EVALUAREA PRIN EXAMENE

MICROBIOLOGICE A EFICIENŢEI
PROCEDURILOR DE LUCRU
STANDARD PENTRU IGIENIZAREA
PREOPERAŢIONALĂ
 1. CONTROLUL MICROAEROFLOREI DIN

SPAŢIILE DE LUCRU ŞI DEPOZITARE

a. Determinări ce se efectuează:

❑ determinarea numărului total de bacterii aerobe

(NTGMA)/m3 de aer.

❑ determinarea numărului total de drojdii şi

mucegaiuri /m3 de aer.

 b. Frecvenţa şi momentul efectuării: o dată pe
săptămână la fiecare spaţiu în care se prelucrază
sau depozitează produse alimentare, înainte de
începerea lucrului; o dată pe lună în timpul lucrului.

Determinarea numărului total de bacterii aerobe

NTGMA/m3 aer

Pentru determinarea NTGMA se aplică

metodologia Standardului Român SR EN ISO
4833/2009: „Microbiologia produselor alimentare şi
nutreţurilor. Metodă orizontală pentru numărarea
microorganismelor. Tehnică de numărare a
coloniilor la 30°C.”
 a. Mediul de cultură
❑ agar dispus în placi Petri pentru numărarea u.f.c.
de germeni mezofili aerobi (plate count agar-PCA).
b. Mod de lucru
Recoltarea probelor
Pentru fiecare spaţiu în care urmează să se
determine microflora se pregătesc în mod aseptic
câte două cutii Petri cu agar pentru numărarea
bacteriilor.
Se merge în spaţiul de lucru sau în depozite
cu cutiile cu medii pregătite şi protejate de
contaminările exterioare. În spaţiile de lucru se
depun la nivelul meselor de lucru cele două cutii
descoperite. Capacul se sprijină de marginea
corpului cutiei. Cutiile se depun în locuri diferite ale
încăperii. În depozite, o cutie se depune pe planşeu,
iar cealaltă cutie, la înălţimea de 80-100 cm.
 Cutiile descoperite, cu capacele sprijinite de
corp, se lasă în repaus 10 minute. După acest timp
cutiile se acoperă cu capacele proprii şi, protejate
de contaminările exterioare, se duc în laborator.
Incubare
Se întorc plăcile pregătite cu faţa în jos şi se
pun în incubator la 30°C ± 1°C pentru 72 h ± 3 h. Nu
se suprapun mai mult de şase plăci în coloană.
Coloanele cu plăci se separă unele de altele şi de
pereţii şi partea superioară a incubatorului.
 Numărarea coloniilor
După perioada de incubare specificată, se
numără coloniile de pe plăci folosind, dacă a fost
necesar, echipamentul pentru numărarea coloniilor.
Se examinează plăcile în lumină difuză.
c. Citirea şi interpretarea rezultatelor
După expirarea timpului de incubare se
numără separat coloniile dezvoltate în cele două
cutii cu acelaşi fel de mediu şi se face media
aritmetică a numărului găsit.
 Numărul mediu de ufc de germeni mezofili
aerobi găsit s-a introdus în formula:
NB/m3 aer = n x 50,
în care:
NB – numărul de bacterii pe 1 m3 de aer,
n – media numărului de colonii de bacterii
dezvoltate pe mediul folosit.
50 – coeficient rezultat dintr-o formulă în care s-a
introdus timpul de expunere (10 minute), diametrul
cutiilor cu mediu (100 mm) şi un factor de corecţie.
 Determinarea numărului total de drojdii şi
mucegaiuri/m3 aer

Pentru determinarea numărului total de drojdii

şi mucegaiuri se aplică metodologia Standardului
Român SR ISO 7954/2009: Microbiologie - Directive
generale pentru numărarea drojdiilor şi
mucegaiurilor. Tehnica numărării coloniilor la 25°C.
Standardul este identic cu standardul european ISO
7954/1987, Microbiology-General guidance for
enumeration of yeasts and moulds - Colony count
technique at 25°C.
 a. Mediu de cultură
❑ mediu extract de drojdie-dextroză-cloramfenicol-
agar
Se dizolvă componentele în apă prin fierbere
(cloramfenicolul se dizolvă separat, se sterilizează
prin filtrare). Se ajustează pH-ul astfel încât, după
sterilizare, acesta să fie 6,6. Se repartizează mediul
în recipiente şi se sterilizează la 121°C ± 1°C, timp
de 15 min,
b. Mod de lucru
Recoltarea probelor
Pentru fiecare spaţiu în care urmează să se
determine numărul de drojdii şi mucegaiuri se
pregătesc în mod aseptic câte două cutii Petri cu
mediu special pentru cultivarea drojdiilor şi
mucegaiurilor. Cutiile descoperite, cu capacele
sprijinite de corp, se lasă în repaus 10 minute.
 După acest timp cutiile se acoperă cu
capacele proprii şi, protejate de contaminările
exterioare, se duc în laborator.
Incubare
Cutiile cu mediu pentru determinarea
numărului de drojdii şi mucegaiuri se aşează cu
capacul în jos, în incubator la 25° ± 1°C şi se
termostatează 4-5 zile.
c. Citirea şi interpretarea rezultatelor
După trei, patru şi cinci zile de incubare se
numără coloniile din fiecare cutie Petri. Calculul se
face ca şi în cazul NTGMA/m3 de aer.
 2. CONTROLUL EFICIENŢEI IGIENIZĂRII
SUPRAFEŢELOR DE LUCRU, UTILAJELOR,
INSTRUMENTELOR ŞI ECHIPAMENTULUI DE
PROTECŢIE CONFECŢIONAT DIN
MATERIALE IMPERMEABILE
 a. Determinări ce se efectuează:
- determinarea numărului total de bacterii aerobe
(NTG)/cm2
- determinarea prezenţei bacteriilor coliforme/10
cm2.
b. Frecvenţa şi momentul efectuării: o dată pe
săptămână, înainte de începerea şi în timpul
lucrului, pentru fiecare obiectiv (suprafeţe, mese de
lucru, utilaje, instrumente, echipament de protecţie
care vine în contact direct cu produsul).
Determinarea numărului total de bacterii aerobe
NTGMA/cm2

a. Principiul metodei
❑ prepararea a două plăci turnate prin folosirea
unui mediu de cultură specific şi a unei cantităţi
specificate de probă (suspensie);
❑ incubarea plăcilor în condiţii de aerobioză timp
de 72 h la 30°C;
❑ calcularea numărului de microorganisme pe cm2
de suprafaţă din numărul de colonii obţinute pe
plăcile incubate.
 b. Mediu de cultură
❑ agar dispus în placi Petri pentru numărarea u.f.c.
de germeni mezofili aerobi (plate count agar-PCA)
Recoltarea probei (tamponului de sanitaţie) de
pe suprafaţa obiectivului de controlat se face fie cu
tamponul fără tijă, fie cu tamponul cu tijă metalică.
În primul caz tamponul se ia din cutia Petri în care
se află, cu o pensă chirurgicală sterilizată ad-hoc
prin flambare la flacăra lămpii cu spirt.
Pe suprafaţa de controlat se aplică şablonul
sterilizat. Suprafaţa delimitată de şablon se şterge
cu tamponul uşor înmuiat în serul fiziologic dintr-o
eprubetă. Ştergerea suprafeţei se face prin trecerea
tamponului prin fiecare punct al acesteia de trei ori.
 În acest scop, tamponul ţinut în pensă sau de
tijă se trece pe suprafaţa de controlat în trei direcţii:
odată orizontal, a doua oară vertical (perpendicular
pe prima direcţie) şi a treia oară oblic pe primele
două direcţii. În timpul trecerii pe suprafaţa
obiectivului, tamponul se roteşte în aşa fel încât să
fie folosită toată suprafaţa lui. Acest mod de
recoltare se aplică la suprafeţele plane şi extinse,
cum sunt cele ale meselor de lucru, a unor utilaje
sau a şorţului de cauciuc.
În cazul multor obiective cum ar fi cuţitele,
fierăstrăul, folosirea şablonului nu este posibilă, în
aceste cazuri procedându-se astfel:
❑ în cazul cuţitelor: tamponul se recoltează de pe
toată suprafaţa lamei prin ştergeri în cele trei
direcţii. Se insistă cu ştergerea asupra locului de
îmbinare a lamei cu mânerul. După recoltarea
tamponului, se măsoară cu rigla lungimea şi
lăţimea lamei şi dimensiunile găsite se trec în lista
de recoltare;
❑ în cazul fierăstrăului: recoltarea se face de pe
suprafaţa lamei, insistându-se asupra dinţilor.
Tamponul se recoltează de pe o suprafaţă de 100
cm2. Pentru a delimita o asemenea suprafaţă,
pentru care şablonul nu se pretează, se măsoară cu
rigla lăţimea lamei, fără a o atinge. Împărţind 100 la
numărul de centimetri care reprezintă lăţimea lamei,
se află lungimea porţiunii de lamă de pe care s-a
făcut recoltarea.
 Prelucrarea probei recoltate (tamponul de
sanitaţie)
După recoltare tamponul se introduce într-o
eprubetă cu 10 ml ser fiziologic sau în lipsa
eprubetei cu ser fiziologic, într-o eprubetă sterilă
fără ser. În acest caz, în eprubetă se introduc 10 ml
ser fiziologic când proba a ajuns la laborator,
înainte de a fi prelucrată.
Eprubetele cu probe se agită bine până ce
tampoanele de vată se desfac în fibre cât mai
izolate. Aceasta se realizează în mod obişnuit
lovind fundul eprubetei de podul palmei de 25-30
ori.
Lichidul din eprubetă se pipetează cu pipete
de 2 ml de cel puţin 10 ori cu aspiraţii şi respingeri
puternice pentru a sparge grămezile de
microorganisme
 c. Mod de lucru
Inoculare şi incubare
Se iau două cutii Petri sterile. Se transferă în
fiecare cutie, cu ajutorul unei pipete sterile 1 ml
probă. Se iau alte două cutii Petri sterile. Se
transferă în fiecare cutie, cu ajutorul altei pipete
sterile 1 ml din diluţia 10-1.
Se toarnă de la 12 ml până la 15 ml agar
pentru placa de numărare la 44°C până la 47°C în
fiecare placă Petri. Timpul scurs între sfârşitul
preparării suspensiei iniţiale (sau a diluţiei 10-1) şi
momentul când mediul este turnat în plăci nu
depăşeşte 45 min.
 Se amestecă inoculul cu mediul prin rotirea
plăcii Petri şi se lăsă amestecul să se solidifice prin
lăsarea plăcilor Petri să stea pe o suprafaţă
orizontală rece. Se întorc plăcile pregătite cu faţa în
jos şi se pun în incubator la 30°C ± 1°C pentru 72 h
± 3 h.
Numărarea coloniilor
După perioada de incubare specificată, se
numără coloniile de pe plăci
d. Calculul şi interpretarea rezultatelor
Se face media aritmetică a numărului găsit pe
fiecare diluţie. Numărul mediu găsit se împarte la 10
şi se află numărul de bacterii aerobe pe 1 cm2.
Determinarea prezenţei bacteriilor coliforme/10
cm2

Pentru determinarea prezenţei bateriilor

coliforme/10 cm2 se aplică metodologia
Standardului Român SR ISO 5541/2/2009:
„Stabilirea numărului de bacterii coliforme. Partea
2: Metoda numărului cel mai probabil la 30°C”.
Standardul este identic cu Standardul
Internaţional EN ISO 5541/2/1986, Milk and milk-
products - Enumeration of coliforms. Part 2: Most
probable number technique at 30°C.
 a. Principiul metodei constă în:
❑ însămânţarea probei în eprubete cu mediu
selectiv lichid, care conţin tuburi Durham;
❑ incubarea eprubetelor la 30° C, timp de 48 h;
❑ din tuburile prezumtiv pozitive (cele care prezintă
acumulare de gaz în tuburile Durham, pe mediu
BBLV) inocularea pe agar cu eozină şi albastru de
metilen;
❑ incubare la 30° C, timp de 24 h.
b. Medii de cultură
❑ bulion - bilă - lactoză - verde briliant (BBLV),
mediu selectiv lichid;
❑ agar cu eozină şi albastru de metilen, mediu de
confirmare.
 c. Mod de lucru
Prepararea probei de lucru
Lichidul din eprubetă se pipetează cu pipete
de 2 ml de cel puţin 10 ori cu aspiraţii şi respingeri
puternice pentru a sparge grămezile de
microorganisme. Din lichidul astfel agitat se
inoculează 1 ml într-un tub cu BBLV şi tub de
fermentaţie (Durham).
Incubare
Eprubetele cu mediu simplu concentrat se
incubează la 30±1°C, timp de 48±2 h.
Test de confirmare
Din fiecare din eprubetele termostatate, care a
produs gaz în tuburile Durham, se însămânţează,
prin striere, pe mediu cu eozină şi albastru de
metilen şi se incubează la 30±1°C, timp de 24 ±2 h.
 d. Interpretarea rezultatelor
Prezenţa de gaze în tubul de fermentaţie
asociată cu turbiditatea uniformă a mediului se
interpretează ca prezenţă de bacterii coliforme/10
cm2. În cazurile în care turbiditatea mediului a fost
neuniformă, granulată sau cu peliculă la suprafaţa
coloanei de mediu, din cultura dezvoltată se face un
frotiu care se colorează cu metoda Gram şi se
examinează la microscop.
 Prezenţa în frotiu a bacteriilor Gram negative
sub formă de bacili scurţi sau cocobacili singure
sau în asociaţie cu bacterii Gram pozitive, se
interpretează ca prezenţă de bacterii coliforme.
Prezenţa în frotiu numai a bacteriilor Gram
pozitive se interpretează ca absenţă de bacterii
coliforme.
Se consideră caracteristice, după confirmare,
coloniile cu luciu metalic, cele roşii-roze şi cele cu
suprafaţa mucoidă.
3. CONTROLUL BACTERIOLOGIC AL MÂINILOR
PERSONALULUI CARE MANIPULEAZĂ
PRODUSE ALIMENTARE

a. Determinări ce se efectuează:
- determinarea prezenţei bacteriilor coliforme/1 ml
lichid de spălare;
- determinarea prezenţei Salmonella/5 ml lichid de
spălare;
- determinarea prezenţei Stafilococului coagulazo-
pozitiv/4 ml lichid de spălare.
b. Frecvenţa şi momentul efectuării: o dată pe
săptămână, înainte de începerea şi în timpul
lucrului, pentru mâinile operatorilor care vin în
contact cu produse alimentare.
 Recoltarea probelor

Cu tamponul uşor umectat în ser fiziologic se

şterge faţa palmară şi spaţiile interdigitale de la o
mână, frecându-se cu tamponul de 3 ori pe acelaşi
loc. Se spală bine tamponul în serul fiziologic din
eprubetă, se stoarce cât mai bine prin presarea lui
pe pereţii acesteia. Cu acelaşi tampon se execută în
acelaşi mod ştergerea celeilalte mâini. Tamponul se
introduce în eprubeta cu ser fiziologic şi se
prelucrează în laborator.
 Se destrămă tamponul de vată prin 30-40

lovituri ale fundului eprubetei de podul palmei. Se

inoculează 1 ml într-o eprubetă cu BBLV, 4 ml într-o

eprubetă cu mediu Baird-Parker şi 5 ml (restul

lichidului plus tamponul) într-un recipient cu RVS

sau MKTTn.
 Determinarea prezenţei Salmonella/5 ml lichid
de spălare

Pentru determinarea prezenţei Salmonella/5

ml lichid de spălare se aplică metodologia
Standardului Român SR EN ISO 6579/2003
(înlocuieşte SR EN 12824/2001): „Microbiologia
produselor alimentare şi furajere. Metodă orizontală
pentru detectarea bacteriilor din genul Salmonella”.
Standardul este identic cu Standardul
Internaţional EN ISO 6579/2002: „Microbiology of
food and animal feeding stuffs – Horizontal method
for the detection of Salmonella spp.”
 a. Principiul
Generalităţi
Detectarea Salmonellei necesită patru etape
succesive. Bacteriile din genul Salmonella pot fi
prezente în număr mic şi sunt adesea însoţite de un
număr considerabil de mare de alte Enterobacterii
sau bacterii din alte familii. Mai mult,
preîmbogăţirea este necesară pentru a permite
detectarea numărului scăzut de bacterii Salmonella
sau Salmonella denaturată.
Preîmbogăţirea în medii lichide neselective se
face în apă peptonată tamponată care se inoculează
la temperatura camerei cu proba pentru analiză,
apoi se incubează la 37°C ± 1°C timp de 18 h ± 2 h.
 Îmbogăţirea în medii selective lichide se face
prin inocularea culturii preîmbogăţite pe mediul
Rappaport-Vassiliadis cu soia (bulion RVS) şi
bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocină
(bulion MKTTn).
Bulionul RVS se incubează la 41,5°C ± 1°C
timp de 24 h ± 3 h, şi bulionul MKTTn la 37°C ± 1°C
timp de 24 h ± 3 h.
Izolarea şi identificarea
Din culturile obţinute se inoculează două
medii selective solide:
❑ agar xiloză-lizină-dezoxicolat (agar XLD);
❑ agar verde Briliant (BGA).
Confirmarea identităţii
Coloniile presupuse Salmonella sunt crescute,
apoi izolate şi confirmate identitatea lor cu ajutorul
testelor biochimice şi serologice.
 b. Medii de cultură, reactivi şi seruri
Medii de cultură şi reactivi
❑ mediu de preîmbogăţire neselectiv: apă
peptonată-tamponată;
❑ primul mediu de îmbogăţire selectiv: mediu
Rappaport-Vassiliadis cu soia (bulion RVS);
❑ al doilea mediu de îmbogăţire selectiv: bulion
Muller – Kauffman – tetrationat – novobiocin (bulion
MKTTn);
❑ primul mediu de izolare selectiv solid: agar
xiloză-lizină-dezoxicolat (agar XLD);
❑ al doilea mediu de izolare selectiv solid: agar
verde Briliant (BGA);
❑ agar nutritiv;
❑ agar TSI (triple sugar/iron agar);
❑ agar uree (Christensen);
❑ mediu pentru decarboxilarea L-lizinei;
❑ reactiv pentru detecţia β-galactozidazei;
❑ reactivi pentru reacţia Voges-Proskauer (VP);
❑ reactivi pentru reacţia indolului;
❑ agar nutritiv semisolid;
❑ soluţie salină fiziologică.
❑ seruri de aglutinare conţinând anticorpi pentru
unul sau câteva antigene "O", ser anti-Vi şi antiser
conţinând anticorpi pentru unui sau câţiva factori
"H".
 MEDIU DE PREÎMBOGĂŢIRE
Apă peptonată tamponată
25 g (ml) probă + 225 ml apă peptonată tamponată → incubare la 37ºC ± 1ºC timp de 18 ± 2 ore.

MEDIU DE ÎMBOGĂŢIRE SELECTIVĂ

0,1 ml probă 10 ml probă

+ +
10 ml RVS 10 ml bulion MKTTn
Incubare la 41,5ºC±1 ºC timp de 24 h Incubare la 37ºC ±1ºC timp de 24 h ±3
±3 h h

Mediu XLD şi mediu BGA

Incubare la 37ºC ±1ºC

Testarea a 5(cinci) colonii caracteristice din fiecare placă

Însămânţare pe agar nutritiv.

Incubare la 37ºC ±1ºC timp de 24 h ±3 h

CONFIRMĂRI BIOCHIMICE CONFIRMĂRI SEROLOGICE

INTERPRETAREA REZULTATELOR
 Confirmare
Selectarea coloniilor pentru confirmare
Pentru confirmare, se iau din fiecare placă cu
fiecare mediu selectiv cel puţin o colonie
considerată a fi tipică sau suspectă şi alte patru
colonii dacă prima este negativă.
Se însămânţează coloniile selectate pe
suprafaţa uscată în prealabil a plăcilor cu agar
nutritiv, în aşa fel încât să se permită dezvoltarea de
colonii bine izolate. Se incubează plăcile inoculate
la 37°C ± 1°C timp de 24 h ± 3 h.
Pentru confirmarea biochimică şi serologică
se folosesc culturi pure.
 Confirmare biochimică
Cu ajutorul unei anse de inoculare, se
inoculează cu fiecare din culturile obţinute din
coloniile selectate următoarele medii:
❑ Agar TSI;
❑ Agar uree;
❑ Mediu de decarboxilarea L-lizinei;
❑ Punerea în evidenţă a β-galactozidazei;
❑ Mediu pentru reacţia Voges-Proskauer (VP);
❑ Mediu pentru reacţia indolului.
 Confirmare serologică şi serotipică
Punerea în evidenţă a prezenţei antigenelor
"O", "Vi" şi "H" ale Salmonellei se face prin
aglutinarea pe o lamă de sticlă cu serul
corespunzător, a coloniilor pure după eliminarea
suşelor auto-aglutinabile. Interpretarea testelor de
confirmare se face conform tabelului 1.
 Tabelul 1
Interpretarea testelor de confirmare a Salmonellei
Reacţii Auto- Reacţii
Interpretare
biochimice aglutinare serologice
Suşele sunt
Antigen "O", "Vi"
Tipice Nu considerate
sau "H" pozitiv
Salmonella
Toate reacţiile
Tipice Nu
negative
Ar putea fi
Tipice Da Netestat
Salmonella
Reacţii Antigen "O", "Vi"
Nu/Da
netipice sau "H" pozitiv
Nu se
Reacţii Toate reacţiile
Nu/Da consideră a fi
netipice negative
Salmonella
 Determinarea prezenţei Stafilococului
coagulazo-pozitiv/4 ml lichid de spălare

Pentru determinarea prezenţei Stafilococului

coagulazo-pozitiv/4 ml lichid de spălare se aplică
metodologia Standardului Român SR EN ISO 6888-
1/2009: „Microbiologia alimentelor şi furajelor.
Metodă orizontală pentru numărarea stafilococilor
coagulază-pozitivi (Staphilococcus aureus şi alte
specii). Partea 1: Tehnică pe mediu de agar Baird-
Parker”.
 a. Principiul metodei este:

❑ inocularea suprafeţei unui mediu selectiv de

cultură solid, folosind plăci în dublu, cu o cantitate

precizată din proba de lucru;

❑ incubare aerobă a plăcilor la 35°C sau 37°C şi

examinarea atât după 24 h cât şi după 48 h.

 a. Principiul metodei este:
❑ inocularea suprafeţei unui mediu selectiv de
cultură solid, folosind plăci în dublu, cu o cantitate
precizată din proba de lucru;
❑ incubare aerobă a plăcilor la 35°C sau 37°C şi
examinarea atât după 24 h cât şi după 48 h.
❑ stabilirea prezenţei stafilococilor coagulază-
pozitivi/ 4 ml de soluţie din numărul coloniilor
tipice şi/sau atipice obţinute pe plăci în aşa fel încât
să dea un rezultat semnificativ şi confirmat prin
rezultatul unui test coagulază-pozitiv;
 b. Mediu de cultură
❑ mediul agar Baird-Parker (este mediul Baird-
Parker cu adăugare de sulfamezatină)
❑ infuzie creier-inimă;
❑ plasmă de iepure.
c. Mod de lucru
Inoculare
Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile 0,1
ml probă din suspensia iniţială (diluţia 10-1) pe
fiecare din cele două plăci cu agar. Se repetă
procedura pentru diluţia 10-2. Se distribuie inoculul
cât mai repede posibil pe suprafaţa plăcii de agar,
fără să se atingă marginile cutiei, folosind
pulverizatorul. Se lăsă plăcile să se usuce cu
capacele puse circa 15 min. la temperatura
laboratorului.
 Incubare
Se întorc plăcile pregătite şi se incubează timp
de 24 ± 2 ore apoi se reincubează din nou 24 ± 2 h
în incubator la 35°C şi la 37°C.
Selectarea plăcilor şi interpretare
După incubare de 24 ± 2 h, se marchează pe
dosul plăcii poziţia fiecărei colonii tipice prezente.
Se reincubează toate plăcile la 35°C şi la 37°C
pentru încă 24 ± 2 h şi se marchează orice nouă
colonie tipică. De asemenea se marchează orice
colonie atipică prezentă.
 Se selectează pentru confirmare un număr de
5 colonii tipice dacă au existat numai colonii tipice
sau 5 colonii atipice dacă au existat numai colonii
atipice sau 5 colonii tipice şi 5 colonii atipice dacă
ambele tipuri de colonii au fost prezente, de pe
fiecare placă.
Coloniile tipice sunt negre sau gri,
strălucitoare şi convexe (între 1 mm şi 1,5 mm în
diametru după incubare timp de 24 h şi între 1,5 mm
şi 2,5 mm în diametru după incubare de 48 h)
înconjurate de o zonă clară. După incubare de cel
puţin 24 h poate apare în această zonă clară un inel
opalescent, în contact cu coloniile.
 Coloniile atipice pot prezenta una din
următoarele caractere morfologice:
❑ colonii strălucitoare negre cu sau fără margine
îngustă albă; zona clară este absentă sau slab
vizibilă şi inelul opalescent este absent sau greu
vizibil;
❑ colonii gri fără zone clare.
Bacterii aparţinând acestui gen, altele decât
stafilococii, pot da colonii cu aspect similar
stafilococilor. Examinarea microscopică prin
coloraţie Gram, înainte de confirmare, permite să se
facă distincţie faţă de alte genuri de stafilococi.
Pentru a face o estimare a numărului celui mai
mic de stafilococi coagulază-pozitivi, se reţin toate
plăcile care conţin colonii tipice şi atipice.
 Confirmare (testul coagulazei)
De pe suprafaţa fiecărei colonii selectate se ia
inocul cu o ansă sterilă şi se transferă într-o
eprubetă cu infuzie de creier-inimă. Se incubează la
35°C şi la 37°C timp de (24 ± 2) h. Se adaugă aseptic
0,1 ml din fiecare cultură la 0,3 ml plasmă de iepure
în eprubete de hemoliză sterile şi se incubează la
35°C şi la 37°C. Prin înclinarea eprubetei se
examinează coagularea plasmei după incubare de 4
h până la 6 h şi, dacă testul a fost negativ, se
reexaminează la 24 h de incubare.
 Se consideră testul coagulazei pozitiv dacă
volumul de cheag a ocupat mai mult de jumătate
din volumul iniţial al lichidului. Pentru control
negativ, pentru fiecare lot de plasmă, se adăugă 0,1
ml infuzie sterilă creier-inimă la cantitatea
recomandată de plasmă de iepure şi se incubează
fără inoculare. Pentru ca analiza să fie validată,
plasma controlată nu trebuie să prezinte semne de
închegare.
 EVALUAREA PRIN EXAMENE
MICROBIOLOGICE A EFICIENŢEI
PROCEDURILOR DE LUCRU
STANDARD PENTRU IGIENIZAREA
OPERAŢIONALĂ
STABILIREA NUMĂRULUI TOTAL DE BACTERII

AEROBE NTG/CM2 ŞI A NUMĂRULUI PREZUMTIV

DE BACTERII COLIFORME/CM2 SUPRAFAŢĂ DE

CARCASĂ DUPĂ OPERAŢIA DE ZVÂNTARE

 a. Determinări ce se efectuează:

❑ determinarea numărului total de bacterii aerobe

NTG/cm2 de carcasă.

❑ determinarea numărului prezumtiv de b.

coliforme/cm2 de carcasă.

b. Frecvenţa şi momentul efectuării: se

recoltează probe de la 5-10 carcase, într-o singură

zi din fiecare săptămână.

 Se prelevează de la carcase, după toaletare şi
înainte de începerea procesului de răcire, 4 probe
de ţesut, reprezentând o suprafaţă totală de 20 cm2.
Cele 4 fragmente se obţin prin decuparea cu
ajutorul unui dispozitiv steril a unor lambouri cu o
suprafaţă de 5 cm2 şi grosime de maximum 5 mm
(un dreptunghi cu dimensiuni de 2,5 cm/2 cm) din
zonele de elecţie, care se introduc în condiţii
aseptice, imediat după momentul recoltării într-un
recipient sau pungă din plastic sterilă, după care se
expediază la laborator.
 Prelevarea probelor se face din următoarele
locuri de elecţie:
❑ vită: gât, piept, flanc şi coapsă;
❑ porc: spate, guşă, pulpă şi piept.
Prelevarea se face prin metoda distructivă. Se
recoltează probe de la 5-10 carcase, într-o singură
zi din fiecare săptămână de lucru. Recoltarea se
face la jumătatea programului unei zile de tăiere,
înaintea începerii procesului de răcire. Înainte de
examinare, probele recoltate din cele 4 locuri de
elecţie (coapsă, flanc, gât, piept) se pun împreună.
Până la momentul examinării, probele se
păstrează la temperatura de 4° C. Examinarea se
face în maxim 24 de ore de la recoltare.
 Probele recoltate se diluează într-o pungă de
stomacher, cu 100 ml ser fiziologic peptonat (0,1%
peptonă + 0,85% NaCl), se supune omogenizării,
utilizând un stomacher peristaltic, timp de cel puţin
2 min. la 250 rpm.
Pentru lucru se efectuează diluţii seriate în ser
fiziologic peptonat (0,1% peptonă + 0,85% NaCl).
Suspensia rezultată de la omogenizatul de carne
din punga de stomacher nu se consideră ca fiind o
diluţie, iar în calcul ea se consideră diluţia 100.
Se fac determinări pentru stabilirea numărului
total de germeni viabili (NTG) şi b. coliforme.
Pentru numărul total de germeni viabili (NTG)
aplicarea criteriilor microbiologice la rezultatele
testării probelor obţinute prin excizare se fac
conform prevederilor Ordinului MS 91/2005 care
sunt prezentate în tabelul 2.
 Tabelul 2
Valori medii logaritmice pentru rezultatele marginale sau
neacceptabile pentru criteriile de performanţă bacteriologică
(u.f.c./cm2) pentru bovine şi porcine (OMS 91/2005)
Valori
Valori
marginale
Valori acceptabile neacceptabile
(> m dar <
NTG (>M)
M)
Bovine, Bovine,
Bovine Porcine
porcine porcine
Media 3,5
valorilor <3,5 <4 (porcine 4) >5
logaritmice -5.0
Pentru verificarea procesului de control, media
logaritmică a rezultatelor trebuie să fie inclusă în una din
cele 3 categorii, acceptabil, marginal sau neacceptabil. M si
m reprezintă limitele superioare pentru categoriile marginal
si respectiv, acceptabil.
 PREZENŢA ŞI DENSITATEA BACTERIEI

ESCHERICHIA COLI (biotip 1) PE

SUPRAFAŢA CARCASELOR DE BOVINE ŞI

PORCINE
 a. Scop: prin acest procedeu se urmăreşte
depistarea prezenţei şi numărului de unităţi
formatoare de colonii de E. coli (biotip 1 sau
generic) pe 1 cm2 suprafaţă de carcasă.
b. Frecvenţa şi numărul probelor recoltate:
câte o probă în fiecare săptămână.
c. Momentul recoltării probelor şi modul de
alegere a carcaselor de la care se face recoltarea:
probele se recoltează de pe semicarcase sau
sferturi după 12-24 ore de la introducerea lor în
spaţiul de refrigerare. Carcasele care se supun
controlului se aleg la întâmplare, având în vedere
ca ele să provină atât de la începutul cât şi de la
sfârşitul programului de tăiere.
 d. Regiunile anatomice de pe care se
recoltează probele:
❑ la bovine: flancul, pieptul şi faţa internă a
coapsei;
❑ la porcine: pieptul, faţa externă a coapsei, zona
submaxilară (guşa).
Se trasează o linie imaginară în lungul
tendonului lui Ahille. În punctul unde linia
intersectează suprafaţa de secţiune a osului este
locul de recoltare a probei pentru crupă. Se
măsoară 10 cm peste locul stabilit paralel cu linia
tendonului, apoi 10 cm lateral, 10 cm spre suprafaţa
de secţiune şi încă 10 cm în lungul zonei de
secţiune pentru formarea unei zone de formă
pătrată de 10 x 10 cm2.
Recoltarea lambourilor de pe faţa internă a
coapselor de bovină
 Recoltarea probelor din zona flancului se face
astfel: se localizează zona cutanată a muşchiului
abdominal al flancului (oblicul abdominal extern) şi
se urmăreşte marginea mediană a muşchiului
anterior până la 3 inch (aproximativ) faţă de linia de
incizie mediană. Acesta a fost punctul de pornire.
Se măsoară 10 cm înapoi în lungul unei linii de ~ 3
inch de la linia de incizie (măsurat deasupra sau
paralel cu linia), apoi lateral 10 cm (~ 4”) pentru a
forma o suprafaţă de 10 x 10 cm2.
 Recoltarea probelor din zona pieptului se face
astfel: se localizează cotul pe carcasă. Se trage o
linie imaginară care traversează linia de mijloc a
pieptului. Acesta a fost punctul de pornire. Se
măsoară în sus în lungul liniei de mijloc 10 cm (~4”)
şi apoi 10 cm pentru a forma o suprafaţă pătrată de
10x10 cm2.
Recoltarea lambourilor din zona pieptului şi a
flancului de la carcase de bovine
 Recoltarea probelor din zona submandibulară
(guşa): se trasează o linie imaginară de la articulaţia
axis-atlas, la linia de secţiune ventrală. Toată
porţiunea de la această linie anterior a fost
considerată guşă.
Recoltarea probelor din zona pulpei se face
astfel: din poziţia dorsală se localizează faţa laterală
a bazei cozii şi se măsoară în sus (caudal) 5 cm în
lungul marginii laterale de slănină, apoi 10 cm
lateral. Apoi se măsoară 10 cm în jos, apoi 10 cm
median şi 5 cm în sus (posterior) pentru a completa
un dreptunghi de 10 x 10 cm2 ca zonă de recoltare
de probe.
Recoltarea probelor de la carcasele de porcine
(piept şi guşă)
Recoltarea probelor din zona pulpei de la carcasele
de porcine
 e. Modul de recoltare a probei:
De la o carcasă se recoltează o singură probă.
Proba constă din 3 lambouri de ţesuturi superficiale
(la porc opărit - şorici), groase de ~ 0,5 cm, de
forma unui pătrat cu latura de 10 cm. Cele 3 pătrate
de ţesut care formează proba totalizează 300 cm2.
Cu un şablon aseptizat se delimitează aria de
pe suprafaţa carcasei de pe care s-a făcut
recoltarea. Cu un cuţit sau foarfecă bine ascuţite se
decupează un pătrat de ţesut şi se introduce într-o
cutie Petri cu diametrul de 15-20 cm, sterilizată.
Toate cele 3 pătrate de ţesut, recoltate de la aceeaşi
carcasă se introduc într-o singură cutie Petri.
 f. Mod de lucru
Modul de prelucrare a probelor
Cele 3 pătrate care constituie proba se
mărunţesc cu o foarfecă, se amestecă cu 300 ml
diluant (tampon fosfat) şi se omogenizează timp de
2 minute în stomacher. Se obţine astfel diluţia de
bază în care 1 ml lichid reprezintă 1 cm2 suprafaţă
controlată. Din diluţia de bază se fac diluţii zecimale
succesive: 10-1, 10-2, 10-3 şi 10-4.
 Determinarea numărului de colonii de unităţi
formatoare de E. coli/cm2 se face urmând
metodologia Standardului Român SR ISO
7251/2009: „Microbiologie. Directive generale
pentru stabilirea numărului de Escherichia coli
prezumtivă. Tehnica numărului cel mai probabil.
 Principiul metodei
❑ însămânţarea a trei eprubete cu mediu de
îmbogăţire selectivă lichid dublu concentrat cu o
cantitate determinată de diluţie iniţială;
❑ însămânţarea a trei eprubete cu mediu de
îmbogăţire selectivă lichid simplu concentrat cu o
cantitate determinată de diluţie iniţială. În
continuare, în aceleaşi condiţii, însămânţarea
mediului cu diluţiile decimale obţinute din diluţia
iniţială;
❑ incubarea eprubetelor cu mediu dublu şi simplu
concentrat, la 35°C sau 37°C, timp de 24–48h.
Examinarea eprubetelor pentru constatarea
producerii de gaz;
❑ însămânţarea din eprubeta cu mediu dublu şi
simplu concentrat în care se constată o degajare de
gaz, într-o nouă serie de eprubete cu mediu de
îmbogăţire selectivă lichid;
❑ incubarea la 45°C, timp de 24...48 h şi examinarea
acestei noi serii de eprubete, pentru constatarea
producerii de gaz;
❑ însămânţarea, din eprubetele cu mediu de
îmbogăţire selectivă care prezintă o degajare de
gaz, într-o nouă serie de eprubete care conţin apă
triptonată;
❑ incubarea la 45°C timp de 24...48 h şi examinarea
acestei noi serii de eprubete, pentru constatarea
producerii de indol;
❑ cu ajutorul tabelului NCP determinarea numărului
cel mai probabil de Escherichia coli prezumtivă, din
numărul de eprubete incubate, în care s-a evidenţiat
formare de gaz (în mediu de îmbogăţire selectivă şi
producere de indol, în apă triptonată).
Se efectuează un număr suficient de diluţii,
astfel încât toate eprubetele ultimei diluţii să fie
negative. Se iau 3 eprubete cu mediu de îmbogăţire
selectivă dublu concentrat. Cu o pipetă sterilă se
introduc, în fiecare din aceste eprubete, câte 10 ml
diluţie iniţială. Se iau apoi 3 eprubete cu mediu de
îmbogăţire simplu concentrat. Cu o pipetă sterilă se
introduc în fiecare din eprubete, câte 1 ml diluţie
iniţială.
 Pentru fiecare din diluţiile următoare se
procedează similar. Pentru fiecare diluţie se
utilizează o nouă pipetă sterilă. Se amestecă bine
inoculul cu mediul. Se incubează eprubetele cu
mediu de îmbogăţire selectivă dublu concentrat şi
eprubetele cu mediu de îmbogăţire selectivă simplu
concentrat în termostat la temperatura de 35°C sau
37°C timp de 24 h ± 2 h.
Dacă în acest stadiu nu se observă formare de
gaz, nici tulburare care să împiedice observarea
unei degajări de gaz, se prelungeşte incubarea
până la un total de 48 h ± 2 h.
 Cu ajutorul unei anse, din fiecare eprubetă
incubată, care a prezentat degajare de gaz se
însămânţează câte 10 ml mediu selectiv, încălzit în
prealabil la 45°C. Se incubează eprubetele
însămânţate în baie de apă reglată la 45°C, timp de
24 h ± 2 h. Dacă, în acest stadiu, nu se produce
degajare de gaz, incubarea se prelungeşte la 48 h.
Din fiecare eprubetă incubată care prezintă o
degajare de gaz, se însămânţează cu ansa buclată,
câte o eprubetă cu apă triptonată, încălzită în
prealabil la 45°C. Se incubează eprubetele
însămânţate în baie de apă, la 45°C, timp de 48 h. În
eprubetele care conţin cultură în apă triptonată se
adaugă câte 0,5 ml reactiv pentru identificarea
indolului, se amestecă bine şi se examinează după
1 min.
 Interpretare
Pentru fiecare diluţie se ia în calcul numărul
de eprubete în care faza alcoolică a devenit roşie
indicând astfel prezenţa indolului (eprubete
pozitive).
În funcţie de diluţie şi de numărul de eprubete
pozitive confirmate pe fiecare diluţie, se stabileşte
numărul cel mai probabil (MPN) de E. coli/cm2.
Rezultatul se exprimă printr-o cifră cuprinsă
între 1,0 şi 9,9 înmulţit cu 10x, x fiind puterea
corespunzătoare a lui 10. Un rezultat neacceptabil
este suficient pentru a considera că procesul de
tăiere este neigienic şi obligă la reexaminarea
modului de aplicare a procesului, de detectare a
cauzei, pentru a preveni reapariţia lui.