Caracterizarea rapid a bacteriilor prin

tehnica de spectrometrie de mas MALDITOF

Spectrometria de mas MALDI-TOF se aplic asupra compuilor organici termolabili

i non-volatili, cu mas molecular mare i se utilizeaz cu succes n multe domenii ce aparin
biochimiei i biologiei pentru analiza de proteine, peptide, glicoproteine, oligozaharide i
oligonucleotide. Acurateea masei depinde de tipul i de performanele spectrometrului de
mas, ns majoritatea instrumentelor moderne sunt capabile s msoare mase ncepnd de la
0,01% din masa molecular a probei, pn la cel puin 40,000 Da.
Tehnologia MALDI se bazeaz pe o metod de bombardare a moleculelor probei cu un
fascicul laser pentru a produce ionizarea acestora. Proba este amestecat n prealabil cu o
matrice compozit cu o putere de absorbie foarte mare, care transform energia laserului n
energie de excitare pentru prob. Matricea este o soluie compus din molecule cristalizate de
acid sinapinic, acid alfacianohidroxicinaminic, acid dihidroxibenzoic,etanol, acid trifloracetic
i ap bidistilat. n acest mod moleculele probei nu vor suporta energia direct a laserului,
care poate duce la descompunerea acestora. Majoritatea spectrometrelor de mas MALDI au
un laser de azot pulsatoriu cu o frecven de 337 nm (Alison E. Ashcroft, 1998).
De obicei bacteriile sunt crescute pe medii de cultur naintea analizei spectrometrice.
Dei acest factor ar putea fi considerat un dezavantaj, trebuie ns luat n considerare faptul c
i alte metode moleculare de detecie au ca cerin culuri preliminare nainte de efectuarea
analizei. Tehnica MALDI furnizeaz o ptrundere unic n biologia bacterian i chimie,
bazat pe detectarea unor anumite substane chimice sau pe msurarea schimbrilor de natur
chimic ca rspuns la influenele mediului.
La scurt timp dup ce MALDI a fost introdus ca tehnic de spectrometrie ionizant, a
nceput s fie utilizat pentru studierea biopolimerilor bacterieni. Primele studii au avut ca
obiect de studiu Escherichia coli, o bacterie foarte comun, care continu sa fie unul dintre
cele mai studiate i uzitate organisme din ziua de azi.

Utilizarea MALDI pentru caracterizarea biomoleculelor de dimensiuni mari a condus

la aplicaii multiple pentru caracterizarea bacteriilor i a proteinelor izolate din acestea. S-a
observat c tehnologia MALDI-TOF poate fi aplicat direct pentru fraciuni celulare sau
suspensii celulare, rezultnd date care pot fi de mare ajutor pentru clasificarea
chemotaxonomic. Versatilitatea si rapiditatea metodei de lucru au condus la dezvoltarea mai
multor metode de analiz MALDI-TOF pentru bacterii. Printre cele mai importante i utilizate
aplicaii sunt: caracterizarea foarte rapid a bacteriilor ca gen, specie, tulpin, analiza de ADN
i ARN bacterian, detectarea proteinelor recombinate, caracterizarea de proteine specifice,
proteomic bacterian i detecia markerilor de virulen. Capacitatea demonstrat

de

clasificare taxonomic la nivel de tulpin, utiliznd celule neprocesate, deschide posibilitatea

utilizrii spectrometriei de mas pentru a contribui la dezvoltarea de metode de caracterizare
n timp real pentru bacterii. Dei se pot utiliza alte metode cunoscute pentru diferenierea
bacteriilor, tehnologia MALDI ofer un avantaj substanial fa de celelalte metode uzuale,
acesta fiind viteza de analiz (Jackson O. Lay, 2002).

Figura 1. Principiul de funcionare a spectrometriei de mas MALDI-TOF

1. Identificarea celulelor ntregi

Identificarea taxonomic a bacteriilor bazat pe proteinele constituente reprezint o
extensie logic a metodelor dezvoltate pentru studiile de proteomic bacterian. Ideal ar fi ca
aceast abordare s fie rapid i n acelai timp sa fie bazat pe un grup de proteine suficient
de mare, astfel nct s se obin o amprent spectral unic a tulpinii bacteriene. S-a
demonstrat c spectrometria de mas MALDI-TOF poate fi folosit pentru a se obine profile
caracteristice din proteinele izolate din celule dezintegrate. Metoda de lucru a fost una simpl.
n primul rnd s-au recoltat celulele prin centrifugare, au fost splate cu o soluie tampon,
resuspendate, pentru ca apoi s fie dezintegrate prin sonicare. La final s-a colectat o fraciune
proteic dintr-un precipitat cu metanol pentru analiza final MALDI-TOF (Cain,Lubman, &
Webber, 1994). O metod alternativ de lucru este realizat prin separarea proteinelor cu
ajutorul cromatografiei lichide, proteinele fiind apoi colectate pentru analiz MALDI (Liang
i colab., 1996). Utiliznd cea de-a doua abordare, bacteriile au fost mprite dup profilul lor
proteic pe diferite specii.
Holland i colab. (1996) au propus o abordare similar, folosind profilul proteic
detectat direct din celule ntregi i nu din din extracte celulare. Pentru a demonstra
metodologia s-au identificat probe oarbe de celule bacteriene ntregi fie prin comparare cu
spectre de mas cunoscute, sau pe baza unei co-analize a bacteriilor din culturi de referin.
Aceast metod este extrem de rapid. Au fost colectate mostre din coloniile bacteriene pe o
plac cu agar, amestecate cu matricea, uscate la aer, pentru ca apoi s fie analizate cu
spectrometrul de mas. La toate spectrele obinute n aceste experimente, fiecare tulpin
bacterian a prezentat un numr mic de ioni cu mas ridicat care au fost atribuii proteinelor
bacteriene. Dei aceast metod i cele similare ei detecteaz doar acea fraciune proteic care
poate fi extras cu uurin din celule ntregi, profilele sunt n general potrivite pentru
identificarea taxonomic. Aceast potrivire apare deoarece variaia biologic a proteinelor
prezente la nivel de tulpin este mai mult dect suficient pentru a permite identificarea rapid
cu aceast abordare, chiar dac doar o parte a proteinelor sunt folosite ca probe. Rezultate
similare au fost raportate si de Claydon i colab. (1996). Acetia au realizat o analiz automat
care produce spectre specifice pentru genuri i specii din celule prelevate de pe medii de
cultur intr-un interval de timp de ordinul minutelor. Pe lng identificarea microorganismelor
din diferite genuri i specii, ei au mai realizat spectre diferite din tulpini ale aceleai specii.

Metoda lor implic o amprent spectral unic a microorganismului din subculturi crescute
timp de 3 sau 6 zile i din aceeai cultur o zi mai trziu, i deasemenea din subculturi
proaspete dup 2 luni. Semnalele spectrale au fost atribuite unor componente desorbite ale
peretelui celular.
Exist mai muli parametrii experimentali care pot avea un efect puternic asupra
spectrelor de mas observate. Wang i colab. (1998) au abordat problema reproductibilitii
spectrelor de mas n mod experimental intr-un studiu care a implicat mai multe laboratoare.
n acest experiment s-au investigat sistematic efectele unui numr de parametrii i s-a
demonstrat c mici variaiuni la procedura de preparare a amestecului de prob cu matrice
pentru MALDI i la condiiile experimentale utilizate pentru extracia de proteine bacteriene
pot conduce la schimbri semnificative la spectrele rezultate n urma analizei. Ei au observat
c un subansamblu de vrfuri din spectrele obinute s-a pstrat chair i n condiii
experimentale diferite atta timp ct spectrele sunt de la bacterii identice genetic. Aceste
vrfuri care s-au pstrat ajut la explicarea succesului aplicrii tehnicii MALDI-TOF la
caracterizarea de bacterii chiar i naintea standardizrii condiiilor experimentale. Astfel s-a
propus ca aceti biomarkeri proteici specifici i selectivi s poat fi utilizai pentru
identificarea bacteriilor, fr a se ine cont de schimbrile care apar la ali biomarkeri.

Figura 2. Rezultatul analizei MALDI-TOF pentru o tulpin de Escherichia coli de la

trei laboratoare diferite.
ntr-un alt studiu care s-a concentrat asupra schimbrilor spectrale n perioade de timp
mai mari, Welham i colab. (1998), au raportat apariia unor modificri ale spectrelor bazate
pe trecerea timpului i cantitatea de prob utilizat. Bacteriile rspund foarte rapid la
schimbrile de mediu ceea ce duce la producerea de proteine de stres i alte schimbri n
procesele celulare cnd celulele sunt pstrate, manipulate sau cultivate pe diferite perioade de
timp anterioare analizei, ceea ce duce la apariia de probe neindentice din motive asociate cu
biologia bacteriei. Analizarea periodic a unor celule ntregi de E. coli a condus la o evoluie
temporal a spectrelor MALDI. Spectrele lor de mas au coninut zeci de vrfuri cuprinse
ntr-un domeniu de mas aflat ntre 3-11 kDa. Cu toate acestea, chiar dup 3 luni de pauz
ntre experimente, spectrele au coninut un numr de ioni reproductibili de mas mare.
Aceast lucrare aduce dovezi suplimentare asupra existenei de ioni cu valoare de biomarkeri
de identitate specifici care se conserv.
Madonna i colab. (2000) au studiat metode de facilitare a deteciei ionilor de mas
mare. Ei au prezentat rezultatele unui studiu asupra factorilor care ar putea facilita detectarea
ionilor de mas mare din bacterii , incluznd detectarea ionilor de mas mare pentru bacteriile
Gram-pozitive i Gram-negative, utiliznd o matrice de acid ferulic. Matricea este compus
dintr-un amestec de 12.5 mg de acid ferulic dizolvat n 1 ml de soluie ce conine 17% acid
formic, 33% acetonitril i 50% ap. Procedura implic depozitarea coloniilor bacteriene din
plcile de cultur direct n proba MALDI i un tratament, prima dat cu 40% etanol i
matricea de acid ferulic descris mai sus. Folosind aceast abordare s-au putut observa ioni de
mas mare mpreun cu cu un numr substanial de semnale intense n regiunea convenional
de amprentare de 20 kDa.
Un alt studiu prezint un rspuns dependent de timp neobinuit. Un comportament
semnificativ de dependen de timp s-a observat la un tip de bacterii, dar nu i la cellalt
(Saenz i colab., 1999). S-au colectat spectre de mas de la E. coli i Bacillus atrophaeus n
10 ocazii diferite pe o perioad de timp de 3 luni. Dei spectrul de la E. coli a suferit
schimbri semnificative de-alungul perioadei de timp studiate, spectrul de mas de la Bacillus
atrophaeus s-a schimbat foarte puin.
Printre abordrile mai noi de detecie i caracterizare a bacteriilor iese n eviden
studiul realizat de de Bundy i Fenselau (2004), care au utilizat lectine imobilizate ncorporate
n suprafee de afinitate pentru a izola diferite tipuri de bacterii pentru analiza de
5

spectrometrie de mas. Recuperarea de specii bacteriene care au o afinitate de legare pentru

carbohidrai, a fost demonstrat cu o prob de Concanavalin A. Proba a fost imobilizat pe o
folie de aur printr-un monostrat autoasamablat. Apoi s-a pus n contact cu suprafaa probei
urin cu un coninut de E. coli i s-au lsat s interacioneze pentru un timp scurt. Chiar
naintea analizei MALDI, suprafaa de captur a fost splat pentru a se ndeprta srurile i
alte componente nelegate. Suprafaa tratat cu lectin a permis bacteriilor s se concentreze i
s poat fi caracterizate la un nivel ce corespunde la aproximativ 5,000 de celule aplicate la
suprafaa de captur. Biomarkerii int n acest studiu nu au fost proteine ci cefaline, care care
produc mase sub m/z 1000. Astfel acest studiu demonstreaz nu doar utilitatea proceselor de
afinitate pentru recuperarea unui numr mic de bacterii din probe complexe, ci i ne arat
foarte clar c moleculele mici pot juca un rol important ca biomarkeri specifici pentru
caracterizarea bacteriilor cu tehnica MALDI-TOF.
2. Interpretarea datelor din celulele ntregi
Una dintre marile dificulti ntlnite la utilizarea tehnicii MALDI-TOF pentru
caracterizarea bacterian o reprezint interpretarea datelor. Legtura direct dintre spectrele
obinute i parametrii experimentali include i o dependen de factorii temporali cum sunt
creterea coloniilor bacteriene i depozitarea lor i de faptul c numrul de proteine detectate
este afectat de separarea proteinelor n fraciuni multiple. Exceptnd subsetul de biomarkeri
semnal conservai, aceste schimbri ale spectrelor mpreun cu alte tipuri de schimbri
datorate biologiei bacteriilor complic procesul de interpretare a datelor. n general, metodele
de recunoatere ale modelelor necesit suficient atenie la detaliile experimentale astfel c se
pot obine spectre reproductibile de la culturi necunoscute si de la culturi de referin n
condiiile specificate. Abordarea alternativ sugerat mai sus implic utilizarea mai selectiv a
unui set mai mic de biomarkeri proteici conservai, bazat pe presupunerea c i doar cteva
proteine marker uor de observat ar putea asigura o specificitate adecvat. Exact ct de
conservai i specifici sunt aceti ioni de la bacterii i cum pot fi identificai i utilizai a
reprezentat un punct de pornire pentru mai multe experimente. Jarman i colab. au realizat o
metod de construire i extragere de spectre MALDI reproductibile din celule ntregi. Metoda
se bazeaz pe statistici, extragere automat de date i un nivel relativ ridicat de
reproductibilitate a spectrelor din celule ntregi. Aceast metod poate fi folosit pentru a
extrage o amprent (biomarkeri specifici) caracteristic unei bacterii int dintr-un spectru

complex care conine o sumedenie de semnale de fond. Aceast abordare a fost ilustrat
printr-o serie de de studii n care s-au utilizat prima dat Escherichia coli i B. atrophaeus, iar
apoi B. atrophaeus, B. cereus, E. coli, Pantoea agglomerans i Pseudomonas putida. Aceast
metod a fost demonstrat folosind probe n orb cu un numr limitat de tulpini, reuind s
demonstreze fezabilitatea interpretrii automate de date pentru unele aplicaii.

Figura 3. Spectre de E.coli folosind: (a) matrice de acid sinapinic n 1% acid formic,
(b) acid sinapinic n 1% TFA i (c) CHCA n 1%TFA.
3. Identificarea proteinelor i a metaboliilor din celule
Cteva studii s-au concentrat pe identificarea de proteine bacteriene care produc
semnale n spectrul de mas MALDI-TOF din celule ntregi. Identficarea de biomarkeri
specifici ar putea spori valoarea lor pentru identificare taxonomic, n special dac aparin
unui set conservat de biomarkeri. Proteinele asociate cu proprieti specifice pot fi

deasemenea utilizate ca markeri pentru aceste proprieti i pentru a detecta prezena anumitor
gene. Holland i colab. (1999) au lucrat asupra identificrii mai multor proteine, observate din
suspensii celulare filtrate, care au fost izolate la HPLC (cromatografie lichid de nalt
performan) i identificate pe baza spectrelor de mas i a secvenelor aminoacidice pariale,
determinate cu metoda Edman. Dou din aceste proteine includ proteinele HdeA i HdeB care
prezint rezisten la acid (prezint ioni cu valori de aproximativ m/z 9735 i 9060),
aparinnd unor celule i extracte celulare de E. coli 1090 i Shigella flexneri PHS-1059. Dei
aceste proteine au fost detectate, ele nu au fost identificate intr-un alt studiu care a folosit ca
tehnic de lucru cartarea peptidelor (Dai i colab., 2001). Aceast diferen se poate datora
faptului c proteinele specifice detectate de Holland i colab. au rezultat n urma procesrii
biologice a proteinei printe din interiorul celulei. n acest caz, clivajul proteolitic realizat
de peptidaza Lep a condus la obinerea unor proteine mai mici dect se anticipa pe baza
genomului. Acest experiment demonstreaz detectarea unei perechi de biomarkeri proteici
asociai cu virulena care au fost identici n dou organisme diferite. Deasemenea
experimentul ilustreaz necesitatea lurii n considerare a pailor procesrii celulare cnd are
loc atribuirea identitii proteinelor. Acest factor trebuie luat n considerare la schemele care
implic comparaii ntre listele de mase MALDI cu masele prezise din genom. n acelai
studiu o protein de oc la rece, CspA, a fost asociat cu un ion cu o raie de mas la ncrcare
de m/ z 7643 de la Pseudomonas aeruginosa i o protein de aclimatizare la rece, CapB, a fost
identificat ca sursa unui ion de aproape m/z 7684 n Pseudomonas putida.
Metaboliii secundari au fost caracterizai coincident cu identificarea bacterial a
celulelor ntregi folosind MALDI. Proliferarea cyanobacteriilor toxice este o ameninare
datorit produciei de metabolii secundari, iar detectarea toxinelor poate fi la fel de
important ca i gsirea organismelor propriu-zise. Spectrometria de mas MALDI-TOF a
fost utilizat pentru identificarea cyanobacteriilor intacte i pentru detectarea metaboliilor
toxici secundari produi de acestea. Printre aceti metabolii secundari se numr
microcistinele, micropeptina i anabaenopeptolina.
4.

ADN i ARN bacterian

Amplificarea ADN-ului folosind reacia n lan a polimerazei este un mijloc de

producere a unor mari cantiti de ADN de la un numr mic de organisme. Spectrometria de
mas MALDI-TOF se utilizeaz pentru analiza de ADN amplificat prin PCR n unele studii
care implic bacterii i gene bacteriene. Aceast tehnic a fost utilizat cu succes pentru
8

investigarea mecanismelor de reparare a ADN la bacterii. Un bun exemplu a fost la studierea

mecanismelor de aciune ale endonucleazei III la E. coli. Masele moleculare ale fragmentelor
oligonucleotidice reparate ce conin 5-OHC i DHT au susinut teoria care spune c
endonucleaza III cliveaz ADN printr-un proces hidrolitic (DHam i colab 1999).
Cu ajutorul spectrometriei MALDI s-au monitorizat modificrile posttranscripionale
de ARN bacterian. n aceast metod, ARN-ul este prima dat digerat complet cu Rnaz
specific, iar fragmentele rezultate sunt analizate prin spectrometrie de mas. O comparare a
maselor observate cu cele prezise din secvena genei a indicat existena unor fragmente care
includ nucleotide modificate. S-a observat c fragmentele mai mari dect o dinucleotid au
fost utile n mod special pentru identificarea modificrilor posttranscripionale. Aceast
abordare a permis un screening rapid a componentei ribozomale 5S rRNA de la dou
microorganisme termofile, bacteria Bacillus stearothermophilus si archaeonul Sulfolobus
acidocaldarius.

5. Diferenierea tulpinilor de bacterii patogene umane

Speciile genului Haemophilus sunt ageni etiologici care cauzeaz pneumonie,
meningit, conjunctivit i epiglotit. Identificarea acestor bacterii prin metodele
convenionale ntr-un cadru clinic s-a dovedit costisitoare si consumatoare de timp. Spectrele
caracteristice obinute din celule ntregi sugereaz c tehnica MALDI-TOF poate fi utilizat
ca i o unealt potrivit pentru diagnosticarea bacteriologic. ntr-o lucrare de Haag i colab.
(1998) s-a prezentat utilizarea spectrometriei de mas MALDI ca o tehnic de identificare
rapid si speciaie a tulpinilor patogene de Haemophilus. S-a folosit MALDI pentru
identificarea unui patogen, H. ducreyi, care este distinct de alte genuri i specii, i s-au
raportat diferene ntre tulpini din diferite izolate celulare ale acestui organism. Amprentele lor
de mas au permis specierea rapid nu doar a formelor patogene de Haemophilus, ci i a
tulpinilor non-patogene i a altor membrii ai florei umane normale.
H. pylori reprezint o alt problem major pentru sntatea uman. Acest organism
joac un rol important n sntatea gastrointestinal uman i se crede c a colonizat
aproximativ jumtate din populaia globului. Diferenierea tulpinilor este important deoarece
unuele tulpini de H. pylori posed proteine de virulen pentru colonizarea de esuturi i
pentru degradarea anumitor esuturi, n timp ce alte tulpni nu le posed. Acest organism

prezint instabilitate la nivel de genom (rearanjare i schimb de gene), care conduc la

diferene frecvente ntre tulpini. Pe baza analizei MALDI-TOF a lizatelor i extractelor
celulare de la ase tulpini diferite de H. pylori s-a detectat un set de biomarkeri specifici de
tulpin (Nilsson, 1999). Autorul a propus ca amprentarea MALDI a H. pylori ar putea permite
tipizarea i studierea driftului genetic la nivel fenotipic din izolate celulare umane. Diferenele
aprute ntre bacteriile patogene umane au rezultat n urma creterii rezistenei lor la
antibiotice, bactericide i proceduri de sterilizare. Un progres major s-a raportat la
diferenierea tulpinilor rezistente la antibiotice i a celor care nu prezint rezisten la un
important patogen uman, Staphylococcus aureus (Edward-Jones i colab., 2000).
Discriminarea rapid i precis ntre tulpinile rezistente i cele nerezistente la meticilin ale
acestui organism (i ale altora) ar putea conduce la o mbuntire major n strategia de
tratament a pacienilor infectai. Specificitatea diferenierii tulpinilor cu ajutorul
spectrometriei de mas MALDI-TOF a fost demonstrat la celule ntregi recoltate din 20 de
izolate celulare de stafilococi. Spectrul a artat vrfuri caracteristice de la 500 pn la 10,000
Da cu markeri specifici pentru specie i tulpin precum i markeri caracteristici pentru
susceptibilitatea la meticilin a tulpinii supus deteciei. Un alt studiu realizat de Rajakaruna
i colab. (2009) a avut ca int colectarea de izolate celulare de la S. aureus dintr-un laborator
clinic i utiliznd condiii minime de cultur, s se analizeze apoi izolatele celulare prin
spectrometrie MALDI-TOF. Spectrele obinute au fost ulterior comparate cu profilele
spectrale de S. aureus prezente n bazele de date. Din cele 134 de probe analizate doar patru
profile nu au fost corect identificabile cu S. aureus. Cele patru probe aberante au prezentat
rezultate contradictorii datorit unui nivel redus de contaminare, care au afectat n mod cert
profilele de mas obinute n urma analizei spectrometrice. Profilele de mas obinute de la
cteva specii nrudite de S. aureus cum sunt S. epidermidis, S. haemolyiticus i S.
saprophyticus au prezentat un nalt grad de similaritate ntre genuri, ns i o serie de
biomarkeri specifici pentru fiecare gen (Fig 4). S-a constatat diversitatea fenotipic
intraspecific dintre izolatele celulare de S. aureus i asemnrile cu tulpinile de referin prin
compararea atent a profilelor de mas MALDI. Pentru identificarea tulpinilor studiate s-a
recurs la observarea similaritilor dintre spectrele de mas ( dup valoarea RMS) n special i
mai puin la observarea ionilor de mas specifici.

10

Figura 4. Prima figur prezint spectrul de mas pentru tulpina S. Aureus (NCTC
10035) i spectrele pentru trei specii nrudite. Lipsa de biomarkeri consisteni pentru acest
grup sugereaz ca tot spectrul de ioni de mas s fie folosii pentru o analiz la nivel de
specie. n a doua figur se observ amprentele pentru patru tulpini de S. Aureus. Spectrele de
mas acoper o plaj ntre m/z 2000-3400. Sgeile indic unii dintre ionii de mas
remarcabili.

11

6. Concluzii
La ora actual este posibil evaluarea reproductibilitii i utilitii chemotaxonomice a
tehnicii de spectrometrie de mas MALDI-TOF folosind spectre generate pe parcursul mai
multor ani. Datele actuale ne arat existena unor seturi de ioni folosii ca biomarkeri
bacterieni specifici. Originea biologic i natura ionilor observai prin tehnica MALDI de la
bacterii sunt acum bine stabilite. Ionii produi prin spectrometria MALDI sunt predominant
asociai cu proteine bazice, de o natur moderat hidrofil, provenind din citoplasm sau din
organite cum sunt ribozomii.
Una dintre limitrile importante pentru folosirea MALDI-TOF pentru caracterizarea
bacteriilor este faptul c cel mai mare avantaj al tehnicii, i anume viteza de analiz, pare s
fie umbrit de practica comun a amplificrii celulelor ntr-un mediu de cultur nainte de
efectuarea analizei. Acest impediment poate fi ns surclasat prin dezvoltarea de abordri care
s nu depind de culturi preliminare. Holland i colab. (2000) au reuit analizarea bacteriilor
colectate mecanic direct din mediul contaminat fra a folosi culturi preliminare. S-au obinut
astfel spectrele pentru proteine bacteriene recoltate din probe de ap, lptuci i materiale
textile contaminate cu S. flexneri, E. coli i A. hydrophila.
O abordare interesant se bazeaz pe pe aa numita tehnologie chip. Acest concept a
condus la realizarea metodelor gene chip i protein chip care permit caracterizarea unor
probe complexe pentru un numr mare de gene sau proteine, folosind probe foarte mici sau
foarte murdare. Dei aceste tehnologii au fost direcionate n marea lor majoritate nspre
terapiile umane i diagnosticare, aplicarea lor pentru caracterizarea bacteriilor ar putea duce la
identificarea direct de bacterii sau proteine bacteriene din cipuri cu ajutorul metodei
MALDI-TOF.
Capacitatea demonstrat de clasificare taxonomic la nivel de tulpin, folosind celule
neprocesate, deschide posibilitatea ca spectrometria de mas MALDI-TOF s aduc o
contribuie semnificativ pentru a ndeplini nevoile urgente de dezvoltare a unor metode de
caracterizare n timp real pentru identificarea bacteriilor.

12

Bibliografie

Ashcroft Alison E. 1998. An Introduction to Mass Spectrometry.

Jackson O. Lay. 2002. MALDI-TOF Mass Spectrometry of Bacteria.
Cain TC, Lubman DM, Webber WJ , Jr. 1994. Differentiation of bacteria using protein
profiles from MALDI-TOF/MS.
Liang X, Zheng K, Qian MG, Lubman DM. 1996. Determination of bacterial protein
profiles by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry with highperformance liquid chromatography.
Holland RD, Wilkes JG, Rafii F, Sutherland JB, Persons CC, Voorhees KJ, Lay JO , Jr.
1996. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using
matrix assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry.
Claydon MA, Davey SN, Edwards-Jones V, Gordon DB. 1996. The rapid
identification of intact microorganisms using mass spectrometry.
Wang Z, Russon L, Li L, Roser DC, Long SR. 1998. Investigation of spectral
reproducibility in direct analysis of bacteria proteins by matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.
Welham KJ, Domin MA, Scannell DE, Cohen E, Ashton DS. 1998. The
characterisation of micro-organisms by MALDI-TOF mass spectrometry.
Madonna AJ, Basile F, Ferrer I, Meetani MA, Rees JC, Voorhees KJ. 2000. On-probe
sample pretreatment for the detection of proteins above 15 KDa from whole cell
bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometry.
Holland RD, Duffy CR, Rafii F, Sutherland JB, Heinze TM, Holder CL, Voorhees KJ,
Lay JO , Jr. 1999. Identification of bacterial proteins observed in MALDI TOF
mass spectra from whole cells.
Dai Y, Whittal RM, Li L. 2001. Two-layer sample preparation: a method for MALDIMS analysis of complex peptide and protein mixtures.

13

Haag AM, Taylor SN, Johnston KH, Cole RB. 1998. Rapid identification and
speciation of Haemophilus bacteria by MALDI-TOF mass spectrometry.
Nilsson CL. 1999. Fingerprinting of Helicobacter pylori strains by matrix-assisted
laser desorption/ionization mass spectrometric analysis.
Edwards-Jones V, Claydon MA, Evason DJ, Walker J, Fox AJ, Gordon DB. 2000.
Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant
Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry.
Holland RD, Rafii F, Heinze TM, Sutherland JB, Voorhees KJ, Lay JO, Jr. 2000.
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric detection
of bacterial biomarker proteins isolated from contaminated water, lettuce and cotton
cloth.

14