Biomateriale

polimerice
(naturale și sintetice)
Curs 4
an III - Bioinginerie
PROTEINE
Proteinele își exercită funcțiile:
 la nivel intracelular,
 membrane celulare,
 în mediul extracelular extins
 mediul extracelular proxim.
Proteinele – clasificare în funcție
de rolul pe care acestea îl au.

Colagenul este proteina dominanta

în țesuturi, face parte din clasa
proteinelor cu rol structural.
 PROTEINELE COLAGENICE
Colagenele – familie de proteine asemanatoare ca
structura

Biomateriale colagenice si provenienta acestora din resurse de tesut conjunctiv

ATELOCOLAGENUL
reprezinta materialul colagenic derivat din colagenul nativ din
care lipsesc zonele telopeptidice. Prin insolubilizare se obtin
formatiuni fibroase apropiate celor din colagen nativ.

COLAGEN SOLUBILIZAT (EUCOLAGEN)

reprezinta biopolimerul solubil in solutii apoase, pe un
domeniu foarte larg de pH, care in stare dizolvata formeaza
asociate liniare sau ramificate, preponderent cu structura
cristalina. Prezinta capacitate de formare a structurilor
fibroase in urma proceselor de insolubilizare.
GELATINA
reprezinta o polipeptida liniara, cu conformatie partial
cristalina, solubila in apa, solutii apoase de electroliti, dar si
in unele lichide organice, care formeza in stare dizolvata
geluri, la temperaturi mai mici de 30oC.

HIDROLIZATUL DE COLAGEN
este un amestec de polipeptide liniare si ramificate, solubil in
apa, solutii apoase de electroliti si lichide organice, care sub
forma de solutii nu formeaza geluri.
 OBTINEREA MATERIALELOR COLAGENICE
Materialele colagenice se obtin prin procedee de extractie din tesuturi
bogate in proteina conjunctiva, in conformitate cu principiul tehnologic
 Operatiile preliminare – scop - indepartarii
componentelor necolagenice din tesutul conjunctiv si pentru
modificarea sistemului de interactiuni inter- si intramoleculare
dintre catenele macromoleculare colagenice.
Aceste operatii se bazeaza pe procese mecanice (seruire,
strecuire, etc) sau procese fizico-chimice si chimice
(cenusarire, decalcificare etc.).

Operatiile specifice transforma tesutul conjunctiv, eliberat

de componentele de impurificare, in material colagenic. In
functie de procesele care intervin in cadrul acestor operatii se
pot obtine diferite tipuri de materiale colagenice.
• prin defibrare (proces mecanic de strivire si forfecare) rezulta
fibra de colagen;
• extractia cu ajutorul unor solventi ( NaCl, Tris, EDTA, fosfati,
acid acetic) conduce la colagen nativ sau colagen solubilizat;
• hidroliza chimica sau enzimatica se aplica in scopul obtinerii
materialelor colagenice cu grad avansat de degradare a structurii
(gelatina, hidrolizate de colagen).

Purificarea se realizeaza in vederea separarii materialelor

colagenice de produsele secundare rezultate in urma aplicarii
operatiilor specifice.
Conservarea are drept scop pastrarea caracteristicilor
materialului colagenic, produse foarte sensibile la atacul
microorganismelor.
 Tesut
conjunctiv
1
solutii apoase

2
solventi organici
Purificare
A alcalii,acizi

Necolagene
B
enzime
Tratament

apa (+acizi sau alcalii)

Spalare
+
Neutralizare

solutii apoase
(acid acetic,fosfati)

Solubilizare

Filtrare

NaCl

Precipitare Liofilizare

FIBRA DE COLAGEN BURETE DE COLAGEN

SOLUTIE DE COLAGEN
DENATURAT

Obtinerea colagenului solubilizat

Obtinerea hidrolizatului de colagen
 Gelatina
- obținută prin hidroliza parțială a colagenului,
- are o masă moleculară mai redusă și o distribuție mai largă a masei
moleculare.
- Gelatina formează soluții coloidale cu apa și, prin urmare, este
considerată un hidrocoloid. Spre deosebire de ceilalți hidrocoloizi, gelatina
prezintă o multifuncționalitate crescută.
- Comportarea sa fizico-chimică este determinată de secvența de
aminoacizi din molecule, de structura spațială, distribuția masei moleculare,
precum și de condițiile de mediu (pH, tărie ionică, temperatură).
Conformația de triplu helix a colagenului nu mai este întâlnită în cazul
gelatinei, forma colagenică ce are o configurație aleatorie a lanțurilor
polipeptidice

Structura tridimensională a gelatinei

 Hidroliza chimică reprezintă ruperea legăturilor din cadrul lanțurilor α-
polipeptidice prin tratarea cu acizi slabi sau baze. Aceasta poate fi înlocuită
de denaturarea biochimică realizată prin degradare enzimatică cu proteaze
specifice, capabile să atace structura colagenului nativ.

Metoda de obținere a gelatinei prin metoda hidrolizei bazice și acide

Procedeul de obtinere al gelatinei influențează distribuția
masei moleculare, diferită în cazul gelatinei obtinute cu
baze (tip B) față de gelatina condiționată cu acizi (tip A).
• Gelatina supusă unei temperaturi sub temperatura de gelifiere își
poate reface parțial conformația de triplu helix. Prin urmare, gelatina
are avantajul de a fi o proteină ușor de manevrat (solubilitate pe
domeniu larg de pH), dar prezintă și inconvenientul unei biodegradări
rapide, neîndeplinind în stare pură cerințele unui biomaterial eficient.

Masa moleculară a gelatinei este cuprinsă în domeniul

10.000 - 400.000 g/mol, iar polidispersitatea acesteia
depășește întotdeauna valoarea 2.
• Gradul de hidroliză al gelatinei depinde de pH, temperatură și de
timpul de expunere la o temperatură ridicată. Capacitatea de gelifiere a
gelatinei este influențată de masa moleculară medie, fiind mai mare
pentru gelatina cu masa moleculară ridicată.
 Proprietatile materialelor colagenice
Proprietati electrice

Marimea cea mai importanta care descrie comportamentul

in solutie al colagenelor o constituie punctul de neutralizare,
care admite 3 valori distincte functie de conditiile de
interactiune:
•punct de sarcina zero, reprezinta punctul de neutralitate al
macroionilor puri independenti;
•punct izoionic, reprezinta punctul de neutralitate al
macroionilor incarcati cu ionii unui electrolit oarecare dat
(macroioni + contraion);
•punctul izoelectric, corespunzator punctului de neutralitate
obtinut la neutralizarea cu un acid sau o baza oarecare.
Experimental, numai punctul izoelectric poate fi determinat
direct.
Tabel - pH-ul izoelectric pentru materiale colagenice
Material colagenic pH iz
Fibra de colagen 5.0 – 5.5
Colagen nativ acid 7.5 – 8.0
Colagen nativ neutru 7.0 – 7.5

Colagen solubilizat 4.5 – 7.0

Gelatina 3 - 10
Hidrolizat de colagen 3.0 – 12.0
Valoarea concentratiei ionilor de hidrogen depinde de
compozitia in aminoacizi a materialului colagenic si
concentratia in mediul apos, conform reactiilor:
MC MC
COOH
COOH COO

COO COO H O
+ H O +
NH + NH
+

zwiterion acid polianionit

MC MC

COO COO
+ H O
NH + +
NH

MC
MC
NH
NH
COO COO + HO
+ H O
+ +
NH NH

zwiterion bazic policationit

Disocierea in apa se cuantifica prin constanta de disociere,
care, de exemplu in cazul unui colagen acid, este exprimata
prin relatia:

KA 
MC  COO H 
 

MC  COOH 
Logaritmând ecuatia si schimbând semnul se ob]ine:

unde  este gradul de disociere al formei ionizate MC-COO-.

 Variația caracterului ionic și a solubilității colagenului în funcție de pH, prin
adaos de acizi sau baze față de punctul de neutralitate.
pHi=4,85 este pH-ul izoelectric al proteinei obținute prin extracție în medii acide
(ex. soluție apoasă de CH3COOH)
pH i = 4,85

pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
+ _
H OOC NH + _
3 H OOC NH OOC NH
3 2 OOC NH
2
C C C C
_ _
+ +
OOC NH OOC NH
3 3

pK <pK  Lys Arg

Glu Asp pK NH < pK NH < pK NH
2 2 2

+ HX + BOH
C
_
+
OOC NH
3
 La valori particulare ale pH-ului mediului apos, sarcinile
pozitive și cele negative de pe catenele polipeptidice se
compenseaza reciproc.

Constantele de aciditate
(pKa-ul grupărilor carboxilice)
și de bazicitate (pKa-ul
grupărilor aminice) ale
colagenelor pot fi
determinate prin trasarea
curbelor de titrare
Valorile medii ale
constantelor de disociere și
reprezentarea ionizării
grupărilor carboxilice și aminice
în funcție de valoarea pH-ului
mediului apos.
 În prezenţa unor soluţii apoase acide sau bazice, colagenul
suferă un fenomen de umflare datorită grupărilor –NH2 şi –
COOH din catena laterală sau grupărilor –CO-NH- din
catena principală a moleculei.

UMFLAREA OSMOTICA
S-a observat existenţa unei cantităţi mari de apă in structura colagenului
faţă de cât pot lega grupările zwitterionice. Macromolecula colagenică se
comportă ca o membrană Donnan, permiţând trecerea fracţiilor mic
moleculare.
Gradul de umflare al materialelor colagenice este influenţat şi de
concentraţia acidului/bazei. Astfel, cu creşterea concentraţiei acidului/bazei în
soluţie, creşte şi gradul de umflare până la atingerea unui echilibru între ionii mic
moleculari din soluţia acidă/bazică şi cei difuzaţi în materialul colagenic. Acest
fenomen poartă numele de umflare osmotică și este caracterizat de
interacţiunea apei cu macroionii polimerici, când pH-ul soluţiei variază
puternic spre domeniul acid sau bazic.
 Proprietati termice

Comportarea in câmp termic este analizata din punct de

vedere marimi distincte:

a) temperatura tranzitiei de faza ce exprima intervalul de

temperatura care determina trecerea de la un sistem de
organizare supramoleculara (indusa de cresterea continutului
energetic si a mobilitatii atomilor si segmentelor de catena).
-temperatura de topire - materiale metalice, polimerice

b) temperatura de denaturare exprima o tranzitie de faza a

materialului(in special proteine) aflate in stare dizolvata.
 Denaturarea proteinelor

Temperatura de vârf a gelatinei în procesul de denaturare este apropiată de

cea a colagenului (59 – 62,5 C), dar acesta din urmă prezintă o entalpie de
denaturare (asociată cu tranziția de fază) mult mai largă.
 Cele mai importante proprietăți funcționale ale gelatinei
sunt:
• capacitatea de gelifiere; parametrii urmăriți sunt timpul
de gelifiere, rezistența și vâscozitatea gelului, temperatura de
topire, etc.
• proprietăți de suprafață; se urmărește formarea și
stabilizarea emulsiilor și spumelor, formarea filmelor,
adeziunea și coeziunea.

Cea mai importantă proprietate tehnologică a gelatinei

este reversibilitatea gelifierii în funcție de temperatură.
Pentru că gelatina este un amestec de lanțuri polimerice de
lungimi diferite, aceasta nu formează soluții reale, ci soluții
coloidale, care la temperatură scăzută se transformă în
geluri, iar la încălzire revin în stadiul de soluție.
 Proprietatile de interactiune
a) Solubilitatea, proprietatea se exprima cantitativ prin
parametrul de solubilitate dat de relatia:
=(E/V)1/2, (jm-3)1/2
unde: E este energia de vaporizare a polimerului, V - volumul
amestecului.

b) Sorbtia – reprezinta fenomenul de acumulare in masa a unui

material solid a moleculelor unui gaz sau lichid, si este evaluata din
legea a doua a transferului de masa ( a doua lege a lui Fick) data de
relatia:

c/t=D[2c/x2+2c/y2+2c/z2]

unde D este coeficientul de difuzie a speciei micromoleculare in

solid.
 Proprietati chimice
Proprietatile chimice reprezinta ansamblul marimilor care
apreciaza capacitatea unui compus de a participa la reactii
chimice cu formare de legaturi ionice si covalente. Principalele
marimi incluse in notiunea de proprietati chimice sunt:
functionalitatea, reactivitatea si rezistenta chimica.

Functionalitatea
Termenul de functionalitate se refera la cantitatea de
centre de reactie dintr-o unitate de masa de material. Materialul
poate participa la urmatoarele tipuri de legaturi:
-legaturi covalente - de aici notiunea de functionalitate covalenta;
-legaturi necovalente - functionalitate necovalenta-prin legaturi
ionice, legaturi de hidrogen,legaturi van der Waals.
Relatia structura - tip de legatura pentru diferite grupari
functionale
Functionalitatea covalenta este legata de totalitatea gruparilor
chimice aflate in stare neionizata.
Functionalitatea gruparilor neionizate rezulta din relatiile:

fNH2 = fCOO- - (fCOOH,t - fNH2,t)

fCOOH = fNH3+ + (fCOOH,t - fNH2,t)

fCOO- reprezinta capacitatea de combinare cu bazele, evaluata din

curba de titrare;
fNH3+ reprezinta capacitatea de combinare cu acizii, evaluata din
curba de titrare.
 Reactivitatea
Fata de aceasta situatie, reactivitatea este interpretata prin
intermediul a doua marimi:
-constanta de viteza a procesului chimic, definita prin relatia:
-dc/dt =k(co-c)(bo-b)
unde:co,bo sunt concentratiile initiale ale gruparilor functionale ale
partenerilor de reactie;
c,b sunt concentratiile momentane ale gruparilor functionale.
-energia de activare a transformarii chimice, evaluata din ecuatia
Arrhenius:

k=Ae (-Ea/RT)
unde: A este un termen pre-exponential;
Ea-energia de activare;
T-temperatura,K;
R-constanta universala a gazelor.
 Rezistenta chimica
Termenul de rezistenta chimica este adesea inlocuit in cazul
biomaterialelor cu termenul de rezistenta la hidroliza si se
exprima prin constanta de viteza a procesului :

-ln[(p-1)/p]=-ln[(po-1)/po]+kt
unde:po-este numarul de unitati elementare in conditii initiale; p-
numarul de unitati elementare la momentul t.

Pansament HemCon
 Degradarea colagenului
Colagenul este degradat în mod natural de metaloproteinaze
în mod specific de colagenaze şi serin-proteaze, permiţând ca
degradarea lui să fie sub controlul local al celulelor.

Colagenul nativ este rezistent la acţiunea de degradare a

proteazelor la pH neutru, dar în stare denaturată (ca gelatină)
devine susceptibil şi la acţiunea proteazelor nespecifice
(tripsină, pepsină etc).
 Procesul de degradare are loc în câteva etape: umflarea
materialului ca urmare a interacţiunii cu apa, pătrunderea
enzimei în structura colagenului, urmată de acţiunea
catalitică a enzimei asupra lanţului polipeptidic.
Colagenaza are capacitate catalitică asupra regiunii
triplului helix în stare nedenaturată, la temperatură şi
pH fiziologic. Ruperea lanţului peptidic are loc între
aminoacidul Y şi glicina din secvenţa
-Pro-Y-Gly-Pro-
În funcţie de tipul de colagen, enzima poate rupe lanţul peptidic în 150-200
secvenţe, care sunt instabile la temperatură fiziologică și sunt ulterior
denaturate în polipeptide cu conformație spiralată, dezordonată. Aceste
polipeptide sunt mai apoi degradate de proteaze în aminoacizi și secvențe
peptidice scurte, metabolizate de organism pe căi normale.
 Factorii care influenţează degradarea
colagenelor

porozitatea materialului colagenic. Membranele de colagen

cu structura tridimensională şi cu grad de porozitate ridicat
prezintă un raport de degradare mai mare datorită suprafeţei
de contact asigurat de reţeaua poroasă între colagen şi
enzimă.
tipurile de colagen cu structură mai ramificată sunt mai
uşor degradabili.
sterilizarea suporturilor pe bază de colagen produce
modificări în structura polimerului, care-l fac mai susceptibil la
degradare enzimatică in vivo.
masa moleculară a secvenţei colagenice influenţează
degradabilitatea.
Din punct de vedere morfologic, degradarea colagenului apare ca o
umflare datorată despiralãrii lanţurilor polipeptidice, distrugerii legăturilor
transversale şi gelatinizării la temperatura corpului.
Datorită legăturilor transversale în structură, colagenele de
tip I şi III sunt mai rezistenţi la acţiunea degradatoare a
enzimelor. Cauza: interacţiunea fibrelor de colagen cu alte
glicoproteine.
Colagenul tip V aflat în piele şi cornee este sensibil la
acţiunea proteazelor celulare şi bacteriene (produse de
Stahylococcus Aureus) care îl scindează în două fragmente
mari de 90 kDa şi 60 kDa.
Colagenul de tip IV, component al membranelor bazale, cu
rol în intra/extravazarea celulelor hematopoetice tumorale,
remodelarea capilarelor, angiogeneza, epitelizarea ţesuturilor
lezate. Acest tip de colagen s-a dovedit a fi susceptibil la
atacul unor proteinaze in vitro inclusiv plasmina şi pepsina.
La nivelul organismului uman, echilibrul colagenolizei
poate fi reglat prin încetinirea procesului de
biodegradare sau intensificarea sintezei colagenului.
 Comportarea materialelor colagenice faţă de medii
biologice

Medii biologice - sisteme apoase constituite în principal

din celule şi nutrienţi. Noţiunea este însă folosită şi pentru
sânge, respectiv ţesuturi vii (răni, plăgi sau diverse stadii de
intervenţii chirurgicale pe diverse ţesuturi şi organe).
Răspunsul mediilor biologice la contactul acestora cu
materialele colagenice se concretizează prin diverse
fenomene specifice: hemostază, răspuns imunologic şi
proliferare celulară.

Manifestarea fenomenelor şi intensitatea lor în prezenţa

materialelor colagenice se denumesc generic prin proprietăţi
biologice ale materialelor colagenice.
 Interacţiunea cu celulele

Toate tipurile de celule animale specifice ţesuturilor conjunctive

manifestă o puternică capacitate de aderare la reţeaua fibroasă colagenică
nativă. Materialele colagenice nu sunt însă identice cu reţeaua
biopolimerică din ţesuturile conjunctive vii, motiv pentru care adeziunea
celulară, proliferarea acestora precum şi fiziologia celulelor vor fi deosebite
de situaţia in vivo.

Capacitatea de a genera un nou ţesut s-a dovedit a fi favorizată

în mod deosebit de către atelocolagen şi colagenul solubilizat.
Calitatea reconstrucţiei depinde de puritatea materialului colagenic,
integritatea compoziţiei în aminoacizi şi valoarea indicatorilor folosiţi pentru
definirea structurilor terţiară şi cuaternară.
 Proprietăţile imunologice
Materialele colagenice reprezintă pentru un organism viu un
corp străin, fapt ce va determina din partea acestuia un răspuns
de apărare (răspuns imun). În seria materialelor colagenice,
capacitatea antigenică începe să se manifeste de la
atelocolagen şi se intensifică spre hidrolizatele de colagen.

Colagenul solubil este un imunogen mai slab decât

atelocolagenul, dar mai bun decât fibra de colagen.
Factorii principali care sunt favorabili proprietăţilor
imunologice:
 structura de acelaşi tip indusă de diferenţele de apartenenţă
la specie
 condiţiile folosite pentru reconstituirea structurii cuaternare
 Proprietăţile mecanice

Dependente de tipul de colagen, de modul de extracţie şi prelucrare

ulterioară. Stabilitatea integrităţii moleculei de colagen este dată de
legăturile de hidrogen dintre cele trei lanţuri α-polipeptidice şi moleculele de
apă din structura acesteia. Legătura de hidrogen este formată între
gruparea ˗NH2 terminală a glicinei dintr-un lanţ peptidic şi gruparea C=O a
lanţului adiacent.

După prelucrare, proprietăţile mecanice ale colagenului sunt puternic

influenţate de gradul de hidratare şi reticulare la care este supus. Prin
utilizarea unor agenţi de reticulare în procesele de creare a legăturilor
covalente, s-a observat o creştere a rezistenţei mecanice şi o scădere a
elasticității.

Reticularea lanţurilor peptidice îmbunătăţeşte rezistenţa fibrelor

colagenice. Totuşi, un grad mare de reticulare duce la efecte negative,
pentru că materialul nu are capacitatea de a disipa energia produsă în
timpul deformării, determinând scindarea moleculelor de colagen.
 Utilizarea materialelor colagenice

•necesitatea biodegradarii totale a suportului;

•formarea unei noi matrici extracelulare, care inlocuieste suportul;
•stabilizarea matricii nou formate - dobândirea de catre aceasta a
caracteristicilor fizico-chimice, mecanice si biologice adecvate functiei sale.

Etapele de realizare ale pielii artificiale

 Gelatina este cel mai adesea utilizata sub forma de hidrogeluri reticulate cu
compusi micromoleculari(în special cu aldehidă glutarică) sau sub forma unor
complecsi cu polizaharide.

Morfologii ale hidrogelurilor

obtinute prin congelare-
Obtinerea hidrogelurilor de gelatina prin
procedeul congelare-uscare uscare la diferite temperaturi
 MATERIALE COLAGENICE CA SUBSTITUIENŢI DE
PLASMĂ
Dintre materialele colagenice doar gelatina este utilizată la
realizarea înlocuitorilor de plasmă, ca urmare a caracteristicilor
sale reologice speciale în soluţie. Sunt folosite trei grupe de
preparate din gelatină, şi anume:
- Haemaccel- Hoechst (gelatină cu legături de uree);
- PlasmaGel  – SRK (gelatină modificată),
- Gelifundol – Biotest (oxipoligelatină).
Aceste produse se caracterizează prin lipsa de
antigenicitate, toleranţă foarte bună şi eliminarea relativ rapidă
din organism.