Citometria de flux Principiu si utilitate Citometria in flux are la baza o abordare tehnica relative noua,ce permite determinarea simultana

a mai multor parametric fizici si chimici corespunzatoare unei singure celule aflate in miscare intr-un curent lichid=> masurarea proprietatilor celulei intr-un system fluid. In primul rand,citometria de flux este o metoda moderna,complexa si performanta de analiza celulara,ce asigura obtinerea unor masuratori rapide cu rezolutii superioare metodelor clasice separate pentru fiecare celula,incluzand acizii nucleici,complexele immune,cromozonii sau organitele celulare: y marime y cantitatea de ADN y granularitatea y antigene de suprafata Astfel,se pot efectua analize multiparametrice simultane,ale unui numar mare de particule 400-3000 de particule/secunda,ale caror caracteristici au coeficienti mici de variatie.

Realizand o comparatie intre citologia clasica si citometria in flux putem observa:

Citologie
Localizarea antigenelor celulare este posibila. Subtipurile celulare sunt greu de cuantificat. Numarul de masuratori multiparametrice este

Citometrie in flux
Localizarea antigenelor celulare NU este posibila Nr.de celule analizat in timp scurt este foarte mare. Analizele multiparametrice sunt posibile.

limitat. Etape: 1.Prepararea suspensiei de celule

2.Marcarea celulelor 3.Achizitia datelor: lichidelor biologice provenite de la pacienti (sange periferic, aspirat medular, lichid de lavaj bronho-alveolar, lichid pleural, aspirat cu ac fin din ganglioni limfatici, fragmente de tesu/tumori) si a suspensiilor celulare/ supernatantelor provenite din culturi in vederea analizei prin flow-citometrie sau a separarii celulare. 4.Stocarea datelor reactivilor, materialelor si consumabilelor necesare analizei prin flow-citometrie sau a separarii celulare, in scopul asigurarii unei accesibilitati directe si eficientizarii acestei etape de lucru. 5.Interpretarea datelor prin microscopie, a suspensiei celulare, pe de o parte pentru aprecierea celularitatii si calitatii sale (viabilitate, gradul de omogenitate), iar pe de alta parte pentru selectarea panelului de reactivi ce urmeaza a fi utilizat, in functie de compozitie.

Principiul de functionare al unui citometru

Celulele (particulele existente in proba) sunt injectate intr-un curent de fluid numit curent de transport/curent purtator.Suspensia celulara trece printr-o zona de detectie considerata zona de interactiune a fiecarei particule in parte,cu o sursa de excitatie luminoasa.Semnalele luminoase sunt detectate simultan de catre 4 fotodetectori si transformate in semnale electrice echivalente care sunt apoi amplificate si convertite in semnale digitale.Se vor obtine simultan pentru fiecare particula in parte 4 parametri diferiti: FSC si SSC criterii morfologice iar FL1 si FL2 emisia de fluorescenta.FSC = imprastiere inainte -> dimensiunea si forma particulei SSC=imprastiere laterala -> granularitatea particulei FL1/FL2=intensitatea fluorescentei este proportionala cu cantitatea colorantului fixat,respectiv cu cantitatea componentei celulare de interes (acizi nucleici,antigene de suprafata).

Functionarea optima a citometrelor presupune mentinerea unei temperaturi ambientale constante, de circa 19-20oC asigurata prin sistemul de climatizare.

Componentele citometrului de flux y y y Sistem fluidic Sistem optic Sistem electronic

Sistemul fluidic are la baza:- celule aflate in suspensie precum LCR,sange,lichid sinovial,ganglioni limfatici,tumori solide. -curent intern intercelular-sir Indian -intersectare cu un fascicul de lumina Celulele in suspensie sunt aliniate,una dupa alta,in vederea prezentarii individuale sistemului de excitare.

2.Sistemul optic de excitatie presupune: y Sursa laser y Fascicul luminos-dispersie si stimularea fluorocromilor y Dispersia luminii: FS-dimensiunea si SS-granularitatea y Emisia luminii fluorescente- cantitatea de fluorocromi y Elemente optice de focalizare (lentile) O sursa LASER ilumineaza fiecare celula individual,iar lumina reflectata si fluorescenta emisa sunt colectate de detectori.Laserele sunt folosite pentru a excita celulele.Markerii fluorescent absorb si reemit lungimi de unda diferite.Diferite tipuri de celule imprastie lumina colorata diferit ajutand la identificarea celulelor.

3.Sistemul electronic: -receptioneaza impulsurile detectorilor -prelucreaza semnalul -prezinta rezultatele: histograme-1 parametru Datele electronice sunt convertite in date digitale si analizate cu ajutorul unor aparate specific.

Sortarea celulara Separarea celulara se realizeaza in functie de marime,granularitate,antigene de suprafata si se realizeaza prin urmatoarele etape: y Identificarea criteriului y Marcarea cu AcM+fluorocromi y Identificarea celulei y Incarcarea cu sarcini +/y Camp magnetic-deflectare spre tuburi colectoare y Centrifugare

Sortarea celulara are aplicabilitate in:analiza subpopulatiilor limfocitare,diagnosticul hemopatiilor maligne,biologie celulara,microbiologie,diagnosticul,evolutia tumorilor maligne solide,microbiologie,studiul ciclului si al functiilor celulare.