Metoda rapida HPLC pentru

determinarea resveratrolului de
vin

PROIECT ECAST

ndrumator:
Prof.univ.dr.ing.Barla Florin

Masterand :
Moldovanu Ramona
MIASP II grupa 2 C

VINUL
Definitia
data
vinului
de
Oficiul
International al Viei si Vinului este
urmatoarea: Bautura obtinuta pe
calea fermentarii spirtoase integrale
sau partiale a mustului de struguri".
Principalele soiuri de vin
cultivate

Prile
componente
ale strugurilor
i boabelor

% fa de
greutatea
strugurelui

% fa de
greutatea
boabelor

Ciorchini

3-7

Pieli

93-97

9 -11

Miez

93-97

85-90

Semine

93-97

2-6

Soiurile nobile pentru vinuri albe: Feteasca regala, Feteasca alba, Riesling italian, Aligot,
Pinot gris, Muscat Ottonel, Tamaioasa romaneasca, Grasa de Cotnari, Chardonnay,
Sauvignon, Traminerroz.
Soiurile nobile pentru vinuri rosii: Merlot, Feteasca neagra, Babeasca neagra,
Cabernet Sauvignon, Pinot noir, Cadarca, Burgund mare, Busuioaca de Bohotin si
alte soiuri.
Arealele viticole din Romania ncadrate n zonele viticole B, CI si CII si cuprind : 8 regiuni
viticole
37 podgorii
171 centre viticole

Schema
tehnologica
de prodecere a
vinurilor de
calitate
superioara

Drojdii
selecionate

SO2

Fig1.Schema tehnologic
de obinere a vinurilor
roii

Struguri roii
Recepie
Zdrobire
Dezbrobonire
Mustuial
Fermentarea pe
botin
Vin Ravac

Terminarea
fermentaiei

Botin

Presare

Vin de pres

Vin nou
Formare
Maturare
Pritocire
Cleire
Filtrare
Vin rou superior

Vin rou

Drojdie

Tescovin

Ciorchini

Componenii chimici principali ai strugurilor sunt:

Apa este componenta principal din punct de vedere cantitativ, a mustului, ocupnd n medie 70-80%

din masa sa.

Glucidele sunt reprezentate de glucoz i fructoz, care se acumuleaz n bob fiind formate prin
fotosintez.Cnd strugurii sunt copi n totalitate se acumuleaz o cantitate maxim de glucide n
bob, ce difer de la un soi la altul. n unele soiuri se gsesc i cantiti mici de zaharoz i
pentozani.
Acizii organici se gsesc liberi i sub form de sruri de Ca i K. Acidul tartric se gsete in proporii
de 0,02 ... 0,13 g % i sub forma de bitartrat de potasiu 0,4 ... 0,8%, precum i tartrat de calciu. Acidul
tartric e specific mustului i vinului i e prezent mai mult n strugurii verzi avnd gust acru ierbos,.
Pe msur ce coacerea se realizeaz acidul tartric arde prin procesul de respiraie.
Substanele azotoase se gsesc n must sub form de albumoze, peptone, peptide, aminoacizi, amide,
sruri amoniacale i azotai. Aminoacizii, amidele i srurile amoniacale sunt asimilate de drojdii la
fermentarea mustului.
Substanele pectice se gsesc n cantiti mari n pieli i semine i au proprietatea de a reine
substane coloidale.
Pigmenii sunt localizai n pieli astfel:
roii : antociane
verzi : clorofil
galbeni : caroten i xantofil
galbeni-bruni : flavone
Substanele tanante sunt prezente n semine i ciorchini, acestea n contact cu mustul n cazul n
care au fost zdrobite n timpul presrii imprim un gust astringent.
Substanele de arom sunt localizate n pieli i n zona periferic a miezului i pentru diferitele soiuri
de struguri predomin grupuri diferite de substane aromate.
Vitaminele se gsesc n must 2-4 mg/l mrind valoarea dietetic i alimentar a mustului i vinului.
Enzimele se gsesc mai mult n must, interesul fiind ndreptat spre enoxidaz, cea care catalizeaz
procesele de oxidare, n afar de aceasta se mai gsesc i invertaza, glucosidaza i lipaze.
Substana radioactiv prezent n must i vin este potasiul, ns puterea radioactiv este mic.

Bolile i defectele vinurilor

Boli ale vinurilor:
Floarea vinurilor
Oetire vinurilor
Borire vinurilor
Bloire vinurilor
Boala ntoarcerii vinurilor
Amreala vinurilor
Fermentaia malolactic

Defectele vinurilor
Casarea brun
Casarea feric neagr
Casarea cuproas
Gust i miros de hidrogen sulfurat
Gustul i mirosul de mucegai

Amreala vinului este provocat de Bacillus amaracrylus deteriornd

proprietile organoleptice, astfel c vinul devine amar, prezint un miros iritant
de acizi volatili, capt o culoare nchis, brun. Aceast boal intervine la vinuri
roii nvechite n sticle i la vinuri nematurate i nesulfitate la timp. Se poate
preveni prin pitrociri regulate, prin sulfitare SO2 100mg/l i prin corijarea
aciditii. Aceast boal se poate trata prin pasteurizare, filtrare, cleire cu gelatin,
prin corijarea taninului i prin cupajare la consum .
Gustul i mirosul de mucegai se ntlnesc la vinurile pstrate n vase mucegite.
Pentru ndeprtarea acestor defecte, vinurile se trateaz prin administrarea de
bioxid de sulf n doze de 40-50 mg/l de vin sau prin tratarea vinurilor cu fin de
mutar alb, nedegradat sau cu ulei de vaselin.

Control tehnic de calitate al vinului

Aspectul, limpezimea i culoarea vinului
Limpezimea este o condiie de baz a vinurilor finite evoluante. Aprecierea ei
trebuie s se fac att la lumin transparent, ct i n lumin reflectat, aeznd
paharul cu vin ntre ochii privitorului i sursa de lumin. n cazurile deosebit de
importante limpezimea se apreciaz n locuri ntunecoase, aeznd proba de vin n
dreptul unei lmpi electrice. Pe un fond ntunecat se pot observa cele mai mici
defecte de limpezime.
Pentru caracterizarea gradului de limpezime se utilizeaz o scar de
termeni.Conform acestei scri un vin poate fi : limpede cristalin, limpede cu luciu,
foarte limpede, suficent de limpede, puin limpede.
Mirosul vinului se examineaz n scopul aprecierii aromei sau buchetului,
precum i a prezenei unor mirosuri strine.
Prin aroma unui vin se nelege un complex de diferite mirosuri, din care unele
provin din struguri, i altele se formeaz n timpul fermentaiei. Se disting tipuri de
arom : arom primar, cu miros specific de fruct, ce provine din struguri i este
caracteristica soiului; arom secundar, aroma ce se suprapune peste cea primar
ca efect al fementaiei alcoolice.
Aadar, aroma indic mirosul unui vin tnr. Buchetul este un amestec de
arome complexe caracteristice vinului maturizat n butoaie i nvechit n sticl.

Resveratrolul, antioxidantul din vinul rosu

Vinul rosu este promovat inca din cele mai vechi timpuri drept un
medicament bun pentru organism in general si pentru aparatul
cardiovascular in special. Cercetatorii au incercat sa verifice
aceasta ipoteza si au pus in evidenta un compus numit
resveratrol despre care se crede ca este responsabil de
efectele benefice ale vinului rosu.
Resveratrolul este un compus prezent in cantitati mari in coaja
strugurilor negrii si un ingredient al multor produse naturiste
destinate tratarii unor boli de sange, inima sau ficat.
Aceasta substanta a intrat in atentia cercetatorilor de cativa ani,
drept o posibila explicatie a incidentei scazute a bolilor
cardiovasculare in randul francezilor, care au diete relativ bogate
in grasimi, dar care sunt renumiti pentru consumul ridicat de vin.
Astazi resveratrolul este promovat si considerat de cercetatori
un puternic agent antioxidant, anticancerigen si un fitoestrogen.

Importana resveratrolului deriv din trei domenii de interes

oenologic este un nou compus fenolic, provenit din struguri, care participa
la culoare, la caracterul gustativ, la invechirea vinului, intervine in reactiile de
oxidare, interactioneaza cu proteinele, etc.
fitopatologic - mijloc de protectie impotriva organismelor fitopatogene prin
stimularea apararii naturale a plantei;
farmacologic face parte din compusii cu proprietati antioxidante sau captatori
de radicali liberi in organism; protector impotriva bolilor cardiovasculare;
proprietati chimiopreventive impotriva cancerului; previne inflamatiile asociate
cu artrita si reumatismul; creste cantitatea de colesterol bun(HDL) si scade
pe cel rau(LDL).
Resveratrolul (trans3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexina asociata cu
rezistenta vitei de vie la putregaiul cenusiu i este produs de boabele de
struguri sub influenta radiatiilor UV. Sinteza resveratrolului a fost localizata in
pielita bobului, ceea ce indica ca rezistenta principala a strugurilor la atacul
de putregai are loc la acest nivel (PEZET R,-1998) Ciclul infectiei i
dezvoltarii Botrytis cinereea este redat in fig 2
Dupa infectia strugurilor in floare ciuperca patogena ramane agatata de
planta, in stare latenta, o perioada lunga de timp ( din iunie pana in
septembrie) si se dezvolta dupa coacerea strugurilor.

Fig. 2. Ciclul infectiei i dezvoltarii Botrytis cinereea

Fenomenul de latenta, timpul in care ciuperca inceteaza dezvoltarea sa, nu a

fost explicata. Dezvoltarea ei este favorizata de anumiti factori externi:
umiditatea, temperatura, tesuturile moarte, leziunile plantelor, lumina, etc.
Studiile au evidentiat anumite reactii pe care le produce ciuperca musafir.
Ipoteza acumularii rapide a compusilor antifungici resveratrol, resveratrol
trans- de- hidrodimer i - viniferina in vita de vie dupa infectia cu Botrytis
cinereea, a fost pusa pe seama latentei acesteia.
Biosinteza stilbenilor, flavonoizilor i taninurilor, decurge din metabolismul
secundar al aminoacizilor metabolizarea L- fenilalaninei in acid cumaric.
Calea de biosinteza a flavonoizilor la care participa fenilalanina, un aminoacid
aflat in cantitati mari in toate tesuturile in prezenta enzimei stilbensintaza
sufera o deviere cu formare de resveratrol (fig.3)

Fig.3 Ciclul de sintez al

resveratrolului

Sursele de resveratrol
Resveratrolul se gaseste in struguri, vin, must de struguri, fructe
afine din specia (Vaccinum), mure, si merisorul (cranberrie)
Continutul de resveratrol in strugurii rosii variaza de originea
geografica si expunerea la infectii de fungi. Un important factor
in continutul de resveratrol consta in timpul de fermentare:
Vinul alb si rose contine mai putin resveratrol
Vinul rosu contine mai mult resveratrol
Desi este prezent si in plante precum eucaliptul, molid, sau
alimente ca dudele si alunele, cea mai abundenta sursa naturala
de resveratrol o reprezinta strugurii, in special soiurile destinate
obtinerii vinului. Substanta se gaseste in radacini, ramuri,
seminte, dar mai ales in coaja boabelor care contine 50 100
micrograme la gram.
Resveratrolul face parte dintr-o clasa de compusi cu efecte
antibiotice, componente a sistemului de aparare a plantei
impotriva unor boli, in special a unor infectii fungice. Pentru ca
acestea sunt mai frecvente in climatele mai reci, strugurii din
aceste regiuni au un continut mai ridicat de resveratrol.

Proprietati
Puncte de topire: 265-266 grade Celsius
Solubilitate in apa: mai mare de 100g/ml la 25 grade Celsius
Formula chimica C14H12O3
Se prezinta sub forma unui praf alb cu particule galben deschis
Solubilitate in etanol: 50g/l
Masa molara: 228,25
Antioxidant mai puternic de 50 de ori decat vitamina E si C la un loc
Scade nivelul colesterolului total din sange
Combate osteoporoza
Administrarea de resveratrol creste activitatea de sirtuina (enzima) ce
prelungeste viata cu 70-80%.
Resveratrol face parte din clasa de: Polifenoli,
Subclasa Stilbene (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene)
Resveratrol este sintetizat din p-cumaroil CoA si malonil CoA
Recunoscut ca antioxidant care raspunde la: Stres, infectii de fungi, si radiatii
ultraviolete (UV)
Resveratrol este solubil in grasimi, compusii apar in configuratia trans si cis
Resveratrol
Cea mai importanta si uzuala forma trans Resveratrol din Polygonum
cuspidatum Sieb. et Zucc. contine cantitatea cea mai mare de Resveratrol

Proprietati
Resveratrol este o fitoalexina:
O clasa de antibiotici produsa de unele plante ca mijloc de aparare impotriva infectiei.
De examplu: Raspunde la invadarea fungiilor, Infectiile cu fungi apar mai mult in zona
cu climat rece, strugurii din zona cu climat rece poseda o concentratie mai mare de
Resveratrol. S-a observat ca mortalitatea cauzata de bolile coronariene este relativ
mica in Franta, deosebit la un nivel-relativ inalt, datorita fumatului si consumului de
acizi grasi saturati.
Aceasta a adus idea, consumului de vin rosu ca protectie la bolile cardiovasculare.
Acesti polifenoli contin antioxidanti, anti-inflamatori, si alti potentiali cu efect antiaterogenic.
Un consum moderat este asociat cu reducerea riscului de boli cardiovasculare cu 2030%, polifenoli din vinul rosu confera aditional o reducere a riscului de cancer si alte
incidente, promoveaza curatirea de placa amiloida la boala Alzheimer,efect la
osteoartrita,inhiba la gripa aviara replicarea virusul influentei aviare de tip A.
Reversia fenotipului malign cu flavonoizi: Polifenoli ca Ceai Verde Supreme cu, Acid
Elagic, EGCG - Galatul de epigalocatechina, Quercitina, Extract din Samburi de
Struguri,Isoflavone din Pueraria, I-P6 Inozitol Hexafosfat.
Resveratrol un polifenol din grupa fito-alexinelor ,N-Acetilcisteina, Vitamina C,
Vitamina D3Graviola, Indol-3-Carbinol, Diindolylmethane,Echilibru Hormonal,
Anticancer-Oncoxin.
Administrarea de antioxidanti ca factor anticancer determina reversia fenotipului
malign prin inhibarea celulelor de cancer .
Remisia completa de celule de cancer cu: Germaniu Organic (Ge 132).

Efectele cardiovasculare:
Numeroase studii au demonstrat ca vinul, in special vinul rosu, poate reduce incidenta
bolii coronariene. Fiind un puternic antioxidant, resveratrolul inhiba peroxidarea
lipidelor cu densitate joasa (LDL), previne efectul toxic al LDL-ului oxidat si protejeaza
celulele.
Se crede ca resveratrolul ofera o protectie antioxidanta mai buna decat vitamina C sau E
datorita proprietatilor sale hidrofile si lipofile. Pe de alta parte, resveratrolul este mai
putin efiecient decat quercitina sau epicatechina, ce se gasesc de asemenea in vinul
rosu. Datorita faptului ca reduce agregarea plachetara acesta substanta previne
ateroscleroza si protejeaza aparatul cardiovascular.
Efectele anticancerigene:
Resveratrolul este inca studiat pentru a se stabili cum influenteaza evolutia tumorilor
canceroase. Prin efectul sau antioxidant resveratrolul neutralizeaza radicalii liberi ce
denatureaza proteinele celulare. In plus, oamenii de stiinta au pus in evidenta efecte
anti mutagene ale resveratrolului.
Resveratrol -un produs natural activitate citostatica si eficacitate citostatica:
Resveratrol cu eficacitate citostatica: Mecanismul molecular
Ca agent citostatic la cancerul de plamin
Inhiba tumorogeneza intestinala,
In cresterea celulara de cancer bucal,
Reduce inflamatia indusa de colita
In studiu pe animale, s-a observat inhibarea cresterii de cancer mamar, esofag si
cancer intestinal prin administrarea pe cale orala de Resveratrol
La predispozitia genetica de cancer de colon, efectul prin administrarea orala s-a
mixat

Efectele administrarii
resveratrolului
asupra
corpului sobolanilor

Concentraiile de
resveratrol(ptrate,
linia punctat) i
DMU212(rombi,
linia dreapta) n
plasm i esuturi
de oarecii care au
primit o singur
doz de droguri
(240
mg/kg-1)
Valorile
difer
semnificativ
(p <0,05,).

EVALUAREA GAZ CROMATOGRAFICA (HPLC) A

COMPUSILOR DIN UNELE VINURI ROMANESTI
Cateva sute de compusi chimici diferiti: alcooli superiori, aldehide, etili esteri
ai acizilor grasi, cetone, monoterpene, fenoli volatili etc au fost identificati
in vinuri. Acesti compusi au diferite proprietti fizice si chimice, cum sunt
polaritatea si volatilitatea, si au domenii de concentratii de la cateva mg/l
pana la mai mult de 100 mg/l.

Consideratii generale
Componentii din vin provin pe mai multe cai:
- componenti in stare neschimbata din struguri (acid tartric, acid
malic, acid citric, substante minerale, anioni si cationi sub forma
de acizi minerali, saruri),
- componenti formati in timpul fermentatiei alcoolice sau a altor
procese fermentative (alcooli, acid lactic si acid succinic),
- componenti formati pe baza reactiilor dintre substantele in stare
nascanda sau a celor existente (esteri, acetali, polifenoli

HPLC
HPLC metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii
substantelor organice si anorganice aflate in solutie

ANALIZE:
farmaceutice
clinice
toxicologice
de mediu
industriale
alimentare
Calitativ: separarea,
determinarea componentilor pe
baza timpului de retentie;
Cantitativ: curba de etalonare pe domeniul de valabilitate al legii
Lambert Beer (variatie liniara a
raspunsului DAD cu concentratia)

Clasificarea HPLC functie de natura fazei stationare

Cromatografia de adsorbtie :
- faza stationara - adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice
- principiul separarii: etape repetate de adsorbtie-desorbtie
- Interactiuni hidrofobe (nespecifice) - faza inversa
- Interactiuni polare (dipol-dipol) faza normala
Cromatografia de schimb ionic :

Interactiuni
dipol-dipol

- suprafata fazei stationare este incarcata ionic, de semn contrar ionilor analitului
- specifica analitilor ionici/ionizabili
- Interactiuni ionice
SEC (GPC) :
- umplutura coloanei - pori cu dimensiuni controlate
- proba este separata in functie de marimea ionului solvatat

Clasificarea HPLC functie de polaritatea celor doua faze

Cromatografie cu faza normala
- faza stationara puternic polara (silicagel)
-faza mobila nepolara
Cromatografie cu faza inversa
- faza stationara nepolara, lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate
de silice

80%
Octadecilsilice (ODS,
C18)
10%
Octil (C8)
5%
Butil (C4)
3%
Fenil
2%

Ciano (CN)

- faza mobila polara (faza organica - CH3OH, CH3CN, THF si/sau apa, cu/fara sol.
tampon)

Elutie
izocratica

in gradient

Factorii care influenteaza separarea cromatografica

Coloana: dimensiuni (L,d), T
Faza stationara: natura, diametrul particulelor
Faza mobila: tipul de elutie, debitul, solventii
Analitul: polaritate, masa moleculara, concentratie

Dimensiunea
particulelor
(m)

Timpul de
retentie (min)

Presiunea
(bar)

30

19

18

87

1,5

700

Separarea unor compusi aromatici folosind o

coloana Hypersil-C8 (100x2) 3 mm, 60% MeOH
in Apa:
Elutie in gradient Elutie izocratica
Benzamida, alcool benzilic, acetofenona, benzoat
de metil, fenetol, naftalina, benzofenona, bifenil
Faza mobila
compatibila cu elementele instrumentului si
cu faza stationara puritate avansata
compresibilitate si vascozitate scazute
lipsita de gaze dizolvate (aer) rezultatul UV
si probleme de compresibilitate
(1)-Benzen,(2)-Monoclorbenzen,(3)

Ortodiclorobenzen,
(4)-1,2,3
triclorobenzen,(5)1,3,5triclorobenzen, (6)-1,2,3,4 tetraclorobenzen,
(7)-Pentaclorobenzen, (8)-Hexaclorobenzen

Detectorul cromatografic ideal

Raspuns independent de compoziia fazei mobile, debit, temperatura
Sensibilitate panta curbei de calibrare mare sensibilitate mare
Selectivitatea
Raspuns rapid
Zgomot de fond scazut
Non-destructiv pentru proba
Domeniu dinamic liniar mare
Stabilitate ntr-un timp ndelungat de operare
Raspuns
Sensibilitate

IR

UV/VIS

Fluorescenta

SM

Universal

Selectiv

Selectiv

Selectiv

3 picograme

1 picogram

4 micrograme 5 nanograme

Sensibilitate la debit

DA

NU

NU

NU

Sensibilitate la temperatura

DA

NU

NU

NU

Cel mai folosit tip de detector cel de absorbtie in doemniul ULTRAVIOLET-VIZIBIL. Un astfel de detector,
capabil de inregistrare la lungimi de unda variabile pe un domeniu larg 190-800nm, potrivit pentru
majoritatea compusilor.

MATERIAL I METOD
Metode de extractie- purificare si de determinare ale resveratrolului

Metoda de extractie-purificare bazata pe

extractia cu solventi;
Metode de determinare :
Cromatografie pe strat subtire si HPLC;
Extracia din struguri se face prin refluxarea
pielitelor cu metanol, evaporarea sub vid a
fazei lichide, reluare cu apa si extractie cu
acetat de etil dupa schema:

Extracia din vin

Vinul este evaporat la din cantitate in evaporator sub vid, pentru indepartaea
alcoolului. Din vinul dezalcoolizat, compusii fenolici se extrag cu acetat de etil,
dupa care se analizeaza dupa schema prezentata mai sus. urmator:
Metoda de separare prin HPLC
Extractele obinute din prelucrarea probelor de struguri i vin au fost injectate n
coloan de trei ori.
Conditii de lucru :
Coloana - C18 250 mm x 4,6 mm ;debit 1 ml/minut
Elutie: Sistem gradient = 2 solventi : A apa
B - apa acetonitril H2O / CH3 CN 2:8 (v/v)
Volumul injectat : 20l
Metoda de separare a compuilor fenolici prin HPLC are urmtoarele avantaje:
- este o metod rapid pentru separarea, identificarea i determinarea cantitativ
a compuilor aflai n amestecuri complexe;
- d posibilitatea separrii substanelor aflate n concentraii foarte mici n
amestecurile de analizat;
- este o metod simpl i uoar pentru interpretarea rezultatelor obinute;

Concluzii

Primele rezultate pun in evidenta capacitatea de separare a neflavonoizilor i

posibilitatea de diferentiere a acestora
Metodele descrise se recomanda pentru analiza calitativa i cantitativa a
resveratrolului din struguri, must i vin dar i din alte produse alimentare.
HPLC-ul deschide un nou camp de investigatii asupra moleculelor organice:
fenoli, polifenoli
Cercetarile intreprinse in utilizarea HPLC-ul in analiza resveratrolului i in
general a compusilor fenolici au condus la aplicarea unei metode cu rezolutie
i reproductibilitate inalta.
Vinurile rosii sunt caracterizate de prezenta unor cantitti mari de alcooli
superiori, etili esteri, acetati, acizi grasi si compusi carbonilici.

Continutul de resveratrol in vin (mg/l)

Alb
0,05-1,80
Rose
0,43-3,52
Rosu
1,92-12,59
Must de struguri 1,14-8,69

Exemplu
CROMATOGRAMA
Resveratrolului
de vin
la timpul de retentie
respectiv