DOZAREA PROTEINELOR PRIN METODA BIURETULUI

Principiul metodei
Sulfatul de cupru, în mediu bazic, reacţionează cu substanţele care conţin două sau mai multe
legături peptidice, formând un complex violet. Intensitatea culorii este o măsură a numărului de
legături peptidice prezente în proteină, fiind, deci, proporţională cu concentraţia soluţiei proteice.
Denumirea metodei vine de la compusul numit biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2), pentru care reacția
este pozitivă.
Metoda este utilizată pentru dozarea unor cantităţi relativ mari de proteine (1-20 mg/mL).

Reactivi şi soluţii

1.Soluţie standard de albumină serică bovină (BSA) 5 mg/mL (0,5 g/100 mL)
2.Reactiv biuret (se dizolvă 3 g CuSO4.5H2O şi 9 g tartrat de sodiu şi potasiu în 500 mL soluţie
NaOH 0,2 M) ; se adaugă 5 g KI şi se aduce volumul la 1 L cu soluţie NaOH 0,2 M.
3.Extracte proteice (a căror concentrație va fi determinată)

Mod de lucru
A) Construirea curbei de etalonare
Se pregătesc 6 diluții din soluția standard de albumină serică bovină, conform tabelului1. În
fiecare eprubetă se adaugă câte 1,5 mL reactiv biuret. Eprubetele se agită energic, se incubează timp
de 10 min la 37C (sau 30 min la temperatura camerei), apoi se colorimetrează la 540 nm faţă de apă
distilată.
Se construieşte curba etalon trasând pe abscisă concentrația proteinelor (mg proteină/mL), iar pe
ordonată A540..
Tabelul 1 Pregătirea diluțiilor de albumină serică pentru curba de etalonare

Nr.epr. mL sol. albumină mL apă distilată Conc. A540

serică bovină proteină
(5 mg/mL) (mg/mL)
1 0 0,5 0
2 0,1 0,4 1
3 0,2 0,3 2
4 0,3 0,2 3
5 0.4 0,1 4
6 0,5 0 5
B) Dozarea proteinelor
Pentru dozarea proteinelor solubile totale, din extractele proteice se prelevează probe cu volumul de
0,5 mL, la care se adaugă 1,5 mL reactiv biuret; probele se prelucrează similar eșantioanelor de la
curba de etalonare. Absorbanțele probelor sunt transformate în concentrații cu ajutorul curbei de
etalonare.
Chemistry of Protein Assays | Thermo Fisher Scientific - US.” Thermo Fisher Scientific, Thermo Fisher
Scientific,www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-
center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/chemistry-protein-assays.html.