Biosenzori electrochimici

1.Introducere Domeniul tehnologiei biosenzorilor are originea in lucrarile realizate de catre Clark si Lyons (1962), Guilbault (1962), Updike si Hicks (1967), Guilbault si Montalvo (1969) si Di Gleria (1986). Conform The National Research Council (parte a U.S. National Academy of Sciences) un biosenzor este definit ca un aparat de detectie care incorporeaza: a)un organism viu sau un produs provenit din sisteme vii (ex. enzime, anticorpi) b)un traductor care furnizeaza o indicatie, semnal ori alta forma de recunoastere a unei substante specifice prezente in mediu(1). Astfel un biosenzor este constituit dintr-un element de recunoastere biologica in contact intim sau integrat cu un traductor. Biosenzorii sunt proiectati pentru a detecta molecule de importanta analitica, agenti patogeni si compusi toxici in vederea furnizarii informatiei dorite rapid, curat si real(1). In ultimii ani s-au realizat imbunatatiri semnificative ale performantelor biosenzorilor in ceea ce priveste selectivitatea si senzitivitatea detectiei. Astfel, publicatiile si patentele aparute sugereaza o ampla sondare alimentara precum si protectia mediului si securitate. In proiectarea unui biosenzor trebuie sa se tina cont de stabilitatea acestuia, senzitivitatea detectiei, de acuratetea informatiei obtinute dar si de raportul cost/eficienta.
1.1.

a domeniului

tehnologiei biosenzorilor in medicina, industria de medicamente, industra

Tehnologia de transducere

Cele mai utilizate metode de transducere in tehnologia biosenzorilor sunt electrochimice, optice si piezoelectrice(2). Senzorii electrochimici masoara modificarile electrochimice ce apar cand substantele interationeaza cu suprafata senzitiva a electrodului de detectie. Modificarile electrice se pot baza pe modificari ale voltajului masurat intre electrozi (metoda potentiometrica), pe modificari ale curentului masurat la un voltaj aplicat dat (metoda amperometrica) sau pe modificari ale abilitatii materialului senzitiv de

a transporta sarcina (metoda conductometrica)(1). Datorita marii lor senzitivitati, simplicitati si costului redus, mai mult de jumatate dintre biosenzorii semnalizati in literatura de specialitate au la baza traductori electrochimici (3) . Senzorii optici presupun masurarea semnalelor optice care pot fi : absorbanta, fluorescenta, chemiluminescenta, sau modificari ale reflectivitatii luminii. Biosenzorii optici sunt preferati atunci cand sunt necesare determinari ale mai multor probe simultan(1). 1.2. Elementele de biorecunoastere

Utilizarea enzimelor ca elemente de recunoastere biologice a fost extrem de extinsa la inceputul dezvoltarii tehnologiei biosenzorilor datorita usurintei izolarii si purificarii enzimelor provenite din diferite surse. In majoritatea aplicatiilor, limita de detectie pentru un biosenzor enzimatic este satisfacatoare dar stabilitatea enzimei cat si abilitatea de a mentine activitatea catalitica a acesteia pentru o lunga perioada de timp sunt inca probleme dificile de solutiona(5). In unele cazuri interferentele electroactive cauzate de compusi endogeni prezenti in probe, devin semnificative in determinari si trebuie inhibate. Enzimele pot fi utilizate in combinatie pentru determinarea unui analit tinta (ex. glutaminaza impreuna cu glutamat-oxidaza pentru determinarea glutaminei)(4). In ultimii 15 ani, au fost realizate studii amble legate de biosenzori care au la baza relatia anticorp/antigen , receptor celular /ligand, DNA/RNA. Pentru detectarea agentilor patogeni atat de tip microbial cat si viral s-au dezvoltat senzori pentru secvente specifice de ADN tinandu-se cont de unicitatea ADN sau ARN si de capsida proteica. De asemenea, s-au dezvoltat imunosenzori pentru boli infectioase care au la baza reactia de mare selectivitate anticorp-antigen(1). Probleme asociate interferentelor altor compusi electroactivi din proba biologica, ancrasarea senzorului prin adsorbtia componentelor endogene prezente in proba, abaterea semnalului precum si contaminarea probelor din cauza lipsei mediului steril, sunt comune tuturor biosenzorii(1). Desi exista un volum mare de lucrari si patente in domeniul tehnologiei biosenzorilor, oportunitatile oferite de acest domeniu dar si provocarile tehnice mari, determina inca o explorare intensa a acestuia(1).

Fig.1. Schema unui biosenzor (6) 2. Biosenzori amperometrici 2.1. Transductia electrochimica Metoda amperometrica are la baza masurarea curentului electric in procese redox . Aceasta consta in mentinerea unui potential constant al electrodului de lucru in raport cu electrodul de referinta, care poate servi si ca electrod auxiliar, si masurarea curentului electric generat. Curentul electric este direct proportional cu concentratia speciei electroactive sau a vitezei de consum a substratului biocatalitic(7). Oxidarea sau reducerea implica un transport de sarcina care duce la aparitia unui curent electric, numit in cazul de fata curent Faradeic. Curentul Faradeic este direct proportional cu concentratia analitului electroactiv. In celula electrochimica, in procesul chimic reversibil, transferul de sarcina are are loc la interfata dintre electrod (sursa de electroni) si mediul ionic conductor ce contine speciile electroactive de analit. Curentul electric masurat (I) este direct proportional cu viteza de reactie la electrod, iar viteza reactiei la electrod este direct proportionala cu fluxul de molecule spre electrod si aria acestuia(7). I=nF(dN/dt) - dN/dt - viteza de reactie la electrod (mol/s) - N - numar de moli - F - constanta Faraday (96,845 C/mol) - n - numar de electroni transferati (7)

Unde : dN/dt = AJ Astfel: I=nFAJ 2.2.

A -aria electrodului (m2), J- fluxul de molecule spre electrod (mol/sm2)

Elementul biocatalitic

Traductorul (detectorul integrat) are rolul de a monitoriza reactia chimica prin intermediul biocatalizatorului imobilizat in biosenzor. Unul sau mai multi analiti reactioneaza in prezenta biocatalizatorului obtinandu-se unul sau mai multi produsi re reactie. Modurile prin care traductorul asociat poate monitoriza nivelul unui analit pot fi: -determinarea consumului unui co-analit -detectia produsului de reactie -detectia centrilor activi din biocatalizator : redox, co-factori, grupuri prostetice ce evolueaza in prezenta substratului S prin folosirea unui mediator imobilizat. Acesta va reactiona rapid cu biocatalizatorul si este usor de detectat (ex. mediatori : derivati ferocenici, saruri organice, chinone, coloranti chinonici, complexe de Ru si Os)(7). Recunoasterea moleculara Senzorul ideal este acela care recunoaste un singur analit tinta existent sau nu intr-o proba. Majoritatea probelor contin specii chimice care pot interfera obtinandu-se astfel un raspuns senzorial fals. Din acest motiv este importanta obtinerea unor biosenzori cu selectivitate specifica pentru un analit cu capacitate de discriminare a interferentelor din proba(7). Transducia semnalului Interactiunea receptor-analit este identificata, preluata si procesata. Astfel traductorul trebuie sa fie intr-un contact intim cu receptorul. Pentru aceasta, este necesara imobilizarea receptorului intr-o matrice. In cazul biosenzorului amperometric, imobilizarea receptorului se face pe un traductor electrochimic care masoara un curent. Tehnicile de imobilizarea utilizate in prezent sunt: inkjet printing, polimerizarile in plasma, transport electroforetic, electropolimerizarile(7)

Clasificarea biosenzorilor in functie de componenta biologica activa Biosenzorul enzimatic

Principiul baza catalitica enzimelor de Reactiile enzimatice din organism functionarea are la constituie o sursa inepuizabila de radicali functia liberi intermediari care reactioneaza intre ei a sau cu alte substante producand compusi pentru stabili. O alta sursa de producere a radicalilor liberi o constituie metabolizarea unor compusi organici. Sub actiunea speciilor reactive de se pot produce modificari struturale ce pot determina destabilizarea morfologiei celulare. Organismele vii sunt protejate de agresiunea speciilor reactive de oxigen prin mai multe modalitati: compartimentarea celulara, protectia conferita de compusii antioxidanti si prin intermediul sistemele enzimatice. Dintre mecanismele enzimatice, primele care intervin in cazul unui stres oxidativ, sunt superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT) si glutation-peroxidaza:

substraturi specifice.

O2- + 2H+ H2O2 CAT

SOD H2O2 + O2 2H2O + O2 glutation-peroxidaza GSSG + 2H2O

H2O2 + 2GSH

Imunosenzorul Principiul
functionare acestui bazeaza anticorp. senzor

de Antigenele al consecutiv

sunt

substante

straine in

care,

introducerii

organism

se declanseaza sinteza anticorpilor cu care se pe combina specific. Epitopii reprezinta domenii suprafata antigenului. sinteza anticoprilor. Specificitatea defineste capacitatea intregului antigen sau doar a epitopilor sai de a se Epitopii stimuleaza

interatiunea antigen- determinante de specificitate localizate pe

combina specific cu anticorpii sau receptorii celulari a caror sinteza a fost indusa(8). Fortele care intervin in realizarea acestei legaturi sunt exclusiv ne-covalente. Fortele fizice care contribuie la realizarea legaturii antigen-anticorp sunt: legaturi electrostatice, puntile de hidrogen, legaturi van der Waals. Legatura antigen-anticorp este reversibila(8).

Fig.2. Legarea specifica a uni antigen de anticorp schools-wikipedia.org/images/787/78797.png de Semnalizarea celulara reprezinta la transmiterea informatiei in interiorul unei unui celule sau intre celule diferite. un Ligandul este o molecula care se leaga de un anumit receptor cu un anumit grad de Liganzii activarea pot fi agonisti sau inactivarea (determina receptorului)

Biosenzorul cu Acest receptori

biosenzor baza ligand receptor

tip are cu reactia

(proteina situata in specificitate. membraba/citoplasm determina modificare conformationala receptorului, urmata de o cascada de modificari ale unor componente celulare. a/nucleu), reactie ce antagonisti

(determina

o receptorului).http://biofizicaumfcd.ro/people/ap/curs_IMC/6_Sisteme_de a _semnalizare_celulara.pdf

Schema 1.Receptorul pentru insulina:

Activare receptor prin legarea agonistului (insulina)

Activarea tirozinkinazei prin fosforilare

Activarea lanturilor de semnalizare intracelulara

Efecte celulare

Biosenzorul de Principiul ADN

functionare are

de Din punct de vedere chimic ADN este un la polimer neramificat format din 4 nucleotide

baza proprietatea de diferite notate A (adenozina),G (guanozina),C complementaritate a (citidina),T (timidina) dispuse intr-un lant in bazelor nucleic. senzitiv un acid in acidului cadrul caruia sunt unite prin legaturi Elementul fosfodiesterice formate intre gruparea fosfat cazul atasata C5 al dezoxiribozei si grupul OH nucleic care

acestui senzor este atasat la C3 al dezoxiribozei. monocatenar moleculelor monocatenare complementare.

permite hibridizarea

Fig.3.Structura primara a ADN Astfel cele doua capate ale unei catene vor fi diferite din punct de vedere chimic.O

molecula de ADN este formata din doua lanturi dispuse antiparalee unite prin legaturi de H care se formeaza intre bazele azotate complementare (A-T, C-G). Astfel intre A si T se realizeaza 2 legaturi de H iar intre C si G trei legaturi de H.

2.3.Imobilizarea materialului biologic Unul dintre cei mai importanti pasi in conceperea unui biosensor este imobilizarea elementului biocatalitic. In acest scop au fost utilizate cu succes sulfactanti insolubili, biopolimeri, polimeri hidrofili numiti hidrogel pentru imobilizarea proteinelor redox. In ultima vreme, nanoparticulele anorganice au devenit extreme de atractive datorita bunei biocompatibilitati ce o prezinta, suprafatei de activitate mare, precum si datorita uniformitatii structurii. Aceste proprietati furnizeaza un excelent micro-mediu pentru imobilizarea proteinelor si faciliteaza transferul de electroni direct de la elementul biocatalitic la electrod(9,10). Carbonatul de calciu, un mineral natural cu o mare biocompatibilitate a fost utilizat intens in industrie, tehnologie , medicina, fabricarea de microcapsule si multe alte zone ale biotehnologiei. Nanoparticule de CaCO3 cu dimensiuni cuprinse in domeniul 70-90 nm prezinta o suprafata specifica mare pentru incarcarea proteinelor. NanoCaCO3 puternic hidrofil poate furniza un micro-mediu mai confortabil pentru legarea elementului biocatalitic. De asemenea, proprietatile specifice ale nanoCaCO3, il indica ca o buna matrice si pentru co-imobilizarea enzimelor cu un co-factor sau cu un mediator de reactie(10-13).

Fig.4. Filmul de nanoCaCO3 inainte (A) si dupa (B) imobilizarea enzimei (12)

Bibliografie 1. 2. 3. 4.
John H.T. Luong, Keith B. Male, Jeremy D. Glennon, Biosensor technology: Technology push versus market pull, Biotechnology Advances 26 (2008) 492500
Hall EAH. Biosensors. Open University Press; 1990. Meadows D. Recent developments with biosensing technology and applications in thepharmaceutical industry. Adv Drug Deliv Rev 1996;21:17989. Male KB, Lachance B, Sunahara G, Luong JHT. Assessment of cytotoxicity of quantumdots and gold nanoparticles using cell-based impedance spectroscopy. Anal Chemin press. doi:10.1021/ac8004555. Buerk DG. Biosensors: Theory & Applications. Technomic Publishing Company; 1993. Stefano Cagnin, Marcelo Caraballo, Carlotta Guiducci, Paolo Martini, Marty Ross,Mark SantaAna, David Danley, Todd West and Gerolamo Lanfranchi, Overview of Electrochemical DNA Biosensors: New Approaches to Detect the Expression of Life, Sensors 2009, 9, 31223148; doi:10.3390/s90403122 Ioan Stamatin. Nanomateriale, aplicaii n biosenzori, surse de energie, medicin, biologie. Elemente de nanotehnologie, 2008 Grigore Mihaescu, Imunologie si Imunochimie, Editura Universitatii Din Bucuresti, 2001 Dan Shan, Shanxia Wang, Huaiguo Xue, Serge Cosnier, Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin entrapped iin composite matrix based on chitosan and CaCO3 nanoparticles, Electrochemistry Communications 9 (2007) 529534

5. 6.

7. 8. 9.

10.

Dan Shana, YannaWang, Huaiguo Xue, Serge Cosnier, Sensitive and selective xanthine amperometric sensors based on calcium carbonate nanoparticles, Sensors and Actuators B 136 (2009) 510515

11.

Dan Shan, Qingbo Li, Huaiguo Xue, Serge Cosnier, A highly reversible and sensitive tyrosinase inhibition-based amperometric biosensor for benzoic acid monitoring, Sensors and Actuators B 134 (2008) 10161021
Dan Shan, Mingjuan Zhu, En Han, Huaiguo Xue,Serge Cosnier, Calcium carbonate nanoparticles: A host matrix for the construction of highly sensitive amperometric phenol biosensor, Biosensors and Bioelectronics 23 (2007) 648654 Dan Shan, Mingjuan Zhu, Huaiguo Xue, Serge Cosnier, Development of amperometric biosensor for glucose based on a novel attractive enzyme immobilization matrix: Calcium carbonate nanoparticles, Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 16121617

12.

13.

3. Metodologie 4. Materiale si metode