Lucrare de laborator Nr. 3.

Dozarea fotocolorimetrică a proteinelor totale

prin metoda biuretului
Principiul metodei: Compuşii de natură proteică cu cel puţin două legături
peptidice dau cu ionul Cu2+ în soluţie alcalină formează un complex de culoare
violetă (vezi lucrarea 1.3.2.). Complexul cupru-proteină prezintă un maxim de
absorbţie la lungimea de undă de 540 nm, aparţinând domeniului vizibil al
spectrului şi al cărui intensitate este direct proporţională cu conţinutul de proteină
în proba analizată.
Utilaje și reactive: fotoelectrocolorimetru; stativ cu eprubete; reactiv biuret
(se dizolvă 0,375 g sulfat de cupru pentahidrat (CuSO4×5H2O) şi 1,5 g sare
Seignette (tartrat dublu de sodiu-potasiu, KNaC4O6H4×4H2O) în 75 ml NaOH,
soluţie 10%, apoi se aduce la un volum final de 250 ml cu apă distilată); soluţie-
standard de proteină cu concentrația 10 mg/ml; ser.
Notă: La păstrare în vas de sticlă reactivul biuret îşi pierde valabilitatea.
Mod de lucru:
a) Trasarea curbei de etalonare: Se prepară o serie de 10 eprubete, conform
Tabelului 4:
Tabelul 4. Prepararea amestecurilor de soluție proteică și reactiv biuret.
Sol. standard Apă distilată Reactiv biuret Cantitatea de proteină în
Nr. probei
proteină (ml) (ml) (ml) probă (g)
0 0,00 1,00 4,0
1 0,02 0,98 4,0
2 0,04 0,96 4,0
3 0,06 0,94 4,0
4 0,08 0,92 4,0
5 0,10 0,90 4,0
6 0,12 0,88 4,0
7 0,14 0,86 4,0
8 0,16 0,84 4,0
9 0,18 0,82 4,0
10 0,20 0,80 4,0
 Probele astfel pregătite se lasă în repaus timp de 15 min, după care se
determină extincţia probelor 1-10 faţă de proba-martor 0, la 540 nm, în cuve de 2
cm. Reprezentând grafic extincţia probelor în funcţie de conţinutul de proteină al
acestora, se obţine curba de calibrare.
b) Determinarea conţinutului de proteină în probă: Într-o eprubetă se
pipetează 0,10 ml ser, 0,90 ml apă distilată şi 4,0 ml reactiv biuret. Se agită
eprubeta, se lasă în repaus timp de 15 minute, apoi se determină densitatea optică
la 540 nm faţă de acelaşi martor ca şi la trasarea dreptei de etalonare. Folosind
dreapta-etalon se determină apoi conţinutul de proteină al probei şi în final al
soluţiei de analizat. Se fac trei determinări succesive pentru aceeaşi probă şi se face
media celor mai apropiate două determinări.