CITOMETRIA IN FLUX

Citometria reprezinta o in flux abordare

tehnica noua, de mare complexitate, ce permite determinarea simultana a mai multor parametri fizici si chimici caracteristici Flow ~ celule in miscare Cyto ~ celula Metry ~ masura Masurarea proprietatilor celulelor intr-un sistem fluid. unei singure celule aflate in miscare intr-un curent lichid.

Citometria in flux este o tehnica moderna, complexa si performanta de analiza celulara, care permite masuratori rapide, cu rezolutii superioare metodelor clasice, separate pentru fiecare celula sau constituent celular, incluzand acizii nucleici, complexele imune, cromozomii sau organitele celulare, aflate in cadrul unor suspensii. Astfel, pot fi facute analize multiparametrice simultane, ale unui numar mare de particule de la !"" la #""" particule$secunda%, ale caror caracteristici au coeficienti mici de &ariatie.

Citologia vs. Citometria in flux

Citologia

Citometria in flux

'ocalizarea antigenelor celulare este posibila (ubtipurile celulare sunt greu de cuantificat )umarul de masuratori multiparametrice este limitat

'ocalizarea antigenelor celulare nu este posibila. )umarul de celule analizat intr-un timp foarte scurt este foarte mare Analizele multiparametrice sunt posibile.

Ce se intampla in cazul citometriei in flux*

Celulele in suspensie sunt aliniate, una dupa alta, in &ederea prezentarii indi&iduale sistemului de excitare + sursa 'A(,- ilumineaza fiecare celula indi&idual, iar lumina reflectata si fluorescenta emisa sunt colectate de detectori .atele colectate sunt con&ertite intr-un semnal electric, direct proportional cu fluorescenta emisa .atele electronice sunt con&ertite in date digitale si analizate cu a/utorul unor programe specifice

Sistemul fluidic Sistemul optic

Sistemul electronic Interpretarea datelor

Principiul de functionare al unui citometru

Principiul de operare - celulele particulele existente 0n proba% sunt in/ectate 0ntr-un

curent de fluid - curent de transport / curent purttor. (uspensia celular1 trece printr-o zona de detecie considerat1 zona de interac2iune a fiec1rei particule 0n parte, cu o surs1 de excita2ie luminoas1.

(emnalele luminoase sunt detectate simultan de c1tre 4 fotodetectori 3i transformate 0n semnale electrice echi&alente, care sunt, apoi, amplificate 3i con&ertite 0n semnale digitale. (e &or ob2ine simultan, pentru fiecare particul1 0n parte, 4 parametri diferii4 F(C si ((C criterii morfologice%, iar F'5 3i F'6 emisia de fluorescenta%.

FSC Forward (catter% 70mpr13tiere 0nainte8 9 dimensiunea si forma particulelor. SSC (ide (catter% 70mpr13tiere lateral18 9 granularitatea particulelor. FL1/2 - :ntensitatea fluorescentei este proportionala cu cantitatea colorantului fixat, respecti&
cu cantitatea componentei celulare de interes acizi nucleici, antigene de suprafata%.

Forward (catter

Laser Beam

FSC Detector

Original from Purdue University Cytometry Laboratories

(ide (catter
Laser Beam
FSC Detector

Collection Lens SSC Detector

Original from Purdue University Cytometry Laboratories

Fluorescence .etectors
Laser Beam
FSC Detector

Collection Lens
Fluorescence Detector A, B, C, etc
Original from Purdue University Cytometry Laboratories, odified by !ames arvin

:mportanta F(C si a ((C

Corelarea datelor despre dimensiunea si structura interna a celulelor permite diferentierea tipurilor celulare intr-o populatie heterogena de celule

$ranulocytes Lym"#ocytes
SSC

onocytes

RBCs !e"ris !ead Cells

FSC

Aplicatiile citometriei in flux4

;.imensiune, structura interna a celulei< ;Continutul de A.) ciclu celular, ploidie, proliferare%< ;Continutul de A-)< ;Analiza si sortarea cromozomilor< ;,xpresia si localizarea proteinelor< ;Antigene de supratafa, intracelulare si nucleare< ;Apoptoza< ;=iabilitatea celulara<

eterminarea! prin citometrie in flux! a continutului de " # in celulele meristemului radicular! la radicelele de ceapa $Allium cepa L.%! dupa >6 ore de la punerea bulbului de ceapa in contact cu apa. ". ?istograma A.) in cazul proliferarii asincrone< &. ?istograma A.) dupa un tratament prealabil al radicelelor, timp de 5@ ore, cu hidroxiuree si eliberarea, pentru 6 ore, de sub influenta agentului blocant. .upa 6 ore de la incetarea tratamentului4 A>B dintre celulele se afla in faza ( timpurie< 5>B dintre celulele sunt celule dipoide care au iesit din ciclul celular, aflandu-se in faza C"<5AB dintre celulele sunt in faza C6-M.