1. Metode de evaluare a populatiilor microbiene.Clasificare.

Tehnici de diluare si concentrare - metode directe, care permit evaluarea concentraiei de celule sau a biomasei sau metode indirecte, n care evaluarea se va face prin analiza unui parametru aflat n corelaie cu coninutul de biomas (turbiditatea mediului cultivat, fluorescenta, impedana);- metode nonculturale, care permit evaluarea rapid a populaiei microbiene analizate i metode culturale, care necesit o perioad de incubare pentru creterea coloniilor i stabilirea rezultatului analizei; metode automatizate, "on line", care permit analiza direct a probelor din fermentator, sau metode care necesit prelevarea aseptic de probe pentru analiz. Tehnici de diluare - Serii liniare, n care concentraia de microorganisme descrete n progresie aritmetic (de exemplu: 0.8/0.6/0.4/0.2) i care sunt puin utilizate; - Serii logartmice (diluii decimale), n care concentraia de microorganisme descrete n progresie geometric (ex. 0.1/0.01/0.001/0.0001 etc.). Pentru realizarea diluiilor decimale, ntr-un numr de eprubete sterile egal cu numrul de diluii necesar a se efectua, se pipeteaz aseptic 9 cm3 de lichid de diluie (ser fiziologic steril, ap distilat steril, mediu Ringer - pentru Escherichia coli). Tehnici de concentrare - utilizate n special pentru punerea n eviden a microorganismelor patogene; Metode de mbogire, care presupun inocularea probei de analiz ntr-un mediu favorabil pentru multiplicarea rapid a celulelor aflate n concentraii reduse n proba de analizat i, dup termostatare n condiii optime de cultivare, se verific prezena sau absena microorganismelor analizate, fr o determinare efectiv a concentraiei de celule; Metode de separare fizic sau fizico-chimic a celulelor prin filtrare, centrifugare, floculare, sedimentare, n care se determin concentrarea celulelor pe unitatea de volum, ceea ce asigur posibilitatea evidenierii lor ulterioare prin tehnici directe sau culturale; Metode de separare prin interaciuni hidrofobe-hidrofile, interaciuni ale sarcinilor electrice, anticorp-antigen, cu lectine. 2. Numararea microorganismelor prin examen microscopic direct folosind citometrul THOMA Celulele de drojdii i sporii de mucegai se pot numra, prin examen microscopic direct, cu ajutorul citometrelor. Un citometru este o lam de sticl groas, prevzut cu trei platforme separate ntre ele prin rigole n sticl. Platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu o nlime de 0,1- 0,2 mm (nscris pe fiecare camer). Pe platforma central este gravat o reea de linii perpendiculare, care delimiteaz o anumit suprafa divizat de ctre linii perpendiculare n microcelule de form ptratic (ptrele elementare). Diferenierea dintre tipurile de citometre const n mrimea variabil a suprafeei unui ptrel elementar. n cazul citometrului Thoma, suprafaa de 1 mm2 este divizat n 400 de ptrele elementare cu latura de 1/20 mm. Numrul de celule prezente ntr-un cm de suspensie de analizat se determin cu formula: N = n4 106 k n care: N este numrul mediu de celule pe un ptrel elementar; k - coeficient de diluie. n cazul bacteriilor, aceast metod este greu de aplicat, att din cauza dimensiunilor reduse ale celulelor ct i a faptului c de multe ori ele prezint mobilitate. 3. Estimarea electronica a numarului de microorganisme.Principiul de functionare al aparatului de tip Coulter Aparatul de tip Coulter funcioneaz dup urmtorul principiu: De o parte i de alta a unui tub prevzut cu un orificiu calibrat sunt dispui doi electrozi de platin imersai ntr-un electrolit, ale cror borne sunt conectate la tensiune continu. Prin aspiraia provocat la partea superioar a tubului, celulele aflate n exteriorul tubului trec pe rnd prin orificiu i deplaseaz o dat cu fiecare pasaj un volum de electrolit egal cu cel al celulei. Aceasta provoac o cretere tranzitorie a rezistenei circuitului, ceea ce genereaz un impuls electric a crui amplitudine este proporional cu volumul celulei. Impulsurile fiind de foarte scurt durat, aparatul permite numrarea unui numr mare de celule, una cte una, ntr-un timp foarte scurt. Este posibil i o clasificare a celulelor n funcie de de volumul lor. Aceast tehnic, dei sofisticat, este considerat extrem de interesant i se aplic cu succes pentru analiza suspensiilor de drojdii, realiznd simultan cu numrarea i dimensionarea celulelor. Rezultatele sunt reproductibile cnd se utilizeaz suspensii diluate de celule; Sarcina electric a celulelor poate influena analiza conducnd la obinerea de rezultate eronate; Aceast tehnic nu se poate aplica n cazul culturilor ce conin n suspensie, alturi de celulele microorganismului cultivat, i particule solide.

4. Citometria in flux Permite numrarea i aprecierea strii fiziologice a celulelor, cnd detecia se face prin msurarea fluorescentei emise de celulele n prealabil marcate cu un colorant (fluorocrom). Dup colorare celulele sunt antrenate printr-un orificiu ngust i trec una cte una prin faa unei surse luminoase. Fluorescenta emis de fiecare microorganism este captat printr-un fotomultiplicator i analizat. Rezultatele sunt traduse pe o histogram care red numrul de evenimente n funcie de intensitatea fluorescentei. Aceast histogram traduce deci un profil al populaiei. Principiul de funcionare al citometrului n flux: a, b exemple de sisteme de detecie c diagram de repartiie a dimensiunilor Adesea markerii colorani utilizai pot oferi diferite tipuri de rspunsuri: - Dac colorantul este un marker de viabilitate, din histogram se deduce numrul de celule viabile i starea fiziologic a populaiei. - Dac histograma cuprinde net dou picuri este posibil numrarea separat a microorganismelor dintr-o cultur mixt (de exemplu, streptococi i lactobacili). Dac markerul este un anticorp sau o sond nucleic se pot numra specific anumite microorganisme dintr-o populaie eterogen. 5. Microscopia in fluorescenta si imunofluorescenta Tehnica de microscopie n fluorescen utilizeaz colorani specifici pentru diferenierea celulelor vii de cele moarte. - prin suspensionarea celulelor de drojdie n soluie diluat de albastru de metilen cu citrat n preparat microscopic se vor putea diferenia celulele vii (incolore) de cele moarte (colorate n albastru). - n mod similar, pot fi difereniate bacteriile vii de cele moarte dup colorare cu acridin oranj. Tehnica de microscopie n imunofluorescen permite detectarea unei categorii particulare de microorganisme cu ajutorul anticorpilor specifici. 6. Tehnica clasica de numarare prin cultivare pe medii dense, in placi Petri Metodologia de analiz presupune adoptarea a dou modaliti de inoculare a celulelor n/pe mediul de cultur solidificat, n plci Petri, i anume: a.inoculare n masa mediului solidificat, cnd 1 cm3 din fiecare diluie se transfer cu cte o pipet steril n plci Petri sterile. Peste suspensia din fiecare plac se repartizeaz cte o eprubet de mediu de cultur specific, cu agar (10-15 cm3), fluidifcat i temperat la 40...45C. Mediul se omogenizeaz cu suspensia din plac prin micri orizontale, circulare ale plcii. Dup solidificarea mediului, prin termostatare n condiii optime, se vor forma colonii att la suprafaa mediului ct i n profunzimea acestuia. Acest mod de cultivare este cel mai favorabil pentru microorganismele facultativ anaerobe, dar i microorganismele aerobe le tolereaz destul de bine. n cazul microorganismelor anaerobe se recomand cultivarea n dublu strat, adic dup nglobarea celulelor n mediu i solidificare, primul strat de mediu se acoper cu nc un strat de mediu steril; b. inoculare prin rspndirea celulelor pe suprafaa mediului solidificat, cnd 0,1 cm3 prob diluat se transfer ntr-o plac Petri steril, n care. n prealabil, a fost repartizat mediul de cultur cu agar. Suspensia se rspndete uniform pe ntreaga suprafa a mediu-luide cultur cu ajutorul unui instrument special (de exemplu, spatul Drigalski). Aceast tehnic prezint dezavantajul c unele celule pot s rmn ataate de instrumentul de etalare, cu efecte negative asupra acurateei rezultatului analizei. Pentru obinerea unor rezultate mai concludente se recomand inocularea a cte dou plci n paralel pentru fiecare diluie analizat. Numrarea indirect a microorganismelor prin cultivare pe medii dense Citirea i interpretarea rezultatelor Dup termostatarea n condiii optime, apariia vizibil a coloniilor va depinde de particularitile fiziologice ale microorganismelor cultivate i de condiiile de cultivare, de obicei dup 48-72 h de cultivare. n funcie de numrul de colonii evideniate n plcile din care sa fcut numrarea se va calcula numrul de microorganisme pe gram sau cm 3 prob de analiz, cu formula: ufc/cm3 (g) = n d n care d este coeficientul de diluie corespunztor plcii din care s-a realizat numrarea; n cazul n care pentru aceeai diluie s-au inoculat cte dou plci n paralel, n reprezint media aritmetic a coloniilor numrate n cele dou plci. In cazul numrrii coloniilor punctiforme se pot folosi sisteme dotate cu surs de lumin, lup pentru mrirea imaginii i un dispozitiv de marcare i nregistrare a coloniilor numrate. 7. Utilizarea Petrifilmelor pentru analiza microbiologica cantitativa si calitativa "Petrifilms" - discuri n care mediul de cultur specific este deshidratat i acoperit cu o folie din plastic. La inocularea a 1 cm3 suspensie de

celule, apa coninut n suspensie rehidrateaz mediul i prin termostatare este posibil creterea microorganismelor. Exist diferite tipuri de Petrifilm pentru: numr total de microorganisme, drojdii, bacterii coliforme. Avantaje: reducerea timpului de analiz, reducerea preului de cost/prob, creterea numrului de probe analizate, creterea calitii i mbuntirea substanial a productivitii. Tehnica de utilizare a Petrifilmelor Particulariti ale Petrifilmelor 3M

- TTC clorur de trifenil tetrazoliu (culoarea vireaz spre rou datorit reducerii de ctre microorganisme cu formare de formazan); - BCIP - brom cloro indoxil fosfat (indicator pentru fosfataz, produs in general de drojdii i mucegaiuri; virajul culorii, precipitat bleu); - BCIG brom cloro indoxil glucuronid este indicator al glucuronidazei, pe care o posed Escherichia coli; are loc virajul culorii precipitat bleu.

8. Evaluarea numarului de microorganisme dupa flitrare prin membrana Aceast metod se preteaz la analiza probelor lichide cu un coninut redus de microoganisme, care nu conin compui ce produc colmatarea filtrului. Pentru analiz, o cantitate controlat de lichid de analizat (1 - 10 cm3) se transfer aseptic n rezervorul aparatului de filtrare, apoi lichidul se trece prin filtru (cu pori mici, capabili s rein toate microorganismele), dup care membrana se ridic aseptic cu o penset steril i se transfer ntr-o plac Petri steril n care n prealabil s-a repartizat mediul de cultur adecvat, cu agar. In alte cazuri, mediul de cultur specific este impregnat n membran i astfel, dup filtrare, membrana se plaseaz ntr-o plac Petri steril. Prin termostatare n condiii optime la suprafaa membranei se formeaz colonii caracteristice, care se pot numra i analiza din punct de vedere morfologic. 9. Evaluarea numarului de microorganisme prin utilizarea mediilor de imersie Tehnici moderne prevd cultivarea microorganismelor pe lame de mediu cu geloz sau benzi de hrtie impregnate cu medii adecvate. Lamele cu medii de cultur gelozate se menin n tuburi speciale, sterile. In momentul utilizrii se extrage aseptic lama din tub, se imerseaz n proba de analizat, dup care se reintroduce n tubul steril i se termostateaz la temperatura optim de cretere, specific microorganismelor analizate. Dup termostatare, 16-24 h pentru bacterii i 3-4 zile pentru drojdii i mucegaiuri, se pot numra coloniile caracteristice care s-au dezvoltat la suprafaa lamei. Lame specializate pentru control microbiologic selectiv - lame Hychech (Difco) (medii gelozate: PCA + PCA 0,01 TTC*) -destinate pentru determinarea numrului total de microorganisme; - lame pentru evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae (geloz tripticaz soia + VRBC geloz); - lame pentru evidenierea selectiv a bacteriilor din genul Pseudomonas (mediu specific cu geloz); - lame pentru determinarea fungilor filamentoi (geloz tripticaz soia; tripticaz soia cu TTC + geloz cu roz bengal i cloranfenicol .a.); - lame Biokar - pentru numr total de coliformi; numr total de drojdii i mucegaiuri; - lame Lactocult - pentru controlul microbiologic al laptelui; - lame Microtest. Benzile de hrtie impregnate cu medii selective (Dacto Strip) - sunt alte sisteme comerciale pentru controlul microbiologic rapid i eficient al alimentelor. - se preteaz cel mai bine la controlul produselor lichide (industria laptelui); - constau din benzi sterile de hrtie impregnate cu mediu specific, pentru care se precizeaz: timpul necesar de meninere n contact cu proba de analizat; volumul de lichid pe care l adsorb (0,1-

1 cm3). - Pentru analiz, banda steril se imerseaz n lichidul de analizat, apoi se reintroduce in ambalajul steril i se termostateaz in condiii optime. 10. Tehnici de evaluare a cresterii prin determinarea globala a biomasei - pot fi aplicate att pentru evaluarea populaiilor aparinnd microorganismelor unicelulare, dar mai ales n cazul microorganismelor filamentoase. biomasa microbiana este recuperat, n general prin centrifugare (2000-4000 rot., 10 min., la 4C), este splat de mai multe ori cu soluie 0,9% NaCl, pentru ndeprtarea impuritilor din mediul de fermentaie, reinute o dat cu celulele, apoi uscat la temperatura de 105C, pn la greutate constant. Dezavantaje - este puin sensibil; - nu se aplic dect n cazul mediilor lichide fermentate n care microorganismele sunt singurele particule n suspensie; - nu se poate face distincie ntre biomasa vie i cea autolizat; - coninutul de biomas nu reflect ntotdeauna gradul de multiplicare al celulelor. De exemplu, n cazul mucegaiurilor, celulele cresc acumulnd intracelular substane de rezerv i formeaz perei celulari groi fr s se produc diviziunea celular. 11. Estimarea cantitatii de biomasa prin dozarea unor constituienti celulari Determinarea cantitativ a unor componeni aflai n concentraie aproximativ constant n celulele microbiene ofer indicaii asupra evoluiei unei culturi. Principiul acestor metode const n msurarea concentraiei unor componeni celulari i, considernd aceasta aproximativ constant per celul, este posibil stabilirea prin echivalen a concentraiei de biomasa. Astfel de componeni sunt: proteine, acizi nucleici (ARN, AND), ATP, NADH. Celulele separate de mediul de fermentaie prin filtrare sau centrifugare sunt splate pentru ndeprtarea impuritilor, apoi sunt supuse unor tratamente mecanice sau fizice pentru eliberarea componenilor celulari i evaluarea acestora prin tehnici standardizate de analiz. Determinarea concentraiei proteinelor celulare - Creterea i multiplicarea celulelor este n dependen direct cu biosinteza de proteine. Pentru evaluarea coninutului total de proteine sunt recomandate metodele clasice: metoda biuretei, metoda Lowry, metoda Bradford, metoda Kjeldahl, sau hidroliza proteinelor i dozarea aminoacizilor. Metoda biuretului este cea mai recomandat n astfel de studii. Principiul metodei const n formarea unui complex colorat ntre ionii de cupru i gruprile proteice ncrcate cu sarcini negative. Metoda Lowry se utilizeaz atunci cnd concentraia de celule n suspensia de analizat este mic. Cantitatea de proteine se determin prin comparaie cu o curb etalon cu albumina seric bovin. Coninutul n proteine se poate exprima i prin dozarea azotului, utiliznd metoda Kjeldahl (proteine = Nx 6,25). Determinarea acizilor nucleici - Biomasa microbiana are un coninut remarcabil, constant, de ADN. Acest constituent este n general absent n ingredientele mediului de cultur, ceea ce exclude eventualele interferene, dar, din pcate, determinarea sa este destul de sofisticat, necesitnd tehnici de liz a celulelor, extracie, separare. Pentru dozare se apeleaz la metode spectrofotometrice (= 260 nm) sau colorimetrice. Studiul acizilor nucleici este utilizat mai mult pentru identificare. Determinarea coninutului de ATP Evaluarea biomasei microbiene prin determinarea coninutului de ATP tinde s se generalizeze. ATP-ul este un constituent normal al celulelor vii, fiind un intermediar important al metabolismului celular cu rol n metabolismului energetic. Principiul metodei de determinare a ATP-ului se bazeaz pe emisia luminoas produs prin oxidarea luciferinei la oxiluciferin, reacie catalizat de ctre enzima luciferaz n prezen de ATP. Aceast emisie, care poate fi msurat spectrofotometric, este obinut n cteva secunde, conform ecuaiei: ATP + luciferina + O2 oxiluciferin + AMP+ PPi + CO2 + lumina. Msurarea bioluminescenei se realizeaz la = 562 nm cu ajutorul unor aparate speciale (fluorimetre). Variaia coninutului de ATP al microorganismelor este n funcie de specie i de starea fiziologic, cu factori de variaie de la 1 la 10. Dezavantaje - Metoda este laborioas mai ales dac se au n vedere dificultile de extracie a ATP-ului din celulele microbiene. Tehnica de analiz a ATP-ului nu ofer rezultate corespunztoare n cazul unor populaii eterogene ce conin celule de vrste variabile. Aceast tehnic se aplic cu succes pentru studiul culturilor pure n sisteme continue de fermentaie. Pentru rezultate mai concludente se recomand corelarea coninutului n ATP cu numrul de celule. 12. Evaluarea populatiilor microbiene prin masurarea fluorescentei Aceasta poate fi emis de anumii componeni celulari, care au abilitatea de a reemite lumina absorbit prin modificarea lungimii de und Compuii care emit fluorescent (fluorofluori) cu importan pentru evaluarea populaiilor microbiene Relaia dintre fluorescent i concentraia compusului care emite fluorescent - Dac fiecare celul conine o concentraie intracelular

aproximativ constant a unuia din fluorofluorii prezentai n tabel concentraia de celule se poate determina n funcie de fluorescenta emis, msurat spectrofotometric, conform curbei

Principiul msurrii fluorescentei unei culturi - Dintre compuii fluorofluori, cel mai adesea se recurge la NADH, care emite fluorescent la 460 nm, cnd este excitat n lumin la lungimea de und = 340 nm n forma oxidat (NAD) coenzima nu are fluorescen. n cursul creterii celulare cantitatea de NADH crete n raport direct proporional cu multiplicarea celulelor, permind astfel evaluarea concentraiei de biomas.

Factori care influeneaz fluorescenta - pH, temperatur, prezena unui agent antispumant, modificri ale activitii metabolice a celulelor determinate, spre exemplu, prin limitarea oxigenului. Pentru msurare se lucreaz ntotdeauna cu celule vii, cu o stare fiziologic constant. Aceast metoda de analiz permite evaluarea celulelor vii, este relativ specific, sensibil i exact, dar aplicarea sa este recomandat pentru evaluarea populaiilor ce conin celule cu vrste i stri fiziologice constante (culturi continue, sincrone). n practica industrial fluorescenta se msoar "on line" direct n bioreactor. 13. Tehnici turbidimetrice si nefelometrice de evaluare a cresterii microorganismelor Metoda comparativ O metod simpl (tehnica mestrezat) const n compararea turbiditii unei suspensii de celule cu turbiditatea unor etaloane cu albumin. De exemplu, turbiditatea unei suspensii de bacterii de 5-109 bacterii/cm3 corespunde unei suspensii cu o concentraie de 0,5 g/dm3 albumin. Aceast metod este mai puin precis i se utilizeaz de obicei n studii comparative. Metoda turbidimetric Tehnica permite stabilirea concentraiei de celule n funcie de absorbana suspensiei de celule, care se determin cu ajutorul unui spectrofotometru sau nefelometru. Principiul metodei - Similar cu legea Beer-Lambert exist o proporionalitate ntre absorbanta culturii (densitatea optic) i concentraia de celule n suspensie, conform relaiei: A=IC n care: A este absorbanta, msurat la = 600 nm; - coeficient de extincie ''celular; C - concentraia celulelor n suspensie. n funcie de substana uscat a masei celulare i de absorbana culturii, comparativ cu mediul de cultur steril considerat ca referin, poate fi trasat o curb etalon A = f (biomas substan uscat). Aceast corelaie este valabil pn la o valoare limit a absorbantei, variabil n funcie de: aparatul de msur, lungimea de und, natura suspensiei .a. Corelaia absorbanbiomas substan uscat

Aplicabilitate - Aceast metod rapid este valabil n cazul microorganismelor unicelulare dezvoltate n medii definite i limpezi. Prezena de particule n suspensie, altele dect celulele microbiene, perturb evident msurtorile. Tehnica nu se preteaz ntotdeauna pentru evaluarea creterii microorganismelor filamentoase. Se poate aplica pentru msurri n sistem continuu ("on line"), pe tot parcursul desfurrii procesului fermentativ, graie punerii la punct a unor biofotometre sterilizabile cu funcionare continu. Metoda nefelometric - permite msurarea luminii difuze i ofer informaii asupra dimensiunilor celulelor i concentraiei lor n suspensii lichide. - n practica de laborator se prepar etaloane nefelometrice din sulfat de bariu, ntr-o serie de 10 eprubete egale se repartizeaz o soluie de clorur de bariu 1%, n cantiti progresiv crescnde de la 0,1 cm3 Ia 1 cm3 . - n fiecare eprubet se completeaz apoi volumul pn la 10 cm3, cu o soluie de acid sulfuric 1%. - opacitatea format de sulfatul de bariu rezultat din reacie corespunde n prima eprubet unei concentraii bacteriene de 3108 celule/cm3; etalonul urmtor corespunde la o concentraie de 6108 celule/cm3; al treilea etalon, la 9108 celule/cm3. Eprubetele ce conin etaloanele se obtureaz cu dopuri de cauciuc, pentru a preveni concentrarea, iar n momentul utilizrii se omogenizeaz coninutul. 14. Evaluarea proprietatilor microbiene prin studiul potentialului redox Potenialul de oxido-reducere rH Numeroase microorganisme modific potenialul oxido-reductor al mediilor de cultur prin utilizarea oxigenului i eliberarea substanelor reductoare ca urmare a activitii lor reductazice. Intensitatea i viteza de modificare a potenialului redox depind de numrul i natura microorganismelor, de activitatea metabolic, de natura mediului de cultur i de condiiile de mediu (aerare, agitare, temperatur) etc. Tehnici de evaluare a activitii reductazice se aplic n prezent pentru aprecierea numrului de microorganisme vii din lapte, carne, sucuri. Principiul metodelor bazate pe studiul potenialului oxido-reductor Acestea se bazeaz pe msurarea timpului necesar pentru virajul culorii unui indicator redox, timp care este in direct concordan cu numrul de microorganisme vii din proba de analizat. De exemplu, un numr de 106 bacterii produc reductaze care determin decolorarea unei soluii de albastru de metilen dup o or, ca urmare a trecerii albastrului de metilen din forma oxidat, colorat n albastru, la un leucoderivat incolor. Aceast metod nu este specific i, n general, este utilizat pentru aprecierea numrului total de bacterii vii. Cei mai utilizai indicatori redox sunt: resazurina, albastru de metilen, clorura de trifeniltetrazoliu (TTC). Indicatori redox utilizai pentru aprecierea numrului total de bacterii

15. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea pH-ului si a vascozitatii Determinarea pH ului - Ca urmare a activitilor metabolice, microorganismele determin frecvent modificarea pH-ului mediului de cultur prin formare sau consum de acizi organici, producerea de compui alcalini sau ca efect al schimburilor ionice. Atunci cnd aceste modificri pot fi corelate cu creterea, este posibil estimarea concentraiei de biomas. Modificarea pH-ului mediilor de cultur este n general sesizat senzorial prin virajul culorii unui indicator de pH. Nivelul de detecie al acestei metode este foarte sczut. Se prefer s se realizeze dozarea titrimetric cu determinarea: aciditii totale i volatile, alcalinitii totale, azotului bazic total, volatil. Evaluarea viscozitii mediului - Ca urmare a evoluiei proceselor metabolice celulare pe parcursul fermentaiei se produc modificri ale proprietilor reologice ale mediului fermentativ. Modificarea viscozitii mediului fermentativ poate constitui un criteriu de evaluare a creterii. Aceasta se poate datora fie consumului unui nutrient (de exemplu glicerol), fie acumulrii de produi de fermentaie (poliglucide: xantan, dextran .a.), sau ca urmare a creterii concentraiei de

celule. Exist n prezent viscozimetre pentru un domeniu larg de msurare a viscozitii, care pot face msurtori on line". Pentru cazul vscozitilor foarte mari nu s-a realizat pn un prezent un instrument de precizie pentru msurarea viscozitii. 16. Evaluarea proprietatilor microbiene prin metoda calorimetrica Evaluarea calorimetrica Majoritatea reaciilor metabolice care sunt implicate n creterea i multiplicarea celulelor microbiene sunt reacii exergonice, cldura eliberat variind direct proporional cu numrul de celule vii. Aceast cldur poate fi msurat n bioreactoare izolate termic prin mai multe tehnici: calorimetrie dinamic, calorimetrie n flux, calorimetrie continu. Microcalorimetrele permit msurarea schimburilor termice ntre mediul de fermentaie i mediul exterior, cu un prag de detecie de 1-10 W. Acumularea de cldur n timpul cultivrii se calculeaz cu relaia: Qa = Qf + Qag Qo QE n care: Qa cldura acumulat n timpul fermentaiei, [kJxdrrfJ]; Qf- cldura rezultat prin fermentaie; Qag - cldura produs prin agitare; Qo - cldura produs prin aerare; QE pierderile de cldur n mediu. Mrimea Qa poate fi msurat cu ajutorul unui termometru sau termistor, prin nchiderea sistemului de rcire al bioreactorului i msurarea evoluiei temperaturii pe perioade scurte de timp. Valoarea Of se calculeaz n funcie de pierderile de cldur. Prin tehnici de cultivare continu, prin calorimetrie n flux, s-a stabilit c evoluia vitezei de formare a cldurii n sistemul fermentativ este direct proporional cu concentraia de biomas 17. Evaluarea proprietatilor microbiene prin determinarea CO2-ului rezultat si prin masurarea impedantei Determinarea CO2 Sunt cunoscute n prezent mai multe tehnici de evaluare a coninutului de CO2 rezultat ca urmare a activitii metabolice a microorganismelor. Una dintre metode se bazeaz pe msurarea conductivitii ntr-un mediu cu geloz i KOH n care este captat CO2 rezultat prin fermentaie. Prin nlocuirea progresiv a ionilor hidroxil cu ioni carbonat, mai slabi conductori, se reduce conductivitatea mediului. Msurarea impedanei - Impedana electric Z, sau conductana mediului de cultur, se modific prin dezvoltarea celulelor microbiene pe parcursul desfurrii procesului fermentativ ca urmare a transformrii moleculelor electric neutre n molecule ionizante, cu att mai rapid cu ct microorganismele se dezvolt mai repede. Modificarea impedanei variaz in funcie de: concentraia de celule i tipul microorganismului, mediul de cultur, temperatur, modul de msurare, frecvena semnalului aplicat, proprietile suprafeei i geometria electrodului i distana dintre electrozi. Se msoar modificarea impedanei mediului pe parcursul dezvoltrii culturii, Za, comparativ cu un mediu martor de referin, Zref. Variaia impedanei se calculeaz cu formula: Aplicabilitate Metoda este rapid i permite analiza unui numr mare de probe, dar nu permite evaluarea numrului de celule vii, iar n cazul culturilor de drojdii i mucegaiuri nu se produc modificri mari ale conductanei mediului, deoarece prin metabolismul lor se produc puine molecule ionizabile. Aceast metod este utilizat pentru analiza crnii, a laptelui, iar pragul de detecie este de aproximativ 106 -107 celulecm3. 18. Evaluarea proprietatilor microbiene prin dezvoltarea chimica a produsilor de metabolism si prin evaluarea activitatii unor enzime Dozarea chimic - Determinarea cantitativ a produilor de fermentaie care au legtur direct cu creterea: CO2, etanol, acid acetic, ergosterol (n cazul mucegaiurilor) .a., ofer informaii asupra evoluiei culturii i pot fi corelai cu creterea. Prin cromatografie de nalt performan a fost posibil analiza fazei gazoase. Metoda permite cuantificarea foarte fin a cineticii formrii substanelor volatile ntimpul fermentaiei i corelarea acestora cu creterea celulelor. Evaluarea activitii unor enzime - Testele se refer la dozarea de compui din mediul de fermentaie (substrat sau produi de fermentaie) care pot fi determinai prin evaluarea activitii unor enzime. n prezent, firme specializate (ex. compania Boehringer) comercializeaz numeroase kituri de dozare, i anume: teste pentru msurarea n UV a unui cofactor oxidat - (NAD NADH H+): aldehida acetic aldehid dehidrogenaza; acid acetic - citrat sintetaza, malat dehidrogenaza, lactic dehidrogenaza; teste colorimetrice: acid ascorbic - ascorbat oxidaza; acid gluconic - gluconat kinaza; acid glutamic - diaforaza, glutamat dehidrogenaza; Prin cromatografie gaz-lichid se poate determina cantitativ metanolul eliberat din pectin de ctre pectinesterazele fungice i prin aceasta se poate estima indirect cinetica creterii culturii fungice. 19. Studiul microscopic al microorganismelor - Cu ajutorul preparatelor microscopice se pot studia forma i dimensiunile celulelor unor elemente de structur, starea fiziologic i se pot evidenia tinctorial anumite proprieti ale microorganismelor. Examenul microscopic ncepe ntotdeauna prin realizarea unui preparat ntre lam i lamel

(umed), care se analizeaz cu obiective uscate, cu grosisment x 10 i x40. Acest examen permite diferenierea culturilor de drojdii i mucegaiuri de cele de bacterii. In cazul microorganismelor eucariote (drojdii, mucegaiuri) examenul microscopic n stare vie, n preparate umede, permite un studiu eficient al caracterelor morfologice, studiul unor particulariti privind modul de reproducere i dimensionarea n plan orizontal a celulelor. In cazul bacteriilor, utilizarea preparatelor umede pentru studiul morfologic nu este eficient din cauza dimensiunilor lor extrem de reduse. Cu excepia unor studii de evideniere a mobilitii, bacteriile se studiaz numai in preparate uscate i colorate (colorarea simpl, colorare diferenial, colorare de structuri celulare: capsule, cili. incluziuni .a). Dimensionarea n plan orizontal a celulelor microbiene - Dimensionarea celulelor microbiene se execut n scopul identificrii microorganismelor a cror cretere prezint anumite limite condiionate ereditar sau pentru a stabili influena unor factori asupra vitezei de cretere celular. Msurtorile n plan orizontal permit stabilirea, pe cale microscopic, n mod indirect, a dou din dimensiunile celulei (lungime - lime), prin intermediul unei scri arbitrare micrometru ocular, etalonat pentru grosismentul de lucru al microscopului prin intermediul micrometrului obiectiv (scara etalon). Pentru msurare se folosesc de preferin preparate umede n care suspendarea celulelor se face n soluie de 0,1% geloz, pentru a evita deplasarea celulelor. Micrometrul ocular i Micrometrul obiectiv- Micrometrul ocular este un disc de sticl n centrul cruia se afl o scar gradat cu lungimea de 10 mm, divizat n 100 de diviziuni. Se monteaz n interiorul ocularului prin deurubarea lentilei superioare i se sprijin pe diafragma ocularului. n cazul n care liniile scrii nu se vd distinct, se potrivete distana optim prin deplasarea diafragmei din tub i se nurubeaz din nou lentila frontal a ocularului. Micrometrul obiectiv este o lam de sticl dreptunghiular n centrul creia se afl un cerc cu contur uniform n care este gravat scara de 1 mm mprit n 100 de diviziuni egale. O diviziune a micrometrului obiectiv este egal cu 10 um. Mod de dimensionare - Se plaseaz lama micrometrului obiectiv pe msua microscopului i se caut imaginea scrii etalon cu obiectivul cu grosisment x 10 i apoi cu cel x45; prin manevrarea platinei se face suprapunerea celor dou scri. Se noteaz cte diviziuni ale micrometrului obiectiv se suprapun exact peste un numr de diviziuni ale micrometrului ocular. Cunoscnd c o diviziune real a scrii etalon este egal cu 10 m, se calculeaz coeficientul micrometric, care stabilete corespondena dintre cele dou scri: unde: - C este coeficientul micrometric; - N numrul de diviziuni pe micrometrul obiectiv; - n numrul de diviziuni ale micrometrului ocular care se cuprind n N. Dup stabilirea coeficientului micrometric, n locul scrii etalon, pe msua microscopului se aeaz preparatul care conine celulele de dimensionat. Cu ajutorul scrii prin rotirea ocularului sau prin deplasarea platinei, se determin numrul de diviziuni ale celulelor (pentru lungime/lime). Pentru obinerea dimensiunilor reale ale celulelor dimensionate, numrul de diviziuni citite cu ajutorul micrometrului ocular se multiplic cu coeficientul micrometric stabilit anterior. 20. Studiul caracterelor culturale Caractere culturale ale microorganismelor n diverse tipuri de culturi - a forma coloniilor: punctiform (1); circular (2); ondulat (3); lobat (4); erodat (5); filamentoas (6); rizoidal (7); plisat cu striaiuni radiale (8); plisat cu striaiuni concentrice (9); form de fus n masa de geloz (10); - b -profilul coloniilor: plat (1): bombat (2); convex (3); n form de dom (4); umbonat (5): - c -culturi pe geloz nclinat (inoculare linear): biomasa invadeaz ntreaga suprafa (1); cretere filiform (2); cretere ondulat (3); cretere difuz (4); cretere rizoidal sau arborescent (5); - d - culturi prin nepare n medii cu gelatin; filiform (1); perlat (2); ondulat (3); arborescent (4): lichefiere cratiform (5); lichefiere stratiform (6); lichefiere sub form de sac (7): lichefiere total (8); - e culturi pe mediu lichid: sediment (1): tulburare (2); pelicul sub form de inel (3), voal (4).

21. Tipuri de metabolism energetic Viaa celulei microbiene n condiii compatibile oferite de mediul ambiant este determinat de caracterele genetice care i imprim un anumit metabolism, determinat de totalitatea reaciilor biochimice catalizate secvenial de enzimele celulei vii, prin care se asigur transferul de mas i energie ntre celul i mediul ambiant. Importana general a metabolismului energetic n viaa microorganismelor, a surselor de energie, a donatorilor de electroni sau de hidrogen i a acceptorului final de electroni, a determinat utilizarea acestora drept criterii de clasificare i nomenclatur a principalelor tipuri de metabolism. In funcie de natura acceptorului final de electroni, microorganismele pot prezenta trei tipuri de metabolism energetic. Respiraia aerob - este procesul n cursul cruia reaciile chimice productoare de energie necesit prezena oxigenului molecular ca acceptor final de electroni. - Procesul este dependent de oxigenul din aer, avnd ca produse finale CO2 si H2O. - Respiraia aerob este foarte avantajoas din punct de vedere energetic pentru celula microbian, de aceea, atunci cnd urmrim obinerea de celule n cantiti mari (drojdie comprimat) sau obinerea de substane intracelulare, cultivarea se face n condiii de aerare. - Respiraia aerob este dependent de cantitatea de oxigen din aer, iar carbonul din compusul organic se regsete n dioxidul de carbon.- Microorganismele aerobe dispun de o caten respiratorie diversificat, n componena creia intr dehidrogenaze. citocromi, citocrom-oxidaze, oxidaze. Respiraia anaerob - este procesul prin care substratul este transformat pn la C02, iar e- sunt cedai prin procesul de oxidare unor compui anorganici acceptori. - este ntlnit la bacteriile strict anaerobe, cnd acceptorul de electroni sau hidrogen este un compus anorganic. Aceste bacterii obin o cantitate mic de energie i pot crete n absena oxigenului molecular, Ia un potenial de oxidoreducere de -0,2; - 0,3 V. - innd cont c mediile ce vin in contact cu 02 au un potenial redox de + 0,2; + 0,4 atunci cnd pH = 7, pentru a asigura dezvoltarea anaerobilor, n mediu se adaug substane cu caracter reductor ca tioglicolat de Na, cistein-SH, sulfura de Na. Substanele reductoare permit meninerea unui potenial de oxido-reducere sczut. Pentru cultivarea anaerobilor se pot folosi i vase speciale numite anaerostate n care O2 este legat chimic, sau cultura se menine n atmosfer de gaze inerte (CO2, N2). Fermentaia - este un proces n care reaciile chimice productoare de energie necesit prezena unor compui organici ca acccptori finali de electroni. - Metabolismul oxidativ anaerob poate fi ntlnit i la microorganisme facultativ anaerobe. Aceste microorganisme au capacitatea de a crete aerob utiliznd oxigenul din aer (respiraie aerob) sau anaerob, utiliznd compui organici ca acceptori finali ai electronilor. Microorganismele facultativ anaerobe, n condiii aerobe, i adapteaz echipamentul enzimatic pentru procese de oxidare pn la produii finali, utiliznd preferenial oxigenul cnd este disponibil datorit cantitii mai mari.Tipuri de comportamente difereniate ale microorganismelor - aerobe - sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor, a mediilor solide. Oxigenul servete ca acceptor final de electroni transportai prin catena respiratorie; - facultativ anaerobe - nu necesit oxigen pentru cretere, dar cresc mai bine n prezena sa. Se dezvolt bine n medii lichide n care solubilitatea oxigenului din aer este mai redus; aerotolerante anaerobe - nu necesit O2 pentru cretere i cresc la fel de bine n prezena sau absena sa. Microorganismele incluse n aceste tipuri pot produce superoxid dismutaz i catalaz ce catalizeaz reaciile: - microaerofile - se dezvolt la distan mic de suprafaa mediului de cultur cnd concentraia n oxigen este de 2-10%; - strict (obligat) anaerobe - nu tolereaz oxigenul i mor n prezena acestuia, deoarece nu pot descompune apa oxigenat cu efect distructiv asupra celulei. Nu pot obine energie prin respiraie propriu-zis i folosesc fermentaia i respiraia n acest scop (ex. bacterii butirice, metanogene). 22. Studiul tipului de metabolism energetic In eprubete (8x180 mm) se repartizeaz cte 10-15 cm3 mediu de cultur, BCA+glucoz i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, mediul se fluidific prin nclzire pe baie de ap i apoi se tempereaz la 42...45C. Urmeaz inocularea n strii n profunzimea masei de gel, cu ajutorul unei pipete Pasteur. Pipeta se introduce pn la partea inferioar a eprubetei, apoi se ridic ncet pentru inocularea uniform (cu 3-4 picturi suspensie celule) a mediului de cultur. Dup rcire i solidificare mediul se termostateaz corespunztor. n funcie de particularitile de cretere n raport cu necesarul de oxigen, microorganismele sunt ncadrate n 4 categorii principale: strict aerobe (a), strict anaerobe (b), aerotolerante anaerobe (c), microaerofile (d).

23. Evidentierea metabolismului oxidativ si fermentativ prin metoda bazata pe determinarea pH-ului Microorganismele metabolizeaz substanele nutritive n mod difereniat, procurndu-i energia necesar proceselor vitale. Cantitatea i natura produselor rezultate depind de caracterele ereditare ale microorganismelor, de stadiul de cretere i de condiiile de cultivare. Determinarea produselor rezultate prin metabolismul celulei microbiene (acizi, alcooli, enzime .a.) prezint interes practic n scopul stabilirii condiiilor optime de mediu pentru creterea randamentului n produsul cu importan economic, la selectarea unor microorganisme nalt productive.In funcie de particularitile metabolice i de condiiile de cultivare, microorganismele au capacitatea de a metaboliza n mod diferit substratul cu formare de acizi, CO2 i ap (metabolism oxidativ), sau acizi, alcooli i gaze (CO2, H2) (metabolism fermentativ anaerob). Evidenierea tipului de metabolism se va face prin punerea n eviden a produilor finali de metabolism, n special formarea de gaze, care n cazul metabolismului fermentativ se concretizeaz n: acumulare de gaz n tub Durham (mediu lichid), formarea de alveole de gaz (n mediu cu geloz). n cazul respiraiei aerobe, prin dezvoltarea microorganismelor la suprafaa mediului de cultur, CO 2 format este eliberat n mediul nconjurtor. Pentru evidenierea tipului de metabolism se utilizeaz dou metode principale. A. Metoda bazat pe studiul pH-ului - se aplic n general pentru studiul bacteriilor, care prin fermentaie produc acizi i uneori gaze. - pentru cultivare se utilizeaz un mediu semisolid ce conine un indicator de pH. - nainte de utilizare, mediul se fiuidific pe baie de ap, apoi se adaug soluie de glucoza astfel nct concentraia final n mediu s fie de 0,1% i se solidific din nou. - pentru analiz se utilizeaz cte dou eprubete de mediu care se inoculeaz prin nepare cu firul exact n zona central a tubului de gel. - n una din eprubete se acoper suprafaa mediului cu 1 cm3 ulei de parafin steril. - dup termostatare corespunztoare se examineaz eprubetele i se noteaz virarea culorii indicatorului i eventual formarea de gaz. Posibile rezultate - acidifiere la suprafaa mediului din eprubeta fr parafin; - absen modificri n eprubeta cu parafin - metabolism oxidativ; - absen acidifiere sau formare de gaz; uneori crete alcalinitatea n eprubeta cu parafin - metabolism inactiv sau "inert"; acidifiere n ambele eprubete cu sau fr formare de gaz; modificarea poziiei dopului de parafin - metabolism fermentativ. Dup inoculare i termostatare corespunztoare rezultatele se interpreteaz astfel: - absen formare gaz; absen acidifiere sau alcalinizare mediu; uneori acidifiere mediu fr formare de gaz - metabolism oxidativ sau "inert"; - acidifiere cu formare de gaz; formare gaz fr acidifiere; uneori acidifiere fr formare de gaz metabolism fermentativ (bacterii). 24. Studiul capacitatii microorganismelor de a metaboliza glucidele Pentru identificarea microorganismelor, este important s se studieze i capacitatea lor de a se dezvolta pe anumite medii selective de diagnosticare sau prin urmrirea potenialului de metabolizare a unor compui introdui n mediul de cultur al microorganismului studiat. Asimilarea glucidelor simple auxanograma - Pentru identificarea microorganismelor organotrofe se stabilesc glucidele care le favorizeaz creterea, atunci cnd acestea reprezint unica surs de carbon prezent n mediul de cultur. Dintre acestea mai frecvent se utilizeaz: arabinoza, xiloza, glucoza, fructoza, galactoza, zaharoza, maltoza, lactoza. Prin metabolizarea specific a acestor substane se pot forma acizi organici, gaze, aldehide i cetone. Studiul potenialului de hidroliz al amidonului - Unele microorganisme (bacterii i mucegaiuri) sunt capabile s sintetizeze hidrolaze extracelulare de tipul i amilaze, glucoamilaze, care pot hidroliz enzimatic amidonul pn la produse cu greuti moleculare din ce n ce mai mici, i anume erithrodextrine, achrodextrine, maltoz, glucoza, ce pot fi utilizate de microorganisme drept surse de carbon i energie. Pentru punerea n eviden a acestor proprieti se folosete un mediu nutritiv (BCA sau MMA) cu 0,2% amidon solubil. Dup sterilizare, mediul se repartizeaz n plci Petri i dup solidificare, cu firul inoculat n suspensia de celule se inoculeaz "n punct" sau se traseaz o linie de-a lungul diametrului plcii. Dup 7-10 zile se observ vizual hidroliza amidonului dup zona clar aflat n jurul coloniei sau n jurul liniei de inoculare. Zona devine mai evident prin adugarea n plac a unei soluii de Lugol. In acest caz amidonul nehidrolizat va cpta culoare albastr, zona de formare a dextrinelor o culoare roie-brun, iar zona n care amidonul este complet hidrolizat va rmne incolor. Determinarea semicantitativ a activitii amilolitice a diferitelor microorganismese poate realiza prin stabilirea raportului intre diametrul zonei n care s-a produs hidroliza complet a amidonului i diametrul coloniei microorganismului de

studiat, n condiii determinate de timp i temperatur de termostatare. Studiul fermentaiei alcoolice - Pentru studiul fermentaiei aicoolice i al factorilor care condiioneaz viteza de fermentare a glucidelor fermentescibile se folosesc culturi pure de drojdii aparinnd genului Saccharomyces. Pentru obinerea inoculului, celulele de drojdie din eprubeta cu cultur pur, pe must de mal-agar nclinat, se transfer n must de mal lichid cu concentraie 6P (baloane cu 25 cm3 mediu) i se termostateaz 24 h la 25...30C. Inoculul obinut se transfer, n proporie de 2-4 %, cu o pipet steril n 3 vase de fermentare ce conin 150 cm 3 must de mal cu aceeai concentraie sau must de struguri cu 20% zahr, prevzute cu ventile de fermentaie. Dup montarea ventilului de fermentaie, sterilizat separat de vasul ce conine mediul, n ventil se introduce, prin orificiul superior, un volum redus (2-3 cm3) de acid sulfuric concentrat. Acesta va permite eliminarea dioxidului de carbon rezultat in timpul fermentaiei i va reine vaporii de ap i alte substane volatile. Dup cntrirea iniial a fiecrui vas, la o balan cu precizie, acestea se termostateaz la 30C, timp de 3 zile. La intervale de 6, 24, 48, 72 ore se face agitarea mustului pentru eliminarea Co2 format, apoi se cntrete fiecare vas i se calculeaz prin diferen cantitatea medie de CO2 degajat. Studiul fermentaiei lactice - Fermentaia lactic este un proces anaerob prin care substratul hidrocarbonat este metabolizat sub aciunea echipamentului enzimatic al bacteriilor lactice n acid lactic ca produs principal al fermentaiei. In cazul bacteriilor lactice homofermentative, pe lng acid lactic se acumuleaz i produse secundare: acid acetic, alcool etilic, glicerol, CO2. 25. Metabolismul aminoacizilor Pentru studiul metabolismului aminoacizilor se analizeaz mai multe aspecte: Formarea amoniacului. Amoniacul poate s rezulte n urma dezaminrii aminoacizilor prezeni n mediul de cultur al microorganismului de studiat. Acesta este parial folosit drept surs de azot, iar excesul se elimin i poate fi evideniat pe cale chimic. Pentru evidenierea producerii de amoniac, drept medii de cultur se recomand apa peptonat sau un mediu lichid care conine un aminoacid special (de exemplu, bulion-arginin). Mediul se repartizeaz n eprubete, se sterilizeaz i se inoculeaz cu celulele aparinnd microorganismului de studiat. Dup termostatare n condiii oprime, producerea de amoniac este evideniat prin reacia de culoare cu reactivul Nessler (cteva picturi), cnd proba capt culoare galben-oranj. Producerea de H2S Sub aciunea unor microorganisme asupra aminoacizilor ce conin sulf n molecul (metionin, cistin. cistein), prezeni n mediul de cultur, are loc eliberarea de H2S. Aceast proprietate se poate pune n eviden prin cultivarea microorganismelor n mediu de bulion de carne cu pepton repartizat n eprubete i sterilizat. Dup inocularea mediului cu o suspensie de celule, ntre dopul de vat i gtul eprubetei se introduce o band de hrtie steril mbibat n soluie 10% acetat de plumb, astfel nct s nu ating suprafaa mediului. Se recomand ca dopul eprubetei s se acopere cu o folie din plastic pentru a evita evaporarea rapid a gazului ce se formeaz. Durata cultivrii este 7-10 zile. Eliberarea de H 2S se evideniaz prin nnegrirea hrtiei ca rezultat al formrii sulfurii de plumb (PbS). O alt metod de evideniere a H2S eliberat de ctre microorganisme const n cultivarea acestora pe un mediu specific, care conine proteine i sulfat de fier: mediul pepton-fier-agar, mediul Mossel, mediul Lingby cu geloz. Mediul cu agar repartizat n eprubete se sterilizeaz la 0,5 atm i se nclin sau se pstreaz ca atare, sub form de tub de gel. Cu firul ncrcat cu celule se aplic striuri la suprafaa mediului (pentru microorganisme aerobe), sau inocularea se realizeaz n profunzimea tubului de gel drept (pentru microorganisme anaerobe, facultativ anaerobe sau microaerofile). Prin creterea biomasei, o dat cu eliberarea de H2S are loc nnegrirea mediului ca rezultat al formrii sulfurii de fier. Degradarea specific a unor aminoacizi Numeroase specii de microorganisme conin enzime capabile s produc degradarea specific a unor aminoacizi. - prin reacii de decarboxilare a aminoacizilor (decarboxilaze) rezult amine, - prin dezaminare (dezaminaze) se formeaz acizi i amoniac, - caz special este degradarea triptofanului sub aciunea enzimei triptofanaz, cnd rezult indol. Producerea de indol este o caracteristic taxonomic important pentru caracterizarea i identificarea enterobacteriilor i a bacteriilor aparinnd genului Pseudomonas. 26. Studiul metabolismului lipidic Activitatea lipazic (esterazic) a microorganismelor poate fi pus n eviden prin diferite metode, i anume: - inocularea celulelor "n punct" pe suprafaa unui mediu de cultur solidificat (mediul Sierra) sau Tween 80 (polisorbat 80), repartizat n plci Petri - dup termostatare n condiii optime de cretere, tulpinile cu activitate lipazic vor prezenta n jurul coloniilor o zon opac, drept urmare a precipitrii oleatului de calciu; - cultivarea "n punct" pe un mediu solidificat cu adaos de ulei de msline steril - nainte de repartizarea n plci Petri. n mediu se adaug 0,006 % albastru de Victoria. Tulpinile cu activitate lipolitic vor fi puse n eviden prin prezena n jurul coloniilor a unui precipitat de culoare albastru-deschis, dat de srurile acizilor biliari; - cultivarea "n punct" pe mediu solidificat cu adaos de tributirin - prin aceasta, tulpinile lipazopozitive vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar. n acest caz se pot utiliza i variante de mediu de cultur cu

adaos de compui indicatori. De exemplu, dac mediul conine albastru Evans, n jurul coloniilor cu activitate lipazic va aprea o zon clar, comparativ cu restul mediului de culoare albastr. Dac n compoziia mediului de cultur se utilizeaz un indicator de pH (de exemplu, rou de fenol), n jurul coloniilor tulpinilor active va aprea o zon cu coloraie galben ca urmare a acidifierii produse de acidul butiric format; - studiul activitii lecitinazice se face utiliznd un mediu cu glbenu de ou. In geloz nutritiv obinuit se adaug o soluie (5-10%) de glbenu de ou n ser fiziologic steril. Mediul se repartizeaz n plci Petri sterile i dup solidificare celulele microorganismelor de studiat se inoculeaz "n punct" pe suprafaa mediului. Dup termostatare n condiii optime de cretere, tulpinile cu activitate lecitinazic vor prezenta n jurul coloniilor o zon opac. Potenialul de degradare a acizilor grai se poate evidenia prin utilizarea acestora ca unic surs de carbon. 27. Studii imunologice.Principiul metodei imunologice.Reactii imunologice de baza.Tehnici principale de analiza Imunologia const n studiul relaiilor dintre substanele strine unui organism superior (antigeni) i aprtorii specifici ai acelui organism (anticorpi). Antigenii sunt macromolecule cu compoziie chimic diferit care au situsuri active. Microorganismele conin numeroase tipuri de antigeni, de natur bine definit, care caracterizeaz fiecare specie i uneori unele varieti (serotipuri). Principiul metodelor imunologice Atunci cnd un antigen ptrunde n organismul gazd, induce formarea anticorpilor specifici (puterea antigenic). Aceast reacie se produce in vivo dar i in vitro. Manifestrile unei astfel de reacii sunt variabile: - un antigen molecular (element microbian sau toxin) reacioneaz cu un anticorp printr-o reacie de precipitare sau neutralizare; - o bacterie, care conine un ansamblu de antigeni, reacioneaz cu anticorpii printr-o reacie de precipitare. Reacia antigen-anticorp realizat in vitro permite, n cazul unor analize, s se identifice antigenul, deci un microorganism necunoscut, cu ajutorul anticorpului cunoscut sau s se identifice un anticorp necunoscut, n cazul unei mbolnviri, i microorganismul responsabil de aceasta cu ajutorul antigenilor cunoscui. Aceste reacii sunt utilizate i n taxonomia microorganismelor i pentru realizarea unor analize microbiologice. De obicei se pun n eviden antigenii, utiliznd fie anticorpi "naturali" policlonali (obinui de la animale: iepure, cal .a), fie anticorpi monoclonali, cu specificitate nalt, obinui prin inginerie genetic (hibridoame). Reacii imunologice de baz a reacia n tub (ring-test): test simplu n capilar (1); test cu antigen colorat (2); b - reacia pe lam (se observ o aglutinare n pictura din dreapta); c - tipuri de anticorpi utilizai: anticorpi nemarcai (1); anticorpi marcai direct (2); anticorpi marcai indirect (3); d - inhibiie prin hemaglutinare: hematie i antigen (1); competiie fa de anticorpi ntre antigenii purtai de hematii i antigenii de detectat (2). Tehnici principale de analiz - Precipitarea sau aglutinarea n mediu lichid se bazeaz pe reacii care au loc n prezena antigenilor i anticorpilor corespondeni, prin interaciunea dintre situsurile active. Precipitarea are loc n cazul unor antigeni moleculari (de exemplu toxine). Aglutinarea are loc n cazul unei legturi dintre anticorp i un antigen particular (aglutinare simpl sau direct, numit i aglutinare activ sau omogen). Reacia n tub sau test inel (ring - test) utilizeaz un tub capilar care conine un ser (anticorp), la care se adaug antigenul. n zona de contact se formeaz un precipitat floconos (n form de inel). Testul anticorp Brucella utilizeaz antigen colorat (fig. a). Reacia pe lam sau plac. Reaciile de precipitare sau aglutinare se pot realiza pe lam sau pe microplac de titrare (fig b). Citirea se poate face vizual sau automatizat. Microplcile sunt folosite pentru evidenierea i dozarea anticorpilor i toxinelor prin utilizarea diluiiior. Pentru evidenierea celulelor se folosesc lame sau microplci care permit efectuarea de teste multiple cu o serie de anticorpi. Reacia n eprubet. Se amestec antigenii cu anticorpii n eprubete i se observ apariia unei precipitri sau aglutinri. Pentru dozri cantitative de antigeni sau anticorpi se realizeaz diluii i se analizeaz probele turbidimetric sau nefelometric ( = 350-400 nm). Sisteme particulare. Atunci cnd se utilizeaz un suport pe care se fixeaz anticorpul are loc o precipitare sau aglutinare pasiv. Suportului are natur diferit (bile de latex, hematii, particule magnetice). De exemplu, testul de aglutinare "Spectate" (RP Diag, Rhne-Poulenc) permite evidenierea prezenei bacteriilor din genul Salmonella. Anticorpii sunt imobilizai pe microbile de latex care se coloreaz diferit n funcie de tipul de anticorpi. Rezultatele sunt interpretate n funcie de culoarea obinut. Imunofluorescena. Marcajul fluorescent al anticorpului permite vizualizarea antigenului. Metoda direct utilizeaz antigen i anticorp marcat specific. Metoda indirect utilizeaz un anticorp specific i o antiglobulin (fig. c). In cazul utilizrii microscopului cu

epifluorescen, preparatul se coloreaz cu ajutorul unui marker specific fluorescent. Astfel, se pot distinge cu uurin celulele fluorescente de altele. Aceast metod permite evaluarea cantitativ a celulelor aparinnd unei tulpini sau evidenierea contaminanilor. Tehnici de separare a antigenilor i anticorpilor. Pentru separarea antigenilor sau anticorpilor se apeleaz n prezent la tehnici de imuno-afinitate. Exist sisteme comerciale pentru analize de nalt specificitate. De exemplu, sistemul RP Diag (Rhne-Poulenc) permite detectarea i extracia aflatoxinelor i ochratoxinei prin utilizarea anticorpilor monoclonali, reinui pe coloan (Aflascan. Aflaprep, Ochraprep). Metodele de extracie i solvenii utilizai variaz n funcie de produs, i anume: metanol : ap pentru lapte: cloroform - pentru produse solide .a. Detectarea se face n UV, prin fluorescen. 28. Studiul potentialului patogen al microorganismelor Sunt analizate enzimele care produc patogenitate i se evideniaz pericolul toxicogen al microorganismelor. Studiul enzimelor care determin patogenitatea Enzimele care produc patogenitate sunt de mai multe tipuri. Hemolizinele sunt enzime care produc liza hematiilor. Ele sunt puse n eviden prin cultivarea microorganismelor pe medii solidificate cu snge (de miel sau de cal). n mediul cu geloz de fiuidificat se adaug 20-25 picturi de snge, apoi se omogenizeaz, se repartizeaz n plci Petri i, dup solidificarea microorganismului test, se inoculeaz n strii. Dup termostatare corespunztoare se analizeaz aspectul zonei din imediata vecintate a coloniilor, i anume: - zona verzuie, dat de methemoglobin - hemoliz ; - formarea unei aureole clare, ca urmare a eliberrii hemoglobinei -hemoliz ; - fr modificri - absen hemoliz. Coagulazele sunt enzimele care coaguleaz plasma i mpiedic fagocitoza. Dup cultivarea microorganismelor, pe medii specifice (de exemplu, pentru bacterii din genurile Staphylococcus, Streptococcus), timp de 24 h, se recolteaz 0,5 cm3 cultur, care se transfer ntr-o eprubet de hemoliz, dup care se adaug 0,5 cm3 plasm de iepure diluat (1:5). Amestecul se termostateaz la 37C i se examineaz din or n or, timp de 24 h. Coagularea se examineaz comparativ cu o prob martor (0,5 cm3 cultur + 0,5 cm3 ser fiziologic steril). ADNazele (cu referire la enzimele care distrug materialul nuclear al celulelor) se evideniaz prin cultivare pe un mediu specific care conine ADN. Mediul se repartizeaz n plci Petri i se inoculeaz "n punct" cu celulele de studiat. Dup termostatare corespunztoare, hidroliza ADN-ului este evideniat prin vaporizare cu acid clorhidric 1N. Prezena unei zone clare n jurul coloniilor certific un test pozitiv. Acidul poate fi nlocuit cu o soluie de albastru de toluidin 0,1% i n acest caz developarea unei zone de culoare roz n jurul coloniilor certific un test ADN-az pozitiv. Evidenierea producerii de toxine Pentru evidenierea potenialului toxicogen al microorganismelor sunt utilizate mai multe metode. Metode chimice se aplic n special pentru evidenierea toxinelor cu greutate molecular redus, specifice microorganismelor eucariote. Metode generale presupun n prim faz extracia i purificarea toxinelor. Pentru identificarea i dozarea lor se apeleaz la metode cromatografice, chimice sau prin fluorescen. De exemplu, pentru dozarea aflatoxinelor se realizeaz mai nti extracia cu soluie metanolic, urmat de separare princromatografie de afinitate cu anticorpi monoclonali (anti B 1, B2, G1). Dup eluie cu metanol, dozarea aflatoxinelor se realizeaz prin msurarea fluorescenei, dup reacia cu SFB (Solution Fluorometry with Bromine). Metode imunologice se utilizeaz tehnica ELISA sau tehnica de aglutinare n mediu lichid. Tehnicile cele mai actuale de evideniere a patogenitii microorganismelor presupun utilizarea sondelor moleculare sau studiul secvenelor de cromozoni i al plasmidelor implicate n imprimarea acestui caracter.