de transport in inaltime si aparate de ridicat; mijloace de transport continue. Tehnica inaintata cere utilizarea transpotoarelor continue si pe cat posibil, mobile, evitandu-se un transport prea rapid, care poate duce la separarea materialelor transportate dupa greutatea lor specifica. La alegerea mijlocului de transport sunt hotaratori urmatorii factori: debitul, traseul, costul deservirii si costul instalatiei. In tehnica se intalnesc elemente unice de transport sau aparate complexe de transport in functie de conditiile de lucru. Ca factor hotarator in alegerea solutiei intervine si nivelul apelor subterane care ar putea impiedica saparea gropilor. Modul de depozitare conditioneaza alegerea aparaturii de transport si de aceea este tratat la sfarsitul acestei sectiuni. Solutia adoptata va trebui sa arate ca s-a tinut seama de factorii tehnico-economici, de sarcinile Planului de Stat, de conditiile si resursele locale, cum si de considerentele economice,constructve si de exploatare specifice intreprinder

5.2. Depozitarea materialelor

Materialele primite de o uzina chimica sufera o serie de transformari in cadrul procesului tehnologic si trebuie depozitate sub forma de semifabricate sau de produse finite la diferite etape. Inmagazinarea se face in depozitte universale sau speciale, care se clasifica astfel : 1) 2) 3) 4) 5) 6) depozite de materii prime si auxiliare; depozite de combustibil; depozite de semifabricate; depozite de scule; depozite de produse finite; depozite pentru deseuri utilizabile.

Intr-o uzina exista depozite pentru intreaga fabrica, in care se pastreaza stocurile principale de materiale, in vederea alimentarii tuturor sectiilor, si depozite de ateliere in care se gasesc materiale semifabricate si produse specifice sectiei. Asezarea depozitelor este in functie de modul in care a fost rezolvata problema transporturilor, fiindca ele se construiesc langa cai ferate sau drumuri. Numai cand exista materiale inflamabile sau explozibile, se recomanda amplasarea depozitelor in afara interprinder La proiectarea depozitelor se pleaca de la normativele de stocuri de materii prime si auxiliare necesare procesului tehnologic, de la planul de productie si de la consumurile specifice.

In functie de proprietatile materialelor de depozitat, se deosebesc urmatoarele tipuri de depozite : a) b) c) depozite descoperite ; soproane ; magazii acoperite, reci sau incalzite.

Depozitele acoperite se amenajeaza la nivelul solului sau pe platforma si constituie terenuri pavate dotate cu un anumit utilaj. Platformele se fac din scanduri sau din grinzi si sunt imprejmuite cu scanduri care impiedica revarsarea materialelor afanate. Lazile de depozitare sunt facute din pereti ficsi sau demontabili, cu inaltimea pana la 2,5 m si servesc la depozitarea materialelor varsate. Se poate prevedea si un acoperis cu o singura panta, care sa fereasca de ploaie materialele alterabile. Soproanele sunt formate dintr-un acoperis sustinut de stalpi, care fereste de umezeala materialele asezate pe o podea situata la nivelul terenului sau la o inaltime de 1,1 m. Streasina acoperisului se construieste in functie de gabaritul mijlocului de transport. Magaziile acoperite pot fi cu etaj sau fara etaj si au inaltimea in functie de grosimea de stivuire admisa pentru materialul respectiv si in functie de gradul de mecanizare a operatiei de stivuire. Se construiesc magazii cu mai multe etaje, cand terenuleste mic si este nevoie de suprafete mari de depozitare. Se admite, pe plansee, o incarcare de 1,5 t /m2 ; se construiesc magazii cu mai multe etaje si cu subsol. Depozitele subterane se construiesc pentru materiale inflamabile ; in partea de deasupra a solului se prevad ferestre. Materialul se coboara in depozit prin chepenguri sau pe plane inclinate. In functie de materialele depozitate, podeaua magaziei poate fi din lemn, asfalt, beton, xilolit, clinker, de pietre de pavaj, de beton rezistent la acizi sau asfalt rezistent la uleiuri. Fundatiile podelei se calculeaza in functie de solicitarile exterioare. Se realizeaza treceri continue de la podea la margini, pentru a nu impiedica circulatia. In cele doua parti longitudinale se construiesc rampe de incarcare si descarcare, aparate de streasina. Portile se fac din lemn sau metal, cu balamale sau de tip glisant, care nu necesita la deschidere spatii libere. Portile nu se fac cu prag si au dimensiunile in functie de tipul de transport. Iluminarea magaziilor se face in mod natural, prin ferestre si luminatoare prevazute in pereti, la o inaltime mare de la podea pentru ca lumina sa nu se opreasca in polite. Fereastra se aseaza de obicei deasupra streasinei, pentru a nu impiedica iluminatul natural. Incalzirea se face numai in cazul in care materialele trebuie pastrate la o temperatura constanta sau cand personalul de serviciu este obligat sa lucreze continuu. Magaziile incalzite vor avea la porti perdele de aer izolatoare de caldura. Dispozitivele de incalzire sunt de tip central, au suprafete netede, pentru a nu retine praful si realizeaza o semiincalzire (5 6C ) sau o incalzire (12 14 C). In functie de natura si de forma materialului depozitat se dimensioneaza si se construiesc rafturi universale sau speciale. La fiecare 30 m se lasa, in magazii, o trecere transversala de la un capat la altul, de largimea us Intre rafturi se lasa o trecere de 1,2 m, daca se trece cu carucioare. La magazii se deosebesc : suprafata utila, care este ocupata direct de rafturi, stive, material ;

 suprafata operativa, care cuprinde trecerile, locurile de sortare, de receptie, de eliberare a marfurilor, de cantarire si incaperile de serviciu ; suprafata de constructie, ocupata de pereti despartitori, stalpi, scari, ascensoare. Silozurile sunt celule cu sectiunea patrata, poligonala sau circulara, avand in partea de jos o portiune conica pentru descarcare si putand fi incarcate, cu ajutorul aparatelor de transport pe la partea superioara. La silozurile mici, numite buncare, raportul este mare, pe cand la silozurile mari, raportul este mic; linia taluzului intalneste peretele vertical opus inainte de intretaierea sa cu suprfata materialului varsat. Pentru carbune si cocs se recomanda buncare, iar pentru materialul pulverulent se recomanda silozuri mari, cu o presiune laterala asupra peretilor de 0,3 0,16 din presiunea verticala. Depozitarea lichidelor se face in rezervoare sau in recipiente ; din aceasta categorie fac parte combustibilii lichizi, lubrifiantii, lacurile, vopselele, solventii si diversi reactivi. Rezervoarele se clasifica in : subterane ; semisubterane ; terestre. Depozitele subterane au punctul cel mai inalt cu 0,2 m mai jos decat cota terenului invecinat. Rezervoarele semisubterane au fundul rezervorului la o adancime mai mare decat jumatatea inaltimii, iar nivelul in rezervor nu poate depasi cota terenului invecinat cu mai mult de 2 m. Celelalte rezervoare intra in categoria rezervoarelor terestre. Rezervoarele terestre se construiesc izolate sau in grup ; ele pot fi cilindrice verticale, sudate sau nituite. Depozitele de materiale in stare solida , care trebuie sa contina un stoc corespunzator nevoilor interprinderii pe cateva luni, se aseaza, in functie de conditiile locale, langa sectia consumatoare si in apropierea caii ferate. Modul de constructie a unor astfel de depozite in aer liber trebuie sa asigure inlaturarea pierderilor prin oxidare, prevenirea autoaprinderilor si mecanizarea incarcarii si descarcar Depozitele de carbuni prezinta, in general, pericolul de autoaprindere si de aceea, in normele sovietice, carbunii se clasifica in carbuni periculosi si carbuni stabili , si se recomanda limitarea inaltimii de asezare, prin indepartarea carbunilor incinsi si prin indesarea carbunilor in stiva pentru a impiedica infiltrarea aerului. Se recomanda sa nu se amestece carbunii, ci sa se depoziteze pe resorturi diferite, in stive separate. Pentru depozitele in aer liber se rezerva terenuri neinundabile, iar cota apelor subterane va fi coborata prin santuri de drenaj sau prin puturi absorbante. Nivelarea terenului trebuie sa asigure evacuarea apelor de ploaie in afara terenului depozitului. Terenul se prevede cu un strat acoperitor, bun conducator de caldura, pentru a nu favoriza inmagazinarea de caldura in stive prin oxidarea materialelor depozitate. Se prescrie durata maxima de depozitare a diferitelor materiale, pentru a se evita autoaprinderea. Depozitele trebuie mecanizate in ce priveste transportul, pentru ca incarcarea, descarcarea, transportul si repartizarea in stive sa se poata face pe tot teritoriul depozitului.

In general se utilizeaza benzi de transport, scrapere, transportoare cu jghiab si masini mobile de transport. Se utilizeaza depozitele cu cai ferate normale si inguste de tip permanent sau provizoriu. 5.3. Ambalarea materialelor

Materialele studiate pentru transport si depozitare sunt materiale masive sau in bucati, de volum mare sau mic, grele sau usoare, cu forma stabila sau variabila, rezistente sau fragile. Pentru a scadea costul manoperei pe unitate, pentru a scurta timpul de incarcare si de descarcare, pentru a reduce degradarea prin incarcari si descarcari si pentru a usura si accelera circulatia, s-a impus sa se manipuleze mai multe bucati de material, deodata. In functie de dimensiunile produsului si de procesul tehnologic se stabilesc volumul si cantitatea de transportat, traseul materialului si debitul necesar pe schimb pentru a asigura un proces continuu. Pentru a se stabili incarcatura normata, trebuie sa se tina seama de durata prelucrarii, de greutatea si dimensiunile sarjei si de intervalul dintre doua operatii tip in procesul tehnologic. Cea mai practica forma de ambalaj a unei incarcaturi normate trebuie sa aiba baza cu dimensiuni de 200 x 600 mm, 300 x 400 mm sau 600 x 1200 mm .Ambalajul trebuie sa asigure si o greutate normata a incarcaturii care, in mod general, se ia de 600, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000 sau 3 500 kg. El trebuie sa fie capabil sa preia material sub forma lichida, varsata sau bloc, intr-un mod care sa permita ulterior apucarea in carlige sau de jos, pentru transportul in interiorul sau in exteriorul uzinei. Scheletul ambalajului trebuie sa reziste in manuirile mecanice. Prin suprapunerea mai multor colete elementare trebuie sa se obtina o incarcatura normata din scara data mai sus. Adoptand un ambalaj rational, cheltuielile de manipulare vor fi reduse, posibilitatile de degradare vor fi mai mici si se va obtine o organizare usoara a magaziilor, cu sau fara boxe, si un control rapid al magaziilor. Ambalajul trebuie sa asigure o utilizare rationala a spatiului magaziilor, stiind ca lungimea si latimea magaziilor ajuta manipularilor, dar ca factorul inaltime este cel care determina o buna exploatare a spatiului. Ambalajul trebuie sa asigure securitatea muncii si transportul rapid si ieftin. El trebuie sa fie adecvat mijloacelor de transport adoptate si sa contribuie la amortizarea rapida a acestora. Ambalajul trebuie sa aiba un aspect placut, sa asigure o pastrare igienica si sa fie insotit de instructajul de manipulare. Dupa ce produsul a fost consumat, ambalajul trebuie sa poata fi utilizat din nou in acelasi scop sau in alte scopuri utile. Un ambalaj, dupa ce a fost realizat, pe baza principiilor enumerate mai sus, se supune la proba de rostogolire, de aruncare de la inaltimi si de strivire pe diagonala. Se recomanda sa se adopte ambalaje standardizate, pentru a ajuta uzinele producatoare si pentru a utiliza mijloace de transport in modul cel mai bun. Pentru transportul pe cale ferata sau cu avionul se construiesc ambalaje speciale. Intr-o uzina chimica se organizeaza sectii de ambalaj la care se studiaza alegerea ambalajului, masinile de ambalaj, mecanizarea procesului de ambalaj, posibilitatea de a lucra pe banda, influenta mijloacelor de transport interne si dotarea cu masini de dozat. Modul de iluminare a sectiei de ambalare este foarte important. Cele mai uzuale ambalaje sunt : tuburile, ambalajele de carton sau de metal, ambalajele de sticla, de lemn, pungile, sacii si tamburele.

Masinile de ambalat se impart, in general, in doua categorii : Masini de rulare ; Masini de umplut tuburi, cutii, saci, sticle. Se va considera ca s-a rezolvat problema transportului, a depozitarii si ambalarii atunci cand intr-o uzina chimica s-a realizat mecanizarea muncii manuale, transportul materialelor pe drumul cel mai scurt asigurand un flux continuu in fabricatie. Intr-o uzina chimica, traseele pentru transportul materialelor trebuie stabilite exact si trebuie sa existe, de asemenea, o coordonare a aparatelor de transport. Personalul uzinei trebuie instruit pentru a utiliza aceste aparate, evitandu-se astfel manipularile inutile si asigurandu-se o depozitare rationala a materialelor. Se va face o planificare si un control al transporturilor, verificandu-se costul cheltuielilor de personal si de material. Principiul de baza in tehnica transportului este ca materialul sa nu fie atins decat de personalul care urmeaza sa-l prelucreze.

5.4. Transportul, depozitarea si ambalarea materialelor folosite in tehnologie

a) Glucoza: glucoza lichida se ambaleaza in butoaie de lemn sau de metal, iar cea solida nearomatizata, in lazi de lemn captusite cu hartie de ambalaj sau alte materiale corespunzatoare. Tabletele de glucoza aromatizata se invelesc in hartie pergaminata si apoi in hartie velina. Pentru transport, tabletele de glucoza aromatizata se introduc in lazi de lemn captusite cu hartie de ambalaj. Glucoza se depoziteaza in magazii curate, aerisite si uscate, la temperatura de maxim 20sC si umiditatea relativa a aerului de maxim 80%. Transportul glucozei se face in vehicule acoperite, curate, uscate si fara miros strain. Fiecare transport va fi insotit de un certificat de calitate. b) Amoniac tehnic solutie: se livreaza in cisterne sau recipienti de hotel. c) Carbonat de calciu precipitat, tehnic: se ambaleaza in saci de hartie, curati, legati cu sarma. Se depoziteaza in locuri curate, ferite de umezeala, iar transportul produsului se face cu mijloace de transport curate si acoperite. d) Sulfat de amoniu: se ambaleaza in saci de hartie bitumata. Se depoziteaza in incaperi ferite de umezeala si caldura, iar transportul produsului se face cu mijloace de transport acoperite. e) Sulfat de magneziu tehnic: se livreaza in saci de hartie captusiti in interior cu o folie de polietena sau in alte ambalaje, cu conditia asigurarii integritatii produsului. Se depoziteaza in incaperi curate si uscate, ferite de umezeala. Pentru transport, se vor utiliza mijloace de transport acoperite, curate si lipsite de miros. f) Sulfat de zinc tehnic : se livreaza in saci de hartie cu sac de polietena in interior. Se depoziteaza in incaperi uscate, in ambalajele in care se livreaza. Pentru transport se vor utiliza mijloace de transport acoperite.

Capitolul 6. Norme de protectie a muncii si norme P.S.I

6.1. Tehnica securitatii si igiena muncii

Protectia muncii cuprinde totalitatea masurilor luate pentru a se asigura tuturor oamenilor muncii conditii bune de munca, pentru a-i feri de accidente si boli profesionale.Protectia muncii face parte integranta din procesul de munca. In industria chimica problema protectiei muncii este deosebit de importanta deoarece pe langa factorii de periculozitate comuni cu alte ramuri industriale- elemente mobile(periculoase) ale utilajelor, actiunea curentului electric, degajari importante de caldura, zgomote si trepidatii- intervin si numerosi factori specifici industriei chimice, cum ar fi: - degajari de substante toxice; - prezenta frecventa a unor substante inflamabile; - posibilitatea exploziilor cauzate de amestecuri explosive; - operatii cu lichide agresivecare pot provoca arsuri chimice; - temperature ridicate. Protectia muncii are urmatoarele trei aspecte: - Protectia juridica a muncii reprezentata de legislatia referitoare la protectia muncii, legislatie constituita in principal din: - codul muncii; - legea nr. 5/1965 cu privire la protectia muncii; - HCM nr. 2896/1966 cu privire la accidentele de munca; - Legea nr. 1/1970 privind organizarea si disciplina muncii; - Decretul 400/1981; - Alte HCM-uri, decrete elaborate de consiliul de stat, instructiuni si ordine elaborate de ministere. - Protectia sanitara a muncii cuprinde masurile pentru crearea unor conditii fiziologice normale de munca si de suprimare a riscului imbolnavirilor profesionale.

- Protectia tehnica a muncii consta in masuri tehnice si organizatorice pentru usurarea muncii si prevenirea accidentelor de munca. In baza legislatiei, Ministerul Muncii impreuna cu Ministerul Sanatatii au stabilit Norme republicane de protectie a muncii care cuprind cadrul general de tehnica a securitatii muncii si normele de igiena a muncii, ambele obligatorii pentru toate ministerele. Conducerile intreprinderilor si institutiilor elaboreaza la randul lor Instructiuni de protectie a muncii pentru conditiile de lucru particulare si specifice unor sectii, ateliere si locuri de munca. Instruirea oamenilor muncii este obligatorie.Nici un angajat nu poate fi primit la un loc de munca si pus sa lucreze decat dupa ce a fost instruit si s-a facut verificarea insusirii cunostintelor.

La proiectarea intreprinderilor chimice este necesar sa se determine in prealabil categoria de pericol pe care il prezinta procesul tehnologic proiectat, dupa care se trece la amplasarea cladirilor si a constructiilor pe planul general de ansamblu.La amplasarea cladirilor din industria chimica trebuie sa se evite terenurile prea apropiate de regiuni sau cartiere unde exista pericole de incendii sau de explozDistanta care trebuie prevazuta este functie de categoria de pericol de incendiu a fabricatiei si gradul de rezistenta la foc al cladirilor.Una din masurile de baza ale tehnicii securitatii la amplasarea cladirilor industriale este izolarea corecta a cladirilor, a constructiilor si depozitelor. Normele departamentale de protectie a muncii elaborate de Ministerul Industriei Chimice cuprind atat normele de tehnica securitatii muncii cat si normele de igiena a muncMasurile de tehnica securitatii muncii se pot clasifica in: - Masuri generale care se refera in principal la alegerea amplasamentului intreprinderii, la planul general al acesteia si la protectia muncii in cladirile industriale; - Masuri speciale care se refera la particularitatile tehnice ale proceselor; - Masuri de protectie individuala a muncitorului care se refera la folosirea echipamentului si materialelor de protectie individuala prevazute de norme. In industria chimica se aplica atat normele specifice acestei industrii cat si norme de tehnica securitatii muncii pentru activitati nespecifice industriei chimice, dar care exista in diverse unitati chimice. Normele de tehnica securitatii muncii elaborate de M.I.Ch. sunt grupate in 6 capitole: a)-tehnica securitatii muncii la instalatii, aparate si masini; b)-tehnica securitatii muncii la intretinere, reparatii si interventii; c)-tehnica securitatii muncii pentru procese fizice si chimice; d)-tehnica securitatii muncii la depozitare; e)-tehnica securitatii muncii la manipulare, ambalare si transport; f)-tehnica securitatii muncii in laboratoare. In continuare se vor prezenta in linii generale problemele tratate in fiecare din capitolele mentionate. 6.1.1.Tehnica securitatii muncii la instalatii aparate si masini Acest capitol trateaza problemele de securitatea muncii la organele de masini in miscare, la echipamentul de transmitere si dispozitivele de actionare a utilajelor, la conducte si armature, aparate de masura si control, vase de reactie, utilaje sub presiune, aparate pentru operatii unitare (centrifuge, extractoare, uscatoare, filter, malaxoare, etc.) precum si la principalele utilaje din industria celulozei si hartiei. In prealabil, la acest grup de norme se precizeaza ca proiectantul este obligat sa acorde tot atata importanta realizarii conditiilor de securitate cat acorda si parametrilor tehnici si economici si aparatului sau instalatiei proiectate.El este obligat ca dintre doua instalatii similare sa aleaga cu precadere pe aceea care prezinta cele mai bune conditii de securitate si cele mai usoare conditii de munca. 6.1.2.Tehnica securitatii muncii la intretinere, reparatii si interventii In acest capitol se dau norme cu character organizatoric si tehnic.Pentru orice interventie sau reparatie se intocmeste un plan de actiune cu sarcini defalcate pe angajati, plan care cuprinde toate masurile de protectie a muncPentru locurile de munca unde exista pericol de incendiu si explozie se intocmeste de catre seful sectiei permisul de lucru cu foc ,aprobat de inginerul sef.Pentru lucrarile la instalatii sub presiune, intrarea in vase de reactie, rezervoare, instalatii in care se prelucreaza substante foarte agresive este necesar in plus permisul de lucru, intocmit

de seful sectiei.Este strict interzisa inceperea oricarei lucrari de reparatie si interventie fara a se face in prealabil tuturor celor ce executa operatia respectiva instructajul de protectie a munc 6.1.3.Tehnica securitatii muncii pentru procese fizice si chimice Dupa un capitol introductiv in care se precizeaza ca absorbtia noxelor de orice gen se face la locul unde se produce le, fiind contraindicata absorbtia lor prin ventilatie generala si ca alimentarea utilajelor cu substante toxice, corozive, iritante, inflamabile si cele care degaja praf se va face mecanizat si etans, se trateaza: - tehnica securitatii munciila efectuarea unor procese chimice unitare (halogenari, sulfonari, esterificari, polimerizari, etc); - tehnica securitatii muncii la efectuarea unor operatii fizice unitare (extractie, decantare, centrifugare, filtrare, absorbtie, distilare si rectificare, uscare, etc.); -tehnica securitatii muncii la operatii cu substante toxice, inflamabile, explosive, corozive, caustice. 6.1.4.Tehnica securitatii muncii la depozitare Se dau norme referitoare la amplasarea si depozitarea substantelor toxice, inflamabile si explozive. Este interzisa depozitarea in aceeasi incapere a substantelor toxice, inflamabile si explosive,cu diverse materiale. De asemenea, substantele chimice ar putea reactiona unele cu altele degajand substante periculoase. Ele trebuiesc depozitate la distanta unele de altele in incaperi separate. 6.1.5.Tehnica securitatii muncii la mamipulare, depozitare si transport Deoarece statisticile arata ca 35% din accidentele de munca se inregistreaza la operatiile de manipulare, aceasta problema prezinta o deosebita importanta.Normele prevad ca aceste operatii sa se execute numai sub supravegherea unui conducator al procesului de munca instruit special in acest scop.Lucrul tinerilor sub 16 ani la operatiile manuale de incarcare, descarcare si transport este interzis. 6.1.6.Tehnica securitatii muncii in laboratoare Din ansamblul normelor referitoare la aceasta problema, norme care se refera la ventilatie, manipularea sticlariei, a dispozitivelor de incalzire, a utilajelor sub presiune, a substantelor toxice, inflamabile, etc., trebuie retinuta obligatia generala, pentru munca de cercetare, de a se aplica si respecta in toate fazele metodologia de lucru adecvata privind protectia munc In ceea ce priveste masurile de protectie individuala ale muncitorului, pentru a completa masurile tehnice luate in instalatii este necesar sa se foloseasca echipamentele si materialele de protectie individuala prevazute de normative.Toti cei care conduc si controleza procesele de productie sunt obligate sa nu permita executarea nici unei operatii inainte de a verifica dotarea fiecarui muncitor cu toate 6.1.7. Norme de igiena a muncii Normele de igiena a muncii se refera la principalii factori profesionali nocivi din mediul de productie. Ele stabilesc valorile limita sau optime ale acestor factori, valori care, respectate, previn imbolnavirile profesionale si asigura conditii normale de lucru. In aceste norme sunt tratate probleme referitoare la efortul fizic, microclimatul incaperilor de lucru, precum si prevenirea imbolnavirilor profesionale si a accidentelor de munca provocate de gaze, vapori si pulberi. Se dau concentratiile maxime admise in atmosfera zonei de lucru, in mg/m 3 aer, la cca. 400 substante, de asemenea norme referitoare la iluminat, nivel de zgomot si vibrat sortimentele de echipament si materiale necesare.

6..2. Masuri P.S.I. Incendiile si exploziile se produc numai atunci cand sunt prezente in cantitati suficiente trei elemente:substanta combustibila, oxigenul si caldura. Cauzele principale ale incendiilor si exploziilor se datoresc, pe de o parte aprinderii si autoaprinderii, iar pe de alta parte nerespectarii parametrilor procesului tehnologic, lipsei de instructaj, de atentie, de curatenie, etc. Exploziile pot fi provocate de depasirea instantanee a limitei de rezistenta a peretilor vaselor (cazane, rezervoare, etc.) produsa de presiunea gazelor sau vaporilor. Exploziile produse de gazelle combustibile, vapori sau praf, in amestec cu aerul sau oxigenul au loc numai la anumite concentratii, care variaza cu presiunea si temperatura amestecului. Incendiul izbucneste ca urmare a depozitarii in sectii a unor substante usor inflamabile sau explozive, care depasesc cantitatile admise, precum si a depozitarii lor necorespunzatoare in ambalaje deteriorate, langa sursa de caldura si lipsa de supraveghere a lor. Cea mai fracventa cauza de aprindere este flacara directa produsa de diferite surse. Caldura degajata in cursul unor reactii chimice exoterme, poate constitui deasemenea, o sursa de aprindere provocand incendiul. Deosebit de periculos este contactul acizilor concentrate (H 2SO4, HNO3) cu substantele combustibile. In timpul desfasurarii proceselor tehnologice sunt cazuri cand incendiile sau exploziile se produc datorita aprinderii substantelor combustibile, fie de la o scanteie electrica, fie prin incalzirea exagerata a conductorilor electrici si aprinderea materialului izolant. Incendiile mai pot fi provocate, de asemenea, din cauza electricitatii statice si a descarcarilor atmosferice. Pentru a cunoaste masurile necesare care trebuie luate in vederea prevenirii incendiilor si exploziilor se impune studierea amanuntita a tuturor locurilor de munca, din punctul de vedere al posibilitatilor de izbucnire a incendiilor si exploziilor, spre a putea lua masurile necesare pentru evitarea lor. S-a aratat ca izbucnirea incendiilor sau exploziilor se datoreste prezentei a trei elemente: substanta combustibila, sursa de caldura si aerul sau oxigenul. Lipsa sau reducerea unuia din cele trei elemente face ca incendiul sau explozia sa nu mai aiba loc sau sa se termine repede, fara urmari grave. Deci, masurile generale prevenirii incendiilor sau exploziilor sunt, in principal, urmatoarele: -Evitarea sau reducerea substantei combustibile; -Evitarea sau reducerea sursei de caldura; -Evitarea sau reducerea oxigenului, aerului sau a substantelor cu un continut mare de oxigen; -Impiedicarea contactului substantei combustibile cu sursa de caldura; -Controlul permanent al surselor de caldura si cunoasterea caracteristicilor periculoase ale substantelor combustibile; -Masuri de siguranta pentru ecranarea sursei de caldura si oprirea accesului substantelor combustibile in eventuala zona de ardere; -Controlul automat al concentratiilor de oxigen in zona de pericol. 6.2.1.Materiale folosite pentru stingerea incendiilor

Materialele stingatoare sunt acele materiale care, folosite intr-un anumit mod in zona de ardere, actioneaza defavorabil asupra conditiilor necesare arderii, oprind arderea.Materialele stingatoare se folosesc fie in stare gazoasa, lichida sau solida, fie sub forma unor amestecuri de lichide cu gaze sau lichide cu substante solide, insa procesul si rapiditatea aplicarii sunt factorii hotaratori al stingerii incendiilor. Cele mai raspandite substante stingatoare sunt:apa, aburul, solutiile apoase de saruri, CCl4, CO2, spuma chimica si macanica, prafurile stingatoare. Apa. Folosirea apei la stingerea incendiilor se bazeaza pe proprietatile ei de racire si izolare termica.Proprietatile de racire ale apei se datoresc capacitatii de absorbtie a caldurii si caldurii latente de vaporizare, care au o valoare importanta.Racirea suprafetelor aprinse va fi cu atat mai mare cu cat cantitatea de apa transformata in vapori va fi mai mare. Desi apa poseda astfel de calitati pentru stingerea incendiilor, domeniul ei de utilizare in acest scop este limitat.Produsele petroliere si dizolvantii organici nemiscibili cu apa, avand o densitate mai mica, plutesc la suprafata ei si ard in continuare.Apa folosita la stingerea incendiilor contine saruri, deci este buna conducatoare de electricitate. Din acest motiv folosirea ei la stingerea incendiilor produse in instalatii de inalta tensiune trebuie sa se faca utilizandu-se dispozitive speciale. Unele substante reactioneaza violent cu apa, producand o degajare mare de caldura si de gaze, care pot da nastere incendiilor si exploziilor. La stingerea incendiilor se folosesc jeturi de apa compacte sau pulverizate. Aburul. Stingerea incendiilor cu ajutorul aburului se bazeaza pe reducerea concentratiei de oxigen din zonele de ardere.Folosirea aburului pentru stingerea substantelor gazoase, lichide si solide se face in locurile unde exista instalatii de cazane si sisteme fixe de stingere. In afara de reducerea concentratiei de oxygen din zona de ardere, la stingerea incendiilor contribuie si efectul mechanic al jetului.Acest procedeu se foloseste la stingerea incendiului la coloanele de rectificare, la conducte, etc. Solutii apoase de saruri. In scopul imbunatatirii calitatii apei se folosesc adaosuri:CaCl 2, Na2SO4, (NH4)2SO4, etc. Prin evaporarea apei, aceste solutii formeaza la suprafata materialului aprins un strat de sare care se topeste, iar in unele cazuri se dezagrega.In urma dezagregarii se degaja gaze necombustibile care reduce concentratia oxigenului in zona de ardere, contribuind astfel la stingerea incendiului. Solutiile de saruri se folosesc la stingatoarele manuale. Tetraclorura de carbon. Are proprietatea de a stinge focul, insa folosita in incaperi inchise poate da nastere fosgenului, gaz foarte toxic.In scopul reducerii formarii fosgenului se adauga in CCl 4, diferite substante ca: aniline, ammoniac, benzen, etc. Tetraclorura de carbon se utilizeaza la stingerea incendiului la instalatii electrice de inalta tensiune, la motoarele cu ardere interna, la substantele lichide si solide pe o suprafata mica, etc. Bioxidul de carbon. Nu arde si este un slab conducator de electricitate, ceea ce permite folosirea lui la stingerea incendiilor in instalatiile electrice.Introdus in zonele de ardere, CO2 dilueaza atmosfera, reducand concentratia substantei combustibile si a oxigenului din atmosfera de ardere, micsorand sau oprind arderea. Bioxidul de carbon nu poate opri arderea pentru o serie de substante ca bumbacul, peliculele cinematografice, etc., care pot sa arda si in mediu inert. Spumele stingatoare. Spuma este formata din bule de gaz inconjurate de un strat subtire de lichid.In present se folosesc doua feluri de spume: chimice si mecanice (aeromecanice).Spuma chimica este rezultatul unei reactii chimice si se compune din trei bule de gaz (CO2) care au un invelis din solutii apoase de saruri.Spumele mecanice se

realizeaza prin amestecarea mecanica a solutiei.Densitatea spumelor este mica si in consecinta plutesc pe suprafata lichidelor usoare separand flacara de substanta combustibila. Prafuri stingatoare. In compozitia acestor prafuri intra diferite saruri (CaCO 3, bicarbonate de sodium, alaun, etc.) substante care preintampina aglomerarea sarurilor (talc, kiselgur, praf de azbest) si substante care contribuie la topirea lor( NaCl, CaCl2). Prafurile stingatoare impiedica dezvoltarea arderii prin acoperirea suprafetelor solide aprinse cu un strat izolator care prin topirea sari contribuie mai activ la stingerea incendiului. Degajarea unor saruri, produce gaze incombustibile care contribuie la stingerea incendiului. Stingatoarele de incendiu cu praf sunt actionate prin presiunea unui gaz incombustibil (CO 2), jetul de praf actionand mecanic asupra zonei de ardere. Jeturile de praf avand o conductivitate electrica mica pot fi utilizate pentru stingerea incendiilor instalatiilor electrice

GENERALITATI PRIVIND ANTIBIOTICE Antibioticile sunt substante chimice organice produse de microorganisme sau obtinute prin sinteza sau semisinteza care in doze foarte mici, inhiba dezvoltarea microorganismelor patogene. Dupa descoperirea microbilor de Pasteur, s-a observat ca unele specii microbiene se apara de alte specii prin elaborarea unor substante chimice nocive. Acest fenomen este numit antibioza, iar substantele chimice rezultate din metabolismul celular vii poarta numele de antibiotic. Primul care a semnalat, in 1885, actiunea inhibanta a substantelor elaborate de microorganisme a fost savantul roman Victor Babes; tot el a sugerat ca aceste substante ar putea fi utilizate in scop terapeutic pentru distrugerea agentilor patogeni. Aceste fapte constituie o anticipatie geniala a savantului roman care, cu 50 de ani inaintea descoperiri epocale a lui Fleming (obtinerea penicilinei), a intuit efectele practice ce le-ar putea avea pentru terapeutica antagonismul microbian. Introducerea, in 1941, in practica medicala a antibioticelor de biosinteza caracterizate prin aspectul larg de actiune, eficacitate ridicata si tocsicitate redusa, constituie cea de-a doua etapa extrem de importanta in dezvoltarea chimioterapiei. Succesele exceptionale obtinute in tratarea maladiilor infectioase cu ajutorul

penicilinei G au declansat cercetari foarte minutioase pentru a gasi noi antibiotice de biosinteza. Asa se explica faptul ca intr-un interval extreme de scurt sant descoperite si introduse in terapeutica penicilina V, tetraciclinele, streptomicina, grizeofulvina, eritromicina,oleandomicina, iar mai tarziu cefalosporinele si rifampicina. Utilizarea excesiva a penicilinei G a generat insa fenomenul de penicilino-rezistenta, fenomen manifestat prin pierderea eficacitati terapeutice. Acest fapt, cuplat cu slaba stabilitate a penicilinei in mediul acid si la actiunea penicilinei, a determinat extinderea cercetarilor privind obtinerea de noi antibiotice prin semisinteza si sinteza.

Memoriu justificativ Tema lucrarii de fata este: antibiotice de biosinteza. Antibioticele sunt substante chimice organice produse de microorganisme sau obtinute prin sinteza sau semisinteza care in doze foarte mici, inhiba dezvoltarea microorganismelor patogene. Analiza antibioticelor dateaza cu multi ani in urma prin descoperirile lui Pasteur, Fleming, la care nu ar trebui sa neglijam contributia savantului roman Victor Babes. Introducerea antibioticelor de biosinteza in partea medicala s-a facut prin 1941, constituind a doua etapa importanta in descoperirea chimioterapiei. Cele mai representative sunt Penicilina G si V . In Cap. IV am propus diverse criterii de clasificare ale antibioticelor. Cap. V Procesele tehnologice de fabricare a penicilinelor de biosinteza descriere etapele tehnologice de fabricatie a acestora: ~izolarea tulpinelor de microorganisme ~selectia tulpinelor cu productivitate mare ~izolarea produselor de biosinteza ~cultivarea microorganismelor pe un mediul adecvat ~stabilirea spectrului de actiune si al structurii chimice ~elborarea procedeelor industriale de obtinere si preparare a penicilinelor Penicilinele de biosinteza sunt substante chimice ce au un system biciclic, asa cum este descris in Cap. V.2. Ca medii de cultura care contin hidrati ce carbon, saruri minerale, apa etc; mediul sterilizat cu ajutorul aburului direct. Biosinteza penicilinei este exoterma din cauza oxidarii hidratilor de carbon care contin sursa principala de energie. Biosinteza penicilinei este aeroba, alimentarea cu oxigen este unul din factorii decisivi. Etapa urmatoare este fermentatia biochimica care se realizeaza in trei etape: in inoculator, in intermediar si in regim. Fermentatia se desfasoara la diversi parametrii, de exemplu 26C, temperature de fermentatie 120-125 ore, continutul de zahar trebuie sa scada la 0.2-0.6% iar concentratia penicilinii la 1-1.8%. Un rol important in biosinteza o au precursorii deoarece ei pot dirija acest proces spre o anumita penicilina. Ultima etapa este extractia penicilinelor, fiind recomandata extractia din solutia apoasa. In Cap. VI am prezentat N.P.M si P.S.I specifice fabricarii acestor peniciline. Ultimul capitol, Concluziile denota important ape care aceste peniciline o au pentru sanatatea omului.

CAP I. CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR

Numarul mare de antibiotice cunoscute in prezent a pus problema clsificarii acestor produse. S-a propus urmatoarele criterii de clasificare:

1. Dupa originea microorganismului producator: antibiotice produse de bacterii gramicidina bacitracina polimixinele antibiotice produse de actinomicete: streptomicina neomicima kanamicina nistatina antibiotice produse de fungi penicilina grizeofulvina

2. Dupa structura chimica: - antibiotice cu structura alifatica, aromatica - heterociclica 3. Dupa biogeneza: - antibiotice derivate de aminoacizi din unitati acetat din glucide

4. Dupa actiunea farmacologica: antibiotice antibacteriene antibiotice antituberculoase antibiotice antivirotice antibiotice anticanceroase antibiotice antifungice

CAP II. Procesele tehnologice de fabricare a penicilinelor de biosinteza

1. Generalitati In fabricarea tehnologiilor de fabricatie a antibioticelor de biosinteza se pargurg urmatoarele etape: - izolarea tulpinelor de microorganisme - selectia tulpinelor cu productivitate maxima - izolarea produsului de biosinteza - cultivarea microorganismelor pe un mediu adecvat - stabilirea spectrului de actiune si a structurii chimice - elaborarea procedeelor industriale de obtinere si preparare a penicilinelor Tulpinele de microorganisme izolate din sol, aer, fructe, cereale, sunt supuse unui proces de selectie prin tratare cu agentii mutageni pentru obtinerea unor suse cu productivitate ridicata, care sunt apoi cultivate pe un mediu nutritiv adecvat, in vederea obtinerii produsului dorit. Exprimarea continutului de antibiotic din mediul nutritiv se face in unitati internationale ( UI ) sau unitati gravimetrice ( /mg). Unitatea internationala de activitate reprezinta cantitatea minima de antibiotic pur, necesara pentru a inhiba o cultura de 18 ore de stafilococ auriu. Pentru determinarea continutului de antibiotic din biomasa se folosesc metode microbiologice, chimice si fizico-chimice, iar separarea produsului se face prin extractie lcihid-lichid, adsorbtie, separare cu schimbatori de ioni, atomizare, cromotografie. In tehnologia de obtinere a antibioticelor exista un numar de etape commune si etape specifice fiecarui produs. Etapele comune vor fi prezentate la tehnologia de biosinteza a penicilinelor, iar etapele specifice vor fi descrise la prezentarea produselor respective.

2. Structura generala a penicilinelor

Penicilinile de biosinteza fac parte din categoria antibioticelor

-lactamice.

Penicilinele de biosinteza sunt substante chimice produse de diferite specii de micoorganisme din clasa Penicillium si Aspergillus printre care: P. cryragenum, P. notatum, A. niger.

Penicilinile contin in structura lor un sistem biciclic tiazolidin--lactatic si corespund urmatoarei structuri generale:

S CH3 R-CO-NH-CH CH C NH3 O=C N C Structura generala a penicilinei COOH

Din lichidul de cultura a microorganismelor producatoare de penicilina s-au separate si identificat mai multe tipuri de peniciline care difera prin natura radicalului R. In practica terapeutica a fost introdusa Penicilina G sub forma de sare de Na, K, saruri cu amine, si Denumirea penicilinei Structura radicalului Denumirea radicalului 1 Penicilina F Penicilina dihidro F 2 CH3-CH2-CH=CH-CH2 CH3-(CH2)4 3 2-pentenil 2-pentil Activitate [UI/mg] 4 1500 1670

Penicilina G Penicilina X Penicilina K Penicilina V Penicilina O Penicilina S

C6H5-CH2HO-C6H4-CH2 CH3-(CH2)5-CH2 C6H5-O-CH2CH2=CH-CH2-S-CH2 CH3-C=CH-CH2-S-CH2

benzil p-hidroxi-benzil n-heptil fenoximetil alilmercoptometil 3-clor-2-butenil-tiometil

1667 900 2300 1630 -

Cl Penicilina V sub forma de acid liber sau sare de Na si K.

Toate penicilinile sunt extrem de sensibile la atacul agentilor nucleofili, electrofili si oxidanti, iar ca produse finale ale degradarii nucleofile si electrofile sunt penicilina si fenilaldehidele, rezulta ca penicilinele au in structura lor ca parti componente penicilina cu , -dimetilcisteina si acid penaldic. CO2 R-CO-NH-CH-CHOR-CO-NH-CH2-CHO COOH

Confirmarea acestei concluzii s-a facut prin sinteze partiale precum si prin realizarea integrala a sintezei Penicilinei G si Peniciline V. Randamentul total al procesului de obtinere a Penicilinei G fiind sub 1%, procesul are numai importanta teoretica, confirmand structura chimica a penicilinelor. O sinteza mai practica a fost realizata in 1957, de catre Sheehan si Henery-Logan, care au obtinut Penicilina V conform reactiilor prezentate. Studiile privind stabilirea structurii penicilinelor prin sinteza si de sinteza au stabilit ca ciclul -lactamic asigura activitatea antibacteriana, iar restul acil (R), din catena laterala poate avea diverse structuri, fara a influienta hotarator activitatea produsului.

3. Proprietatile Penicilinelor G si V Benzilpenicilina (Penicilina G) Este o substanta cristalina, cu punct de topire 80C, solubila in apa si solventi organici, avand trei atomi de carbon asimetrici (C 3, C5, C7). Produsul este utilizat sub forma de saruri de sodium (Na) sau potasiu (K), fiind active bacteriostatic si bactericid fata de bacilli si coci gram-pozitivi. Fenoximetilpenicilina (Penicilina V) Este o substanta alba, utilizata sub forma de acid liber, avand punct de topire 118-120C, insolubila in apa, solubil in solventi. In mediul bazic viteza de inactivare a Penicilinei V este de 2.2 ori mai mare decat viteza de inactivare a Peniciliei G. Aceste date sunt luate in consideratie atunci cand se trateaza problema separarii penicilinelor apoase obtinute de la fermentatie.

4. Tehnologia de biosinteza a penicilinelor G si V

Tehnologia obtinerii Penicilinei G, comuna in mare parte tuturor antibioticelor de biosinteza, cuprinde urmatoarele faze: Pregatire mediilor de cultura si sterilizarea lor Fermentatia biochimica Filtrarea solutiilor nutritive Separarea si purificarea penicilinelor

1. Pregatirea si sterilizarea mediilor Mediile de cultura utilizate pentru cresterea microorganismelor producatoare de antibiotic trebuie sa contina hidrati de carbon, saruri minerale, surse de azot organic si anorganic, precursori si apa, toate intr-o proportie bine echilibrata, conform reactiei Deoarece sterilizarea mediului de cultura se face cu abur direct, cantitatea de apa ce se adauga la prepararea mediului este mai mica cu o cantitate egala cu cea a aburului ce condenseaza in timpul sterilizarii. Pregatirea mediilor de cultura se face in aparate destinate acestui scop, prevazute cu agitatoare, conducte pentru apa, serpentine de incalzire respective de racire. In aceste aparate se introduce apa, se incalzeste la 50-60C, apoi se adauga extractul de porumb principala sursa de aminoacizi, si se fierbe timp de 30-60 min. Dupa aceasta, solutia se raceste la 50-60C si se adauga restul componentilor mediului in urmatoarea ordine: CaCO3, NH4NO3, Na2SO4, MgSO4, MnSO4, KH2PO4, ZnSO4, lactoza si glucoza. Uneori glucoza si lactoza se dizolva si se sterilizeaza separate, pentru a se evita formarea bazelor Schiff, prin reactia gruparilor carbonil din zaharuri cu gruparea aminica din aminoacizi. Mediul astfel preparat se sterilizeaza direct in fermentator sau in instalatia de sterilizare formate din coloana de sterilizare, mentinator si racitor prin incalzire la 124-126C, mentinerea la aceasta temperatura 10-12 min. si apoi racire la 60-65C, temperatura la care mediul steril este trimis in fermentatorul intermediar si cel de regim. Procesul de sterilizare a mediului de cultura are o importanta deosebita deoarece fermentatia fiind aseptica, se impune distrugerea totala a oricaror forme vegetative de mocroorganisme, de fapt necesita temperature mai ridicate deoarece formele vegetative au rezistenta termica mai mare. Dar cresterea temperaturii declanseaza reactii de degradare a componentilor mediului de cultura, generand inhibatori ai procesului de biosinteza. Cum degradarea mediului este favorizata mai mult de factorul timp, iar sterilizarea de factorul temperatura, solutia optima se obtine prin conducerea procesului de sterilizare la temperatura mai ridicate la un timp mai scurt. Pentru aceasta se recomanda utilizarea unor instalatii care sa lucreze la temperature de 140-145C si care necesita un timp de sterilizare de cateva secunde.

Pentru a evita supraincalzirile si degradarea mediului, procesul de sterilizare este condus cu calculator analogic. 2. Fermentatia biochimica. Este etapa urmatoare in fluxul tehnologic ce se realizeaza in trei etape: fermentatia in inoculator fermentatia in intermediar

fermentatia in regim, care corespund anumitor studii de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, in inoculator se realizeaza aclimatizarea microorganismelor la noile conditii de dezvoltare, in intermediar are loc acumularea de masa celulara, iar in regim se desavarseste procesul de crestere a masei celulare si de elaborare a penicilinei. Aceasta etapa este putin ideala deoarece elaborarea de penicilina incepe din intermediar, ca rezultat al distributiei varstelor microorganismelor. Eficacitatea procesului este determinat de urmatorii factori: ~conformatia genetica a tulpinii producatoare de penicilina; ~folosirea unui echilibru rational intre componentii mediului de cultura; ~dozarea corecta a raportului dintre glucoza si lactoza; ~dozarea corecta a precursorului; ~asigurarea necesara de substante minerale; ~ asigurarea necesara de oxigen; ~mentinerea temperaturii si a pH-ului la valorile prescrise. Din datele existente in literatura se poate coincide ca pH-ul afecteaza vitezele reactiilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare si gradul de ionizare a sarurilor; valoarea optima a pH-ului este cuprinsa intre 6,4-7,0. Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza deoarece, in dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de surse de hidrati de carbon, azot, substante minerale si precursori. Biosinteza unei molecule asa de complexe, ca penicilina, necesita un flux de energie din exterior; procesul de biosinteza a penicilinei fiind endoterm se poate realiza numai daca se desfasoara simultan si procese de oxidare a hidrantilor de carbon care constituie sursa principala de energie. Oxidarea hidratilor de carbon elibereaza insa o cantitate de energie mai mare decat este necesar procesului de biosinteza propriu-zis, astfel incat pe ansamblul procesului de fermentatie este exoterm, eliberandu-se din exterior, in perioada de crestere a masei celulare, 1600 kJ/mol glucoza, iar in perioada de elaborare a penicilinei 66kJ/litru mediu de cultura. Cum viteaza de utilizare a hidratilor de carbon se inscrie in ordinea glucoza~acid lactic~lactoza, rezulta ca in faza de crestere a masei celulare se consuma glucoza, iar in perioada de formare a penicilinei se consuma lactoza. Prin urmare, mediul de cultura trebuie sa asigure necesarul de glucoza si lactoza pentru desfasurarea normala a intregului proces de biosinteza. Prezenta substantelor minerale este vitala in procesul de crestere a masei celulare, deoarece ele efectueaza direct permeabilitatea membranei celulare si echilibrul ionic si activeaza sisteme enzimatice. Procesul de biosinteza a penicilinei fiind aerob, alimentarea cu oxigen este unul din factorii decisive, iar dizolvarea acestuia trebuie realizata cu o astfel de viteza, incat sa asigure necesarul de oxigen pentru viteza maxima de crestere a masei celulare. Pentru intensificarea procesului de dizolvare a oxigenului in lichidul de cultura, se recomanda barbotarea aerului si agitarea mediului cu agitatoare mecanice care

disperseaza bulele de aer si intensifica transferul de masa. Viteza de dizolvare a oxigenului creste cu turatia agitatorului, dar acesta nu poate depasi anumite limite deoarece se ajunge la deteriorarea mecanica a biomasei. Mecanismul de transfer al oxigenului din bula de aer la celula in sistem eterogen gaz-lichid-solid implica urmatoarele etape: difuzia oxigenului molecular prin filmul de aer dizolvarea oxigenului la interfata gaz-lichid difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid difuzia oxigenului solvit in intreaga masa difuzia oxigenului solvit prin filmul de lichid de la suprafata microorganismelor difuzia oxigenului prin membrana celulara reactia de consum a oxigenului Din datele existente in literature de specialitate rezulta ca in sisteme eterogene gaz-lichid-solid, bine agitate, viteza procesului de transfer de masa al oxigenului este determinate de difuzia oxigenului dizolvat prin filmul de lichid. Acumularea biomasei conduce la scaderea pronuntata a coeficientului de transfer de masa. Pentru a reduce acest efect se recomanda intensificarea regimului hidrodinamic al fermentatorului prin cresterea vitezei de agitare. Criteriul care caracterizeaza intensitatea agitarii este timpul de amestecare, definit ca fiind timpul in care se realizeaza egalizarea concentratiei in toata masa de lichid din fermentator. Cunoasterea timpului de amestecare permite programarea regimului de agitare in functie de acumularea biomasei, creindu-se astfel conditiile unei fermentatii optime. In mod obisnuit turatia agitatorului in procesele de biosinteza variaza intre limitele 240-270 rot\min la inoculator, 150-180rot\min la intermediar si 110-130 rot\min la fermentatorul de regim, iar debitul orar de aer este 60-72 m3 aer \m3mediu de cultura. Areul utilizat in procesele de biosinteza trebuie sa fie perfect steril, iar sterilizarea lui se face prin filtrare de pe material fibros in filtru general si filtru individual montat la intrarea in fermentator. Parametrii procesului de sterilizare a aerului sant: temperatura punctului de roua a aerului comprimat, temperatura aerului dupa filtrul individual si la iesirea din barbotor. Deoarece filtrele umectate isi pierd capacitatea de a steriliza, se impune determinarea parametrilor aerului in procesul de sterilizare in functie de continutul de umiditate din atmosfera. Aceasta se poate realize prin utilizarea diafragmei ce coreleaza temperatura aerului sterilizat in functie de caderea de presiune in sistemul de sterilizare. Astfel, daca presiunea aerului este la iesirea din compresor este 2.5 atmosfere, iar d=20g/Kg aer, temperatura punctului de roua este temperatura=47.5C. Considerand ca acest aer se raceste initial la 75C si apoi trece prin filtrele generale si individuale unde caderea de presiune este 0.35 atmosfere, temperatura finala la iesire din filtru este de 60C, valoarea ce asigura buna functionare a instalatiei de sterilizare. Dirijarea procesului de biosinteza spre o anumita penicilina se face cu ajutorul unor substante ce constituie catena laterala a penicilinelor si poarta numele de precursori. Pentru Penicilina G se utilizeaza ca precursori fenilacetamina sau acidul fenaldic, iar pentru Penicilina V acidul fenoxiacetic. Precursorii se

adauga in portiuni, deoarece in concentratii mai mari de 0.1-0.2% sunt toxici pentru microorganismul producator de penicilina. Procesul de fermentatie se realizeaza la temperatura de 26C1, in fermentatoare cilindrice verticale constituite din otel inoxidabil, cu fund si capac sferic sudat, echipate cu agitator turbina sau elice, serpentine de racire, dispozitive de aerare, dispozitive sparge-val, termocuple, filtru individual pentru sterilizarea aerului tehnologic si dispozitive de transversare aseptica. Volumele fermentatoarelor- inoculator, regim si intermediar- cresc in raport zecimal. Trebuie mentionat faptul ca temperatura de 261C, este o valoare de compromis, deoarece ea nu corespunde nici vitezei maxime de formare a penicilinei si nici celei de crestere a masei celulare. Temperatura optima pentru cresterea masei celulare este de 30C, iar pentru elaborarea penicilinei de 24C. In practica insa este foarte greu de separat aceste faze, mai ales in procesele discontinue, fapt pentru care s-a adoptat valoarea 261C. Fermentatia dureaza 120-125 ore si se considera terminata atunci cand continutul de zahar scade la 0.2-0.6 %, iar concentratia penicilina este de 1-1.8 %. Eatapa fermentatie Inoculator Intermediar Regim 261 261 261 de Temperatura [C] Agitarea [rot/min] 270 170 120 Debit aer [l/l mediu min] 1.0 1-1.2 0.6-1.0 1.2-1.3 1.2-1.3 1.2-1.3 Presiunea [ata] Durata [h] 30-40 20-40 90-120 procesului

Parametrii procesului de biosinteza a penicilinei in cele trei stadii Filtrarea solutiei rezultate la fermentatie urmareste separarea micelului prin filtrare pe filtrul tambur de vid, iar solutia rezultata se raceste la 3-5C, dupa care se depoziteaza in rezervorul de asteptare, de unde este trimisa la extractii. 4. Separarea si purificarea penicilinelor. Pentru realizarea extractiei penicilinelor din solutie apoasa au fost studiate diferite tipuri de extractoare dintre care s-au detasat extractoarele centrifugale orizontale si cele verticale. Avantajele constructive si performante in extractie de extractoare orizontale au fost factorii decisivi care au determinat alegerea acestora pentru activitatea industriala.

Cheltuieli de intretinere

Capacitate volumetrica

Tipul de extractor

Extractor pulverizare Coloana cu

cu

5 4 4 3 2 1

5 5 5 3 2 2

1 2 2 4 3 5

2 4 2 3 4 3

2 2 2 4 3 5

3 3 3 1 0 5

talere Coloana cu umplutura Coloana cu talere pulsatorii Amestecator separator Extractor centrifugal

Obs: 0-nepotrivit, 1-slab, 2-satisfacator, 3-adecvat, 4-bun, 5-f. bun. Datorita diluatiei mari, separarea penicilinelor se poate realiza rentabil numai prin extractii repetate cu solventi, conform schemei : Solutie KH2PO4

Solutie H2SO4

Solvent

Solutie H2SO4

Solutie

Solvent

Solutie apoasa
Solvent epuizat Solutie apoasa epuizata

Utilizarea pt sisteme emulsionabile Solvent

Investitii

Eficacitate

Flexibilitate

Solutie conc. in penicil

nativa cu penicil Scheme de principiul la extractia penicilinelor

Solutie apoasa epuizata

Pentru separarea penicilinelor prin extractie lichid-lichid au fost studiati diferiti solventi, dintre care cel mai economic s-a dovedit a fi acetatul de butil. Studiindu-se echilibrul de faza la extractia penicilinei cu acetat de butil s-a constatat ca: in solvent organic trec mai multe molecule de penicilina acid nedisociate, fapt ce impune mediul puternic acid; intre moleculele de penicilina acid nu au loc asociatii moleculare in conditiile de extractie; in solvent organic penicilinile nu disociaza.

In aceste conditii echilibrul de baza la extractia penicilinei cu acetat de butil depinde numai de temperatura si de pH. Intr-un studiu mai recent se recomanda ca extractia penicilinei din solutie apoasa rezulta de la fermentatie. In solutia apoasa, penicilina este extrasa in acetat de butil, iar extractul organic se trateaza cu acetat de potasiu sau cu carbonat de potasiu. Penicilina sare precipitata se filtreaza si se spala cu butanol si cloroform. Solventii se recircula iar penicilina sare se dizolva in apa, se purifica cu carbune activ, dupa care se anhidrizeaza prin distilarea apei sub forma de azeotrop cu butanol, la un vid 4-6 mm Hg. Produsul solid obtinut se caracterizeaza prin puritate foarte mare si activitate biologica, conform normelor in farmacopee. Penicilina V se obtine prin aceleasi tehnologii ca si Penicilina G, diferentiate nesimnificativ constand in faptul ca la fermentatie se utilizeaza ca precursori acid fenoxiacetic, iar extractia se realizeaza in doua faze. Aceasta este posibil intrucat Penicilina V de acid este foarte putin solubila in apa, astfel incat dupa reextractie in apa si acidulare cu acid sulfuric diluat produsul precipita. Penicilina V separata se filtreaza, se purifica din solventi si se usuca la 35-40C, sub un vid de 100-200 bar.

CONCLUZII Antibioticele sant substante chimice organice produse de microorganise sau obtinute prin sinteza sau semisinteza care in doze foarte mici, inhiba dezvoltarea microorganismelor parogene. Introducerea, in 1941, in practica medicala a antibioticelor de biosinteza caracterizate prin spectru larg de actiune, eficacitate ridicata si tocsicitate redusa, constituie cea de-a doua etapa extrem de importanta in dezvoltarea chimioterapiei. Numarul mare de antibiotice cunoscute in prezent a pus problema clasificarii acestor produse : ~dupa originea microorganismului producaror antibiotice produse de bacterii antibiotice produse de actiomicete antibiotice produse de fungi

~dupa structura chimica ~dupa bioceneza ~dupa actiunea farmacologica Tulpinele de microorganisme izolatedin sol, aer, fructe, cereale, sant supuse unui proces de selectie prin tratarea cu agenti mutageni pentru obtinerea unor surse cu productivitate ridicata, care sant apoi cultivate pe un mediu nutritiv adegvat, in vederea obtineri produsului dorit. In tehnologia de obtinere a antibioticelor de obtinere a antibioticelor exista un numar de etepe comune si etepe specifice fiecarui produs. Etapele comune vor fi prezentate la tehnologia de biosinteza a penicilinelor iar etapele specifice vor fi descrise la prezentarea produselor respective. Din lichidul de cultura a microorganismelor producatoare de penicilina s-au separat si indentificat mai multe tipuri de penicilina care difera prin natura radicalului R. In practica terapeutica a fost introdusa penicilina G sub forma de sare de natriu, de potasiu, saruri amine si penicilina V sub forma de acid liber sau sare de natriu si potasiu. Mediile de cultura utilizate pentru cresterea microorganismelor produse de antibiotic trebuie sa contina hidrati de carbon, saruri minerale, precursori si apa, toata intr-o proportie foarte bine echilibrata, canform reactiei. Compozitia mediului de cultura are un rol hotarator in procesul de biosinteza deoarece, in dezvoltarea sa, microorganismelor au nevoie de surse de hidrati de carbon, azot, substante minerale si precursorii. Fermentatia biochimica este etapa urmatoare in fluxul tehnologic. Aceasta etapa este putin ideala deoarece elaborarea de penicilina incepe din intermediar, ca rezultat al distributiei varstelor microbiene. Extractia penicilinelor din solutia apoasa se realizeaza cu extractoare centrifugare. Antibioticele au actiune deosebit de importanta in tratarea organismelor de actiunea fermentatilor patogene care duc la slabirea lor si scaderea intensitati.

Bibliografie D. Oteleanu, V. Stanescu Prepararea medicamentelor in farmacie, Editura medicala Bucuresti, 1960 Vasile Oniscu Tehnologia fabricarii medicamentelor, Editura Didactica si Pedagogica Bucuresti,1988 www.medicamente.ro www.farmaline.ro

CUPRINS

MEMORIU JUSTIFICATIV CAP.I NOTIUNI DESPRE MEDICAMENTE CAI.II GENERALITATI DESPRE MEDICAMENTE CAP.III CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR CAP.IV PROCESELE TEHNOLOGICE DE FABRICARE A PENICILINELOR DE BIOSINTEZA CAP.IV.1 GENERALITATI CAP.IV.2 STRUCTURA GENERALA A PENICILINELOR CAP.IV.3 PROPIETATILE PENICILINELOR G SI V CAP.IV.4 TEHNOLOGIA DE BIOSINTEZA A PENICILINELOR G SI V CAP.V N.P.M. SI P.S.I. SPECIFICE ANTIBIOTICELOR DE BIOSINTEZA CAP.VI CONCLUZII CAP.VII BIBLIOGRAFIE CAP.VIII ANEXE