1.

Introducere
1.1. Mioglobina
Mioglobina este localizat in celulele musculare i are ca funcie preluarea oxigenului din
snge i stocarea acestuia pan la momentul la care este consumat n aceste celule n vederea
producerii de energie.
In mioglobin, hemul este nconjurat de un lan polipeptidic, care se mpacheteaz n
spaiu pentru nchide n interiorul su fierul, limitnd accesul potenialilor liganzi dinspre
exterior. Mai mult, sistemul imidazolic aparinnd catenei laterale a uneia dintre histidinele din
lanul polipeptidic se coordineaz la fier, care ajunge astfel s fie pentacoordinat, cu o singur
poziie de coordinare liber; aceast poziie liber este meninut special pentru legarea
oxigenului molecular.
Mioglobina este o hemoproteina, structural i funcional foarte similar cu hemoglobina, o
protein care const dintr-un lan polipeptidic relativ mic, de 153 reziduuri aminoacizi care
conine un hem cu un atom de fier.
Hemul este pigmentul propriu-zis a hemoglobinei i gruparea prostetic a acesteia, n
timp ce globina, alctuit n special din aminoacizii lizin i histidin, constituie partea proteic a
macromoleculei. Hemul respirator se formeaz doar n jurul fierului bivalent (ion feros - Fe
2+
),
ionul feric (Fe
3+
) fiind incapabil de a fixa oxigenul gazos.
Mioglobina i hemoglobina au trsturi similare, un examplu: ambele existe n formele:
deoxi-, n care fierul este complet redus la forma Fe
+2
, oxi-, format prin reacia oxigenului
(HbO
2
, MbO
2
) i met- n care fierul este oxidat la Fe
+3
i nu reacioneaz cu oxigenul. Cnd
oxigenul reacioneaz cu forma redusa (deoxi-) este favorizat i oxidarea Fe
+2
la Fe
+3
(forma
met), care se suprapune peste adiia reversibil a oxigenului la forma deoxi.

1.2. Spectrometria UV-VIS
Metoda se bazeaz pe interaciunea radiaiilor UV-Vis de regul din domeniul spectral
120 900 nm cu proba. Domeniul spectral 120 400 nm este domeniul ultraviolet (sub 190 nm
domeniul UV de vid), iar domeniul 400 800 nm domeniul vizibil.
Se bazeaza pe trimiterea unui fascicul luminos prin proba de interes, si pe determinarea in
ce msur proba absoarbe aceast lumin, responsabili de aceasta absorbie fiind electronii din
straturile de valen ale moleculelor din prob, care, absorbind lumina, sunt promovai pe orbitali
de energie superioar, anterior liberi.
Interaciunea poate avea loc cu atomii, ionii i moleculele din prob sau pot avea loc
interaciuni pe baza proprietilor optice ale probelor de a reflecta, dispersa i de roti planul
luminii polarizate.
Elemente componente ale unui spectrofotometru sunt:
Sursa primar de radiaie;
Dispozitivul de monocromare a radiaiei i selectare lungime de und (monocromatoare
sau policromatoare);
Detectorul optic;
Sistemul de condiionare a semnalului (amplificatorul);
Sistemul de citire i afiare rezultat;
Legea lui Lambert Beer descrie relaia de legtur dintre absorban, grasimea stratului
absorbant de prob (grosimea cuvei) i concentraia speciilor absorbante.
A=b*c*l










2. Materiale i metode
Se prepara solutii tampon pentru valorile de pH 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, concentratiile
acestora fiind de 200 mM. Soluiile tampon se prepar n apa de ultrapura. Soluiile se
eticheteaz i se depoziteaz n sticle, de preferin nchise la culoare. Soluiile se depoziteaz la
rece dar trebuie aduse la temperatura camerei nainte de fiecare experiment. Se va verifica (i
ajusta, dac este cazul) pH-ul la nceputul fiecrei edine sptmnale, dac soluia respectiv
urmeaz s fie folosit.
Calea aleasa pentru prepararea solutiilor de pH dorit a fost pregatirea solutiei uneia dintre
componente, la concentratia dorita, si ajustarea ulterioara a pH-ului cu un acid sau o baza dupa
caz, monotorizandu-se cu pH-metrul.
Pentru a calcula cantitatea necesar de materiale solide, utilizate n prepararea soluiilor
tampon se folosete relaiile:

, n reprezentant numarul de moli,

c = 200 mM ( 0.2 M )
V = 250 ml

M
acetat
= 136 g
M
fosfat
= 138.011 g
M
borat
= 202 g
M
CAPS
= 221 g
M
glicina
= 75.07 g
Tabel 1
pH Material pKa Cantitatea [g] Ap [ml]
2 Fosfat 2.15 6.9 250
3 Glicina 2.35 3.753 250
4
Acetat
4.76
6.8
250
5 4.76 250
6
Fosfat
7.20
6.9
250
7 7.20 250
8 7.20 250
9
Borat
9.23
10.1
250
10 9.23 250
11 CAPS 10.40 11.05 250
12
Fosfat
12.33
6.9
250
13 12.33 250

Se prepar soluiie tampon dupa cantitiile prevzute n Tabelul 1.
pH-ul se ajusteaz cu ajutorul unui pH metru, al crui electrod se ine n CCl
4
, i nainte de
folosire se spal bine cu ap ultrapur, dup care se calibreaz cu o soluie tampon (de calibrare),
care are un pH constant la o temperatur dat.

Soluia tampon cu pH=2;
pH
initial
= 5.76 + HCl => pH=2;
Soluia tampon cu pH=3;
pH
initial
= 6 + HCl => pH=3;
Soluia tampon cu pH=4;
pH
initial
= 8.26 + HCl => pH=4;
Soluia tampon cu pH=5;
pH
initial
= 8.56 + HCl => pH=5;
Soluia tampon cu pH=6;
pH
initial
= 5.27 + NaOH => pH=6;
Soluia tampon cu pH=7;
pH
initial
= 5.55 + NaOH => pH=7;
Soluia tampon cu pH=8;
pH
initial
= 5.33 + NaOH => pH=8;
Soluia tampon cu pH=9;
pH
initial
= 9.29 + HCl => pH=9;
Soluia tampon cu pH=10;
pH
initial
= 9.28 + NaOH => pH=10;
Soluia tampon cu pH=11;
pH
initial
= 4.6 + NaOH => pH=11;
Soluia tampon cu pH=12;
pH
initial
= 5.27 + NaOH => pH=12;
Soluia tampon cu pH=13;
pH
initial
= 5.20 + NaOH => pH=13;
Soluiile tampon se pstreaz nchise, ferite de lumin i de cldur.
Solutia de mioglobina se pastreaza, preferabil, in concentratii de 1-5 mM. Peste
mioglobina ferica adaugam apa pura, pe urma se agita cu grija si asteptam sa se aseze solutia.
Extragerea probelor din solutiile stoc se va face tot timpul cu varfuri noi, utilizandu-se pipete
Eppendorf. In acest caz, solutia de mioglobina are concentratia de 1 mM si se pastreaza
obligatoriu in frigider. Pentru prepararea solutiei de mioglobina s-a realizat un amestec
echimolar (1:1) de mioglobina din inima de cal si apa ultrapura.
Inainte de fiecare utilizare se verifica concentratia solutiei pentru a avea reproductibilitate
in metoda utilizata. Pentru aceasta se verifica absorbana la pH=7, deoarece acest pH este cel mai
apropiat de pH-ul fiziologic. In cuva se pune 700 l de soluie tampon, cu care se face Baseline-
ul. Dup ce a fost stabilita linia de zero, se scoate cuva din spectrometru, se adaug peste 5 l
mioglobina i traseaza spectrul. Se stabileste astfel, lungimea de unda la care absorbanta solutiei
este maxima.
A = b c
b = 1 cm
A = 1.383663
= 188

Deoarece n cuv am pus 5 l de mioglobina i 700 l de soluie stoc, concentraia
iniial se calculeaz dup ecuaia:
C
1
V
1
= C
2
V
2

Concentraia soluiei tampon va fi 50 mM. Domeniul de realizare a spectrului UV-Vis
pentru o protein este de obicei 260-800 nm, insa de multe ori pentru mioglobin i alte
hemoproteine se nregistreaz spectrul doar n domeniul 400-750 nm. Pentru o protein se va
observa ntotdeauna un maxim n jur de 280 nm, datorat materialului proteic. Alturi de acesta,
proteine ca mioglobina prezint cofactori sau grupri prostetice cu absorbana n domeniul
vizibil. Un spectru UV-VIS ideal are absorbanele cuprinse n intervalul 0.1-1 uniti.
Pentru a determina absorbanele soluiile tampon se dilueaz de 3 ori ( 1 soluie tampon :
3 ap ultrapur), se pune 700 l, cu care se face linia de zero, dup care se adaug 5 l
mioglobin, i se nregistreaz spectrul. Absorbanele se citesc la lungimile de unda, la care s-a
stabilit ca apare maximul de absorbtie.

Fig. 2. Spectrul UV-VIS al mioglobinei la pH = 2 13 (Domeniul 280-650 nm)

La pH = 2 4 proteina se denatureaz, rupandu-se legaturile de hidrogen din structura.
Cnd are loc creterea pH-ului se obin benzi asemntoare cu spectrul mioglobinei,
deoarece pH-ul se apropie de pH-ul fiziologic. Se observ o band intens (banda Soret) la,
aproximativ, 410-430 nm, care in mediu acid sunt mai intense, iar n mediu bazic mai putin.
La pH bazic Fe este hexacoordinat, i are loc o acumulare de OH
-
. Dac la Fe se leag
OH
-
acesta devine de spin jos, iar cnd face legtur cu apa, acesta devine de spin nalt.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
280 380 480 580 680
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
pH = 2
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
pH = 7
pH = 8
pH = 9
pH = 10
pH = 11
pH = 12
pH = 13
Influena pH-ului asupra mioglobinei

Fig. 3. Influena pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 13 ( 450-650 nm)

Fig. 4. Influena pH-ului asupra mioglobinei pH = 2 13 ( 580-650 nm)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
450 500 550 600 650
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
pH = 2
pH = 3
pH = 4
pH = 5
pH = 6
pH = 7
pH = 8
pH = 9
pH = 10
pH = 11
pH = 12
pH = 13
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
580 590 600 610 620 630 640 650
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
Punctul izosbestic
pH = 2
pH = 3
pH = 5
pH = 6
pH = 7
pH = 8
pH = 9
pH = 10
pH = 11
pH = 12
pH = 4
pH = 13
In intervalul de 450 650 nm se observ suprapunerea benzilor pe la aproximativ 620
nm, ceea ce sugereaza existenta Fe in 2 forme de oxidare, in functie de pH diferind ligandul si
tiupl spinului.
La pH< 5 scade absorbanta i la fel i concentraia mioglobinei, dar la pH > 8 are loc
creterea absorbanei, deci i creterea concentraiei mioglobinei (absorbanta este direct
proportionala cu concentratia conform legii lui Lambert-Beer). La lungimi de und mai mari
decat 700 nm mioglobina nu mai absoarbe.
In domeniul de pH n care proteina nu este denaturat, pH>4, se poate defini o constant
pKa (logaritm zecimal din constanta de aciditate), care indic punctul de de echivalen dintre Fe
n stare de spin nalt sau jos. Pentru determinarea pKa-ului, se folosete un program de tip excel
reprezentndu-se grafic absorbana n funcie de pH, valoarea acesteia fiind determinat din
grafic, in acest caz punctul de echivalenta coincide cu acest pKa. Din grafic se poate vedea ca
pKa = 9.


Fig. 5. Determinarea pKa (absorbanta in functie de pH)


0.015
0.017
0.019
0.021
0.023
0.025
0.027
0.029
0.031
2 4 6 8 10 12 14
pKa
pKa
Influena unui agent reductor (ditionit de sodiu) asupra mioglobinei
Se prepar o soluie de mioglobin la pH = 7; 10; 12, cu concentraie de 20 mM. La
soluii cu pH = 7 i 10 se adaug ditionit de sodiu, iar cu pH = 12 dioxid de tiouree.
Soluiile tampon se dilueaz 1:5, folosindu-se apa ultrapura. Se pun n cuv 700 l din
aceast soluie i trage Baseline-ul, dup care se pun 5 l mioglobin i se nregistreaz spectrul.
Pentru urmrirea efectului unui agent reductor se adauga si cteva cristale de ditionit de sodiu n
cuv i se nregistreaz nc odat spectrul.


Fig. 6. Efectul ditionitului de sodiu i dioxidului de tiouree asupra concetraiei mioglobinei
In cazul probei la pH = 7 s-a observat scderea absorbanei i benzile se deplaseaz spre
vizibil. In cazul spectrului formei ferice maximul de absorbtie apare la 410 nm, iar n cazul
formei feroase apare la 430 nm, iar aceeasta scazand de la 0.9881132 la 0.6654195.

0
0.5
1
1.5
2
2.5
370 470 570
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
ph = 7
pH = 7 cu ditionit
pH = 10
pH = 10 cu ditionit
pH = 12
pH = 12 cu tiouree

Fig. 7. Efectul ditionitului de sodiu i dioxidului de tiouree asupra concetraiei mioglobinei
Din spectrul inregistrat se poate observa ca la pH = 10 nu apar schimbri semnificative
fa de pH = 7.
La pH = 12 se observ dou peakuri la band fr dioxid de tiouree, iar cu agentul
reductor se observ doar un singur peak. Are loc o cretere a absorbanei, de la 0.7285849 la
1.08099.


0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
470 520 570 620
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
pH = 7 cu ditionit
pH = 7
pH = 10
pH = 10 cu ditionit
pH = 12
pH = 12 cu tiouree
Dozarea activitii peroxidazice printr-o metod spectrofotometric
Peroxidaza este o enzim din clasa oxidoreductazelor ce catalizeaz oxidarea unor
substraturi organice pe seama reducerii apei oxigenate:
peroxidaza + H
2
O
2
+ substrat -> peroxidaza + H
2
O + substrat oxidat
Prepararea soluiei de ascorbat
M
ascorbat
= 176.12 g/mol
200 mM = 0.2 M = 0.2 mol/l

m = n M = 0.2 176.12 = 25.224 g
25.224 g ............................1000 ml
x......................................1 ml
x = 0.0252 g
Soluia de ascorbat de 200 mM se prepar prin dizolvarea 0.0252 g n 1 ml de soluie
tampon pH = 5.
Se verific concentraia soluiei de ascorbat prin spectrometrie UV-VIS. Se traseaza
Baseline-ul cu solutie tampon de pH=5, apoi se adauga ascorbatul si se inregistreaza spectrul.
A ~ 1 la = 290 nm
Prepararea soluiei de peroxid
Se ia 50 l de peroxid, peste care adauga 1 ml de ap ultrapur.
Se verific concentraia, cnd se face Baseline-ul cu ap ultrapur, dup care se adauga
50 l soluie de peroxid i se traseaza spectrul.
A = 2.62111
b = 1 cm
= 41
A = b c

Pentru a prepara soluia cu concentraia dorit (50 mM), soluia necesar pentru
determinare se calculeaz cu formula:
C
1
V
1
= C
2
V
2
10 64 = 50 x => x = 12.8 ml


Fig. 8. Influena ascorbatului asupra mioglobinei, n soluii cu pH = 6 i 8
Prin adugarea apei oxigenate Fe(II) oxideaza la Fe(III). La pH = 6 dup adugarea
ascorbatului intensitatea benzii scade, ceea ce nseamn, c fierul tinde s revine la starea de
oxidare initiala. In cazul probei la pH = 8 banda reprezint dou maxime, dup adugarea
ascorbatului, care nseamn c forma feric la pH=8 este mai stabil dect cea feroasa.
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
480 530 580 630
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

Lungimea de unda
Influenta ascorbatului
pH = 6
pH = 8
pH = 6 cu H2O2
pH = 8 cu H2O2
pH = 6 cu H2O2 si ascorbat
pH = 8 cu H2O2 si ascorbat
Se studiaz comportamentul mioglobinei la pH = 6, cnd se adaug peroxidaz n
diferite concentraii.
Soluia tampun cu pH = 5 [l] Mioglobina [l] Ascorbat [l] Peroxid [l]
982.6 15.38 2 0
980 15.38 2 2
970 15.38 2 10
960 15.38 2 20
948 15.38 2 32

Se prepar soluiile dupa datele intabelate.
In cuv se pune soluia tampon, cu care inregistreaza punctul zero, dup care se adauga
ascorbatul i peroxidul i se pornete reacia. Dup aproximativ 5 secunde se deschide
spectrometrul, se adauga rapid cantitatea de mioglobin, se agit i se msoar n continuare
spectrul.
V
panta
se citete din panta dreptei, reprezentndu-se mai intai grafic absorbana n funcie de timp,
pentru fiecare concentraie.
Peroxid
[M]
v
panta
v
calc
V
max
0.05 V
teoretic
Diferenta Suma

Km 600


0 0 0.0000 0.000 0
0.00018 k
cat

100 0.0055 0.0157 0.007 7.25771E-05
0.004167
500 0.0083 0.0236 0.023 8.24878E-07


1000 0.0124 0.0353 0.031 1.64907E-05


1600 0.0161 0.0458 0.036 8.99375E-05




Dupa utilizarea opiunii SOLVER, se obtin urmatoerele date:
Peroxid
[M]
v
panta
v
calc
V
max
0.05965 V
teoretic
Diferenta Suma

Km 600


0 0 0.0000 0.000 0
7.3E-05 k
cat

100 0.0055 0.0157 0.009 5.09878E-05
0.004971
500 0.0083 0.0236 0.027 1.20991E-05


1000 0.0124 0.0353 0.037 3.88374E-06


1600 0.0161 0.0458 0.043 6.07605E-06



0.0000
0.0050
0.0100
0.0150
0.0200
0.0250
0.0300
0.0350
0.0400
0.0450
0.0500
0 500 1000 1500 2000
V
i
t
e
z
a

Conc. Peroxid
Curba de saturare pentru peroxid
Curba de saturare pentru
peroxid
Poly. (Curba de saturare
pentru peroxid)
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0 500 1000 1500 2000
V
i
t
e
z
a

Conc. Peroxid
Curba de saturare pentru peroxid
Curba de saturare pentru
peroxid
Poly. (Curba de saturare
pentru peroxid)
Concluzii
Mioglobina la pH < = 4 se denatureaz, la pH>5 este stabil
La pH = 6 forma oxidat a mioglobinei este mai puin stabil dect la pH = 8