LUCRAREA PRACTICA NR .

INFLUENTA CONCENTRATIEI DE SUBSTRAT ASUPRA VITEZEI DE REACTIE

ENZIMATICA

La baza cineticii enzimatice sta postulatul existentei unui complex deosebit de reactiv
intre E si S ei numit complex ES sau complex Michaelis.

Se porneste de la TEORIA STARII STATIONARE(elaborata de Briggs si Haldane )

potrivit careia viteza de formare si viteza de scindare a complexului [ES] sunt aproximativ egale,
astfel incat pentru o perioada scurta de timp concentratia complexului [ES] poate fi considerata
constanta;pe perioada mai mare de timp, concentratia complexului [ES] se va modifica deoarece
reactia progreseaza si cantitatea de S scade, dar viteza modificarii concentratiei complexului ES
va fi intotdeauna mult mai mica decat viteza reactiei enzimatice.

Relatia cantitativa dintre viteza de reactie enzimatica, concentratia substratului si K m si

care indeplineste coditiile unei curbe hiperbolice este ecuatia Michaelis Menten :

Vmax x [S]
V=
KM + [S]

In care:

V – reprezinta viteza de reactie masurata;

Vmax – viteza maxima de reactie in conditiile saturarii E cu S;

[S] – concentratia substratului;

KM – constanta Michaelis(moli/l)

Pornind de la ecuatia Michaelis Menten vom urmari cum influenteaza raportul dintre [S] si
KM, viteza de reactie:

1. Cand [S] << KM :

Vmax x [S]
V=
KM

Obsevam o dependenta liniara intre V si [S] la concentratii mici de [S]

 2. Cand [S] >> KM, putem neglija KM:

Vmax x [S]
V= = Vmax
[S]

La concentratii mari de [S], viteza de reactie tinde asimptotic catre viteza maxima.

3. Cand [S] = KM :

Vmax
V=
2

Semnificatia constantei Michaelis.

Constanta Michaelis (KM) reprezinta acea concentratie de substrat pentru care viteza de
reactie corespunde la jumatate din viteza maxima de reactie.
Aceasta constanta poate fi considerata si un indicator al afinitatii enzimei pentru substrat.
Astfel, cu cat KM are o valoare mai mare, cu atat afinitatea enzimei pentru substrat este mai
scazuta si invers, deci o valoare mare a KM indica o disociere mai puternica a complexului
intermediar ES si invers.
Constanta Michaelis (KM) se exprima in mol/l si poate lua valori intre 10-1 si 10-8.

INFLUENTA CONCENTRATIEI DE SUBSTRAT ASUPRA VITEZEI DE

REACTIE ENZIMATICA

Atunci cand concentratia de enzima este mentinuta constanta, iar concentratia de substrat
creste, viteza reactiei enzimatice variaza dupa o curba care corespunde unei hiperbole echilatere
ce tinde asimptotic la valoarea maxima a vitezei.

Vmax

Vmax
2

KM [S]
 Dozarea activitatii fosfatazei alcaline utilizand ca substrat p-nitrofenilfosfatul

Principiul metodei

Fosfataza alcalina scindeaza hidrolitic substratul (p-nitrofenilfosfatul) eliberand

p-nitrofenol. Acesta din urma se determina spectrofotometric, in mediu alcalin la λ=405 nm.

OPO3H2 + H2O OH

- H3PO4

NO2 - H2O NO2

p-nitrofenilfosfatul p-nitrofenol

Reactivi si solutii

1. Solutie tampon glicina- NaOH, 0,1 M, pH=10;

2. Solutie p-nitrofenilfosfat (substrat) 2Mm;
3. Solutie NaOH 0.1 M;
4. Extract proteic total din ficat bovin realizat in apa distilata, raport de extractie 1: 10.

Mod de lucru

Proba Martor

2.5ml sol.tampon 2.5 ml sol.tampon

0.5 ml sol.substrat 0.5 ml sol.substrat

1.0 ml EPT 5 ml NaOH 0.1 M

Incubare 30 min la 25 0C 1 ml EPT

5 ml NaOH 0.1 M citire DO405nm

Citire DO405nm
Se vor face cinci probe avand concentratii crescatoare de substrat (p-nitrofenilfosfat 2mM)
Conform tabelului de mai jos, mentinanad concentratia de enzima constanta, pentru a observa
variatia vitezei de reactie enzimatica in functie de concentratiile diferite de substrat.

S S0 S1 S2 S3 S4 S5
Reactivi
p-nitrofenilfosfat 0 0.1 0.2 0.5 1.0 1.5
2Mm
Solutie tampon 3 2.9 2.8 2.5 2.0 1.5
EPT(ml) 1 1 1 1 1 1

incubare 30 min la 250C

NaOH 0.1M 5 5 5 5 5 5
DOP 0,013 0,068 0,139 0,3 0,328 0,328
DOM 0,013 0,013 0,02 0,021 0,022 0,022
AE 0 0,0009 0,0019 0,0045 0,0049 0,0049
(µmoli/ml/min)
[S] (µmoli) 0 0.2 0.4 1 2 3

Calculul rezultatelor

DOP - DOM 1
AE = x x 9 = [µmoli/ml/min]
18.5 30