Metode de numarare

a microorganismelor
Cuprins
1. Ce sunt microorganismele?
2.Determinarea incarcaturii microbiene.
3.Metode optice
4.Lama Thoma
5.Determinarea numarului cel mai probabil de celule(MPN)
6.Metode de evaluarea automata a numarului de celule
Ce sunt microorganismele?
• Microorganismele sunt organisme microscopice
vegetale și animale de dimensiuni mici, invizibile
cu ochiul liber, în general, unicelulare, cu
structură internă relativ simplă. Trăiesc în sol, în
apă, în aer, în corpul plantelor sau al animalelor
și pot fi saprofite sau patogene pentru
organismul în care se dezvoltă.
Determinarea incarcaturii microbiene
• Se realizează,pe de o parte, pentru controlul calității în ceea ce privește
prezența și nivelul microorganismelor, iar, pe de altă parte, pentru
aprecierea nivelului activității unei populații microbiene, utilă în diferite
ramurii industriale (la întocmirea curbei de creștere).
Cuantificarea încărcăturii microbiene a unei probe se poate realiza prin:
• procedee optice, cu ajutorul microscopului, determinând numărul total
de
microorganisme (fără a putea diferenția celulele moarte de cele viabile);
• metode biologice, care țin cont de multiplicarea microorganismelor,
determinând numărul de germeni viabili prezenți în probă.
Metode optice
• În acest scop, se utilizează lame
special confecționate , numite
camere de numărat de tipul
hematimetru (de exemplu: lama
Thoma, camera de numărat
Burcker-Turk, lama Neubauer, lama
Malassez), care permit numărarea
celulelor dintr-un volum determinat
de lichid din proba de analizat.
Aceste lame speciale prezintă grile
cu pătrate de 1 mm2, gravate, ce
permit numărarea celulelor din
suspensia de analizat.
Dezavantajele metodelor optice
Deși aceste procedee sunt ușor de
pus în practică, prezintă câteva
dezavantaje:
- nu se pot deosebi celulele vii de
cele moarte;
- sunt greu de aplicat pentru
bacteriile foarte mici;
- nu oferă date cu un grad înalt de
exactitate.
 Lama Thoma

Lama Thoma este cea mai frecvent utilizată în

determinarea numărului total de celule. Lama
Thoma este compusă dintr-o lamă specială de
sticlă (portobiect), care are gravată pe mijloc o
rețea cu latura de 1 mm și suprafața de 1 mm2,
împărțită în 400 de pătrățele. Suprafața unui
pătrățel este de 1/400 mm2, adică 0,0025 mm2.
Mod de lucru
1.Lama de numărat Thoma și
lamela acoperitoare trebuie să fie
perfect curate și degresate (prin
spălare cu apă distilată, ștergere
cu alcool și uscare cu ajutorul unui
tifon curat).
2. Proba poate fi utilizată ca atare
sau diluată prin aplicarea tehnicii
diluțiilor zecimale.
3. Probele lichidă, respectiv diluțiile de
examinat trebuie să fie bine
omogenizate înainte de efectuarea
preparatului microscopic , pentru ca
rezultatele să exprime cât mai exact
realitatea.
4. Cu ajutorul unei pipete Pasteur
sterile, se depun pe lama Thoma câteva
picături de suspensie microbiană, care
se acoperă imediat cu lamela, astfel
încât grosimea stratului de lichid dintre
lamă și lamelă să fie de 0,1 mm.
5.Lama astfel pregătită se așază pe
măsuța microscopului și se lasă în
repaus, timp de cel puțin 3 minute
în cazul drojdiilor și de 15 minute în
cazul bacteriilor,pentru 8.Schema de numărare a celulelor
sedimentarea microorganismelor. dintr-un pătrat format din 16
6. Lama Thoma este examinată la pătrățele este prezentată mai sus,
microscop, cu obiectivul de 10x cu observația că celulele care
pentru prinderea caroiajului lamei și intersectează liniile de reper nu se
apoi cu 40x pentru efectuarea iau în considerare, decât dacă sunt
numărării. jumătate sau mai mult de
7.Pentru numărarea celulelor, se jumătate în interiorul pătratului de
examinează 5 pătrate mari; de interes.
obicei se numără microorganismele
aflate în cele patru pătrate din
colțurile rețelei și dintr-un pătrat
situat în partea centrală a grilei.
9.Numărul de celule de microorganisme dintr-un mililitru de probă se
calculează după următoarea formulă:

X = numărul de celule dintr-un mililitru de suspensie;

a = numărul de celule numărate în pătratele luate în considerare (în
principiu, 5 pătrate mari);
b = numărul de pătrățele în care s-a efectuat numărarea (în principiu, 5 ×
16 = 80 pătrățele);
c = inversul diluției suspensiei de examinat;
4 * 106 = coeficient pentru exprimarea rezultatului la 1 mL.
Determinarea numarului cel mai probabil de
celule
• Metoda pentru determinarea
cantitativă a numărului cel mai
probabil (MPN =most probable
number) de microorganisme
dintr-o probă se mai numește și
metoda McCrady sau tehnica
tuburilor multiple, și se bazează
pe un calcul statistic.
• Un mediu de cultură adecvat
este însămânțat cu un volum
determinat de inocul(suspensie-
mamă sau diluție). După
incubare, se apreciază prezența
(+) sau absența (-) caracteristicii
fiziologice urmărite (de exemplu:
fermentația unui glucid prin
virajulunui indicator, eliberarea
de gaz, cu ajutorul tubușoarelor
Durham etc.).
• Metoda care permite estimarea
concentrației celulare dintr-o
suspensie microbiană răspunde
postulatului conform căruia, într-
un mediu lichid,
microorganismele sunt
dispersate total aleator
(exemplu: 1 mL de suspensie
poate să conțină un număr de
celule ce va putea fi egală cu 0,
1, 2, 3, 4, 5 ș.a.m.d.).
Validarea procedeului presupune anumite condiții: 
 Microorganismele trebuie să fie distribuite aleator în suspensie, fără să
existeforțe de repulsie sau de atracție între ele (floculare); 
 O singură celulă microbiană viabilă, existentă într-o probă, trebuie să
determineun răspuns pozitiv; 
 Orice probă lipsită de microorganisme nu poate da un răspuns pozitiv;
O atenție sporită trebuie acordată manipulărilor ce se impun în laborator,
pentru a evita posibile contaminări.
Dezavantajele metodei
Determinarea numai a numărului probabil de microorganisme viabile
prezenteîntr-o probă; 
Necesitatea efectuării de calcule și citirea cu atenție a tabelului McCrady; în
caz contrar, rezultatele obținute nu reprezintă realitatea;
Implicarea unui timp de lucru și a unui consum de materiale destul de mare,
de care depinde reușita rezultatelor obținute.

Această metodă se folosește mai ales pentru determinarea micro-

organismelor din anumite grupe fiziologice (de exemplu: drojdiile
fermentative, bacteriile celulozolitice), dar se aplică cu succes și în
determinarea microflorei totale.
Principalele medii selective recomandate
pentru determinarea MPN sunt:
Medii în care se evidențiază creșterea microorganismelor prin metode
turbidimetrice; 
Medii în care se evidențiază producerea de gaz; 
 Medii în care se evidențiază producerea de acizi sau baze, cu ajutorul
substanțelor indicatoare de pH; 
Medii în care se evidențiază reducerea unor substanțe.
Formula de calcul

MPN = n * c
MPN = numărul cel mai probabil de germeni;
n = corespondentul numărului caracteristic, din tabelele McCrady;
c = inversul diluției de referință.
Metode de evaluare automata a numarului de
celule
• Se realizează cu ajutorul unor • Pe o placă Petri cu mediu nutritiv
aparate special proiectate în adecvat, proba este însămânțată
acest scop, care funcționează pe în spirală,astfel încât spre
principiul aspirării, printr-un marginile cutiei are loc o
orificiu, a celulelor individuale, diminuare progresivă a
aflate într-o suspensie, trecerea volumului de probă(ce
fiecărei celule modificând corespunde unei diluții 1:1.000)
rezistența electrică a sistemului
și producând un impuls care este
înregistrat de un dispozitiv de
numărare electronică.
După perioada de incubare în condiții optime de dezvoltare, citirea rezultatelor
se realizează fie manual (folosind o grilă specială de evaluare a numărului, după
care rezultatele sunt ulterior analizate statistic), fie automat (folosind un
numărător automat cu fascicul laser și un computer ce poate determina și
înregistra concentrația microbiană din proba de analizat, plecând de la volumul
depus și de la numărul de colonii apărute pe mediu respectiv).

Utilizari:
În laboratoarele de control microbiologic al produselor alimentare, unde
volumul de lucru este foarte mare (de exemplu: în industria laptelui, este folosit
aparatul Spiral Autoplate 3000, complet automatizat, care permite
cuantificarea numărului de microorganisme dintr-o probă lichidă, prin
însămânțarea probei sub forma unei spirale, ce pornește din centrul plăcii).
Va multumesc pentru atentie!