UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE “GRIGORE T.

POPA” DIN IAȘI

FACULTATEA DE BIOINGINERIE MEDICALA

DISCIPLINA BIOMATERIALE

DETERMINAREA PH-ULUI IZOELECTRIC AL COLAGENULUI

1. Consideratii teoretice

Colagenele constituie componenta majora a matricii extracelulare si reprezinta o

treime din proteinele organismului uman. Colagenul este o proteina fibroasa ce prezinta in
organism o serie de functii precum:

-asigurarea unui suport structural

-protectie pentru organele interne, carora le confera flexibilitate si elasticitate

-legarea, depozitarea si eliberarea factorilor de crestere si a citochinelor, avand un rol

important in dezvoltarea si regenerarea tesuturilor si vindecarea plagilor.

Datorita proprietatilor sale fizico-chimice si biologice (biocompatibilitate excelenta

si biodegradabilitate), colagenul reprezinta, unul dintre cele mai utilizate biomateriale in
aplicatii precum (Figura 1):

 matrici pentru regenerare tisulara,

 suporturi pentru eliberarea controlata a principiilor active
 implanturi

Figura 1. Aplicații medicale ale colagenului : A) pansamente pentru răni superficiale;

B) substituent osos; C) hidrogel pentru răni profunde

Ca oricare alte proteine, colagenele sunt specii macromoleculare amfotere,

caracterizate prin intervale izoelectrice si izoionice. Punctul izoionic al colagenelor este
rareori utilizat ca marime de referinta, deoarece in sistem pot exista si alti contraioni, inafara
de protoni si ioni hidroxil. Cel mai frecvent este utilizat punctul izoelectric.

1
 La valori particulare ale pH-ului mediului apos, sarcinile pozitive si cele negative de
pe catenele polipeptidice ale colagenului devin numeric egale.

Astfel, pH-ul izoelectric (pHi), corespunde acelei valori de pH, la care are loc
compensarea interna a sarcinilor pozitive si negative. La aceasta valoare de pH molecula
devine un “zwitterion” ideal, nefiind influentat de ansamblul ionic din solutia apoasa.

In cazul colagenelor, se utilizeaza expresia ”domeniu izoelectric”, deoarece in

sistemele apoase reale coexista specii colagenice diferite, polipeptide si fractii ale acestora
desprinse din macromoleculele colagenice, fiecare manifestand propriul sau punct izoelectric.

Valoarea pHi-ului colagenului se poate modifica daca se schimba raportul cantitativ

dintre gruparile acide si bazice ale acestuia, grupari care sunt capabile de a se ioniza. In
solutie, aceste grupari vor ioniza in functie de valoarea pH-ului mediului si in functie de
pozitia acestuia fata de pH-ul izoelectric.

Atunci cand pH<pHi, colagenul se comporta ca o baza, iar cand pH>pHi, colagenul se
comporta ca un acid (Figura 2).

Principalele metode de determinare a pH-ului izoelectric sunt:

-turbidimetria/spectroscopia, valoarea pH-ului la care turbiditatea/absorbanța este maximă;

- electroforeza, pH-ul la care viteza de migrare a macroionilor este nulă;

- vâscozimetrie, valoarea pH-ului la care vâscozitatea are valoare minimă;

-titrarea potentiometrica

Scopul lucrarii il constituie insusirea metodelor de determinare a pH-ului izoelectric

al proteinelor, una dintre cele mai importante caracteristici fizico-chimice ale acestei categorii
de biopolimeri.

Principiul lucrarii consta in determinarea absorbantei unor solutii de colagen cu pH

prestabilit.

2
 pH i = 4,85

pH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
H OOC NH +
3 H OOC NH +
_
OOC NH 2 _
3 OOC NH 2

C C C C
_ _
OOC NH + OOC NH +
3 3

pK Glu<pK Asp pK NH2 < pK NH2 Lys < pK NH2 Arg

+ HX + BOH
C
_ +
OOC NH 3

Figura 2. Variația caracterului ionic și a solubilității colagenului în funcție de pH, prin adaos
de acizi sau baze față de punctul de neutralitate. pHi=4,85 este pH-ul izoelectric al proteinei
obținute prin extracție în medii acide (ex. soluție apoasă de CH 3COOH)

Materiale si aparatura

Materiale Aparatura

Colagen Spectrofotometru

Acid clorhidric conc.(HCl 37%) pH-metru

Hidroxid de sodiu (NaOH) Pahare Berzelius de 100 mL, 150 mL, 250mL

Apa distilata Biureta de 25ml, baloane cotate de 100 mL

Piseta, pipete

Mod de lucru

Se prepara 10 solutii de colagen cu pH-urile 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 prin

corectarea pH-ului solutiei de colagen (1%) cu volume adecvate de solutie 0,5N HCl sau
solutie 0,5N NaOH in functie de domeniul de pH dorit.

3
 In acest scop intr-un pahar Berzelius de 150 mL se introduc 25 mL solutie de colagen
1%. Sub agitare se adauga, cu biureta solutie 0,5N HCl sau solutie 0,5N NaOH, in portiuni
mici de 0,5-1mL. Dupa fiecare volum de acid/baza adaugat se masoara pH-ul solutiei cu
ajutorul unui pH-metru calibrat in prealabil. Adaugarea solutiei de HCl sau NaOH continua
pana la atingerea valorii de pH propuse.

In zona pH-ului izoelectric solutiile vor prezenta o opalescenta neta comparativ cu

solutiile cu valori extreme ale pH-ului.

La final, setul de 10 solutii se supune masuratorilor de absorbanta la 540 nm. Solutia

martor este apa distilata. Dupa etalonarea aparatului se introduce in cuva de masurare solutia
de pH cunoscut. Se determina absorbanta solutiei. La sfarsit se scurge solutia de colagen
analizata, se clateste cu apa distilata si cu urmatoarea solutie de analizat.

Date experimentale

Datele experimentale se inscriu in tabelul 1. Valoarea pH-ului izoelectric se determina

prin prelucrarea grafica a datelor experimentale si corespunde punctului de extremitate a
curbei de variatie a absorbantei in functie de pH.

Tabel 1

Nr. pH-ul solutiei Absorbanta

probei
1
2
3

Bibliografie

1. Zhang Z, Li G, Shi B. Physicochemical properties of collagen, gelatin and colllagen

hydrolysate derived from bovine limed split waste. Journal of Society of Leather Technologist
and Chemist 2005, vol 90, pg 23.

2. Mitrica-Kondi N., Laboratorul clinic-Biochimie, Ed.Medicala, Bucuresti, p. 153, 1981.

3. Atkins P.W., Tratat de Chimie Fizica, Ed.Terhnica, Bucuresti, p.112, 1996.

4. Glatzer A.N., Delange R.J., Sigman B.S., Chemical Modifications of Proteins, Elsevier
Biomedical Press, Amsterdam, p.24, 1998.

5. Gómez-Guillén, M.C., Giménez, B., López-Caballero, M.E., Montero, M.P. Functional

and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review. Food
Hydrocolloids 25, 1813-1827, 2011.