Controlul microbiologic al preparatelor medicale nesterile

Testul de control al calității microbiologice, urmărește determinarea cantitativă a Numărului

total de microorganisme aerobe (TAMC), a Numărului total de fungi și mucegaiuri combinate
(TYMC) și demonstrarea conformității cu specificațiile de calitate a acestora.
În testul de control al calității microbiologice a produselor nesterile cum ar fi produsele
finite, intermediare, produsele aflate în studii de stabilitate se utilizează metode validate conform
Farmacopeei Europene ediția curentă.
Pentru a se elimina posibila contaminare exterioară în timpul testării, testul de control al
calității microbiologice se realizează în cabinete cu flux de aer laminar vertical care este o zonă
curată de clasă A ( să scriu ce înseamnă clasa A ) care se află situat în zone curate de clasă C ( să
scriu ce înseamnă clasă C ).
Persoanele care efectuează testul de control al calității microbiologice a produselor, trebuie
să utilizeze echipament specific zonei de clasă C de curățenie.
Mediile de cultură utilizate în testare pentru realizarea testului de control al calității
microbiologice pentru detectarea Numărului total de microorganisme aerobe (TAMC) și a
Numărului total de fungi și mucegaiuri combinate (TYMC) sunt în conformitate cu Farmacopeea
Europeană ediția curentă, capitolele 2.6.12 și 2.6.13 și sunt:
Buffered sodium chloride-peptone solution pH 7.0 (soluție tampon pH= 7.0)
Stock buffer solution (soluție stoc tampon fosfat pH 7.2)
Solutie tampon fosfat pH 7.2 ± 0.2
Casein soya bean digest agar (Caso-agar)
Casein soya digest broth (Caso–bulion)
Sabouraud-dextrose agar
 se sterilizează în autoclav utilizând un ciclu de sterilizare validat ( 121 ºC, 15 minute).
(Autoclavul este un vas închis ermetic, folosit la sterilizarea materialelor prin căldură umedă,
utilizând ca agent termic abur steril, la presiune constantă.
Autoclavele Getinge se utilizează pentru sterilizare, utilizând ca agent termic aburul steril, la o
presiune constantă. Cu acest tip de autoclav se sterilizează recipiente din sticlă (pahare,
eprubete), materiale necesare testului de sterilitate (ochelari, tăvi, foarfeci), materiale necesare
igienizării zonei curate de clasă B , componente ale echipamentelor, medii de cultură.)
Cantitatea de produs utilizată în testare pentru determinarea TAMC și TYMC pentru
produsele finite, intermediare, produse aflate în studii de stabilitate și materii prime este de
10 g ± 1 g sau 10 ml ± 1 ml produs (± 10 % din cantitatea stabilită, conform Farmacopeei
Europene , ediția curentă capitolul 1 General Notices, punctul 1.2).
 Metoda de preparare a probei depinde de caracteristicile fizice ale produsului care urmează a
fi testat. Dacă nici una din metodele de mai jos nu poate fi demonstrată ca fiind adecvată, se vor
dezvolta proceduri corespunzătoare ce vor fi validate.
Produsele solubile în apă se dizolvă sau se diluează cantitatea de produs (10 g ± 1 g sau 10
ml ± 1 ml produs) în diluentul corespunzător (soluție tampon pH 7.0, soluție tampon fosfat pH
7.2 sau Caso-bulion) pentru a obține diluția de lucru 1:10. Se ajustează pH 6-8, dacă este necesar,
conform metodei validate. Dacă sunt necesare diluții ulterioare se vor prepara cu același diluent.
Produsele insolubile în apă de natură ne-lipidică se suspendă (10 g ± 1 g sau 10 ml ± 1 ml
produs) în diluentul corespunzător (soluție tampon pH 7, soluție tampon fosfat pH 7.2 sau Caso-
bulion) pentru a obține o diluție de 1:10. Dacă este necesar, pentru a ușura dizolvarea produsului
se pot adăuga agenți active de suprafață ca 1 g/l de polisorbat 80. Se ajustează pH 6-8, dacă este
necesar, conform metodei validate. Dacă sunt necesare diluții ulterioare se vor prepara cu același
diluent.
Produsele de natură lipidică se dizolvă (10 g ± 1 g sau 10 ml ± 1 ml produs) cu o cantitate
validată de isopropyl myristate, steril sau se amestecă cu o cantitate minimă necesară, validată,
de polysorbat 80 steril sau orice alt agent activ de suprafață non-inhibitor validat, se încălzește
dacă este necesar la o temperatură care să nu depășească 40 ºC, în cazuri excepționale la maxim
45 ºC. Se completează cu diluentul potrivit (soluție tampon pH 7, Caso-bulion) pre-încălzit
pentru a obține diluția de 1:10. Se agită cu atenție și se menține această temperatură minimul de
timp necesar formării emulsiei. Se ajustează pH 6-8, dacă este necesar, conform metodei
validate.
Dacă sunt necesare diluții ulterioare se vor prepara cu același diluenti conținînd concentrația
adecvată de polysorbat 80 steril sau orice alt agent activ de suprafață non-inhibitor.
În funcție de forma produsului (solidă sau lichidă), diluția 1:10 se realizează astfel:

-pentru produsele sub formă solidă: 10 g produs + 100 ml diluent

-pentru produsele sub formă lichidă: 10 ml produs + 90 ml diluent
După preparare, proba se păstrează la temperatura și timpul de contact/dizolvare al
produsului cu diluentul, conform metodei validate.
După finalizarea timpului de contact/dizolvare, proba se omogenizează și se păstrează în
cabinetul cu flux de aer laminar timp de 5-10 minute, pentru sedimentarea eventualelor particule
nedizolvate ale produsului.
Pentru verificarea condițiilor de testare, se realizează un control negativ, atât pentru TAMC
cât și pentru TYMC, în aceleași condiții de testare ca și proba, folosind agentul de diluare în
locul produsului de testat. Se înregistrează pe capacul fiecărei plăci Petri, tipul probei de
exemplu Control negativ, denumirea mediului de cultură utilizat, data și ora testării.
În examinarea produsului se utilizează metoda validată în conformitate cu Farmacopeea
Europeană – metoda filtrării prin membrană sau metoda numărării în placă.
 Metoda filtrării prin membrană
Filtrarea prin membrană a probei testate se realizează cu ajutorul sistemului de filtrare
Microfill cu trei posturi. Se folosesc membrane filtrante sterile, cu porozitatea 0,45 µm. Tipul
(compoziția) membrane trebuie selectat în funcție de compoziția produsului care urmează a fi
testat, astfel încât să nu fie afectată eficiența de reținere a microorganismelor. Pentru soluțiile
apoase, uleioase sau ușor alcoolice se vor folosi membrane filtrante de nitrat de celuloză, pentru
soluțiile puternic alcoolice se vor folosi membrane filtrante din acetat de celuloză, iar pentru
antibiotic, membrane filtrante special adaptate din polyvinylidene fluoride.
Se folosesc 2 membrane filtrante sterile, pe fiecare membrană se filtrează 1 ml din diluția
1:10 sau diluția corespunzătoare, conform metodei de testare validate. După filtrare se spală
fiecare membrană cu cantitatea de diluent validată.
Pentru detectarea TAMC se transferă aseptic una din membrane pe suprafața unei plăci Petri
cu 15-20 ml Caso-agar iar pentru detectarea TYMC se transferă cea de a doua membrană pe
suprafața unei plăci Petri cu 15-20 ml Sabouraud-dextrose agar.
Se înregistrează pe capacul fiecărei plăci Petri denumirea mediului de cultură utilizat,
denumirea produsului, seria, data și ora testării.
Pentru verificarea condițiilor de testare, se realizează un control negativ atât pentru TAMC
cât și pentru TYMC. Se folosesc 2 membrane filtrante sterile, pe fiecare membrană se filtrează o
cantitate de agent de diluare echivalentă cu cantitatea produsului analizat. După filtrare se spală
fiecare membrană cu 100 ml agent de diluare corespunzător. Pentru detectarea TAMC se
transferă aseptic una din membrane pe suprafața unei plăci Petri cu 15-20 ml Caso-agar iar
pentru detectarea TYMC se transfer cea de a doua membrană pe suprafața unei plăci Petri cu 15-
20 ml Sabouraud-dextrose agar. Se înregistrează pe capacul fiecărei plăci Petri denumirea
mediului de cultură utilizat, denumirea produsului, tipul probei (Control negativ), data și ora
testării.
Plăcile ce conțin mediul de cultură Caso- agar, reprezentând proba și controlul negativ se
incubează la 30-35 ºC timp de 3-5 zile iar plăcile ce conțin mediul de cultură Sabouraud dextrose
agar, reprezentând proba și controlul negativ se incubează la 20-25 ºC, timp de 5-7 zile.

Metoda numărării în placă

Se adaugă câte 1 ml din diluția 1:10 sau diluția corespunzătoare conform metodei validate, în
patru plăci Petri (cu diametrul de 90 cm). Peste două plăci Petri se adaugă 15-20 ml Caso-agar
(pentru detectarea TAMC) iar pe restul plăcilor se adaugă 15-20 ml Sabouraud-dextrose agar
(pentru detectarea TYMC). Temperatura mediului de cultură utilizat nu trebuie să depășească
45ºC. Se rotesc ușor plăcile pentru omogenizarea conținutului și se lasă plăcile în cabinetul cu
flux de aer laminar până la solidificarea mediului.
Se înregistrează pe capacul fiecărei plăci Petri denumirea mediului de cultură utilizat,
denumirea produsului, seria, data și ora testării.
 Pentru verificarea condițiilor de testare, se realizează un control negativ adăugând 1 ml
diluent de testare în locul probei preparate.
Plăcile ce conțin mediul de cultură Caso-agar, reprezentând proba și controlul negativ se
incubează la 30-35 ºC timp de 3-5 zile, iar plăcile ce conțin mediul de cultură Sabouraud
dextrose agar, reprezentând proba și controlul negativ se incubează la 20-25 ºC, timp de 5-7 zile.

Interpretarea rezultatelor
Numărul total de microorganisme aerobe (TAMC) este egal cu numărul de UFC (Unitate
Formatoare de Colonii) dezvoltate pe plăcile cu mediu de cultură Caso-agar. Dacă pe acest
mediu sunt dezvoltate și colonii de fungi acestea sunt numărate ca TAMC.
Numărul total de fungi și mucegaiuri combinate (TYMC) este egal cu numărul de UFC
dezvoltate pe plăcile cu mediu de cultură Sabouraud-dextrose agar. Dacă pe acest mediu sunt
dezvoltate colonii de bacterii acestea se numără ca TYMC.
Metoda filtrării prin membrană – după finalizarea perioadei de incubare se numără coloniile
eventual dezvoltate pe cele două membrane. Numărul de colonii eventual dezvoltate pe cele 2
membrane, corespunzătoare parametrilor TAMC, TYMC, se înmulțește cu factorul de diluție
utilizat în testare, iar rezultatul obținut se exprimă în UFC/g sau UFC/ml.
Controlul negativ nu trebuie să prezinte creștere microbiană.
Metoda numărării în placă – se aleg plăcile cu un număr mai mic de 250 UFC pentru
TAMC și 50 UFC pentru TYMC. Pentru fiecare parametru (TAMC, TYMC), pe cele două plăci
cu proba de testat, după perioada de incubare se numără coloniile de microorganism. Numărul de
colonii dezvoltat pe cele două plăci cu Caso-agar pentru determinarea TAMC se înmulțește cu
factorul de diluție utilizat în testare și se face media aritmetică, iar rezultatul se exprimă în
UFC/g sau UFC/ml.
Numărul de colonii dezvoltat pe cele două plăci cu Sabouraud-dextrose agar pentru
determinarea TYMC se înmulțește cu factorul de diluție utilizat în testare și se face media
aritmetică, iar rezultatul se exprimă în UFC/g sau UFC/ml. Controlul negativ nu trebuie să
prezinte creștere microbiană.
Probele sunt corespunzătoare dacă rezultatele obținute respect prevederile din specificația
produsului.
Conform F.E. ediția curentă, capitolul 2.5.12, criteriile de acceptanță pentru calitatea
microbiologică a produselor testate sunt interpretate astfel:
101 UFC – numărul maxim de UFC acceptat = 20
102 UFC – numărul maxim de UFC acceptat = 200
103 UFC – numărul maxim de UFC acceptat = 2000 și așa mai departe.
 Dacă după perioada de incubare nu se observă creștere microbiană, rezultatul se interpretează
ca fiind ,,Mai puțin de 10” sau ,,Mai puțin de 20” , în funcție de factorul de diluție utilizat la
prepararea probei.