Dozarea proteinelor prin metoda

Bradford
Recapitularea principiilor de spectrofotometrie
LP2
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie

Multe experimente biochimice implică măsurarea unui compus prezent într-un

amestec complex. Cele mai utilizate metode utilizate pentru cuantificarea concentrației
compușilor biochimici se bazează pe metode spectrofotometrice.
Testele de dozare a proteinelor utilizeaza în general metode spectrofotometrice
bazate pe diverse caracteristici spectrale ale aminoacizilor care fac parte din structura
proteinelor.
Alegerea metodei depinde de nevoile și caracteristicile căutate: fiabilitate,
sensibilitate, viteză, dimensiunea eșantionului, capacitatea de a recupera eșantionul după
dozare, prezența substanțelor care interfera cu eșantionul, etc.
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie

Fotometria înseamnă măsurarea luminii. Culoarea pe care o percepem de la o

sursă de lumină este asociată cu o anumită lungime de undă, λ.
Lungimea de undă (λ) este perioada spațială a unei unde periodice - distanța
pe care se repetă forma undei, caracteristică unei unde monocromatice într-un
mediu omogen, definită ca distanța dintre două maxime consecutive de
amplitudine.
Este egală cu viteza (c) a unei unde într-un
mediu împărțit la frecvența sa (f): λ = c / f.
λ = lungimea de undă
c = viteza luminii (m / s)
f = frecvență (MHz)
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie
Lungimea de undă depinde de viteza cu care unda se propagă prin mediul prin
care trece. Când unda se deplasează de la un mediu la altul, frecvența sa rămâne
neschimbată, dar lungimea ei de undă variază.
Spectrul vizibil pentu om este parte a spectrului electromagnetic și are o lungime
de undă cuprinsă între 400 și 700 nanometri (nm). Când lungimea de undă se
schimbă în spectrul vizibil, se detectează o modificare a culorii.
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie

Lumina soarelui și toate lungimile de undă vizibile apar ca lumină albă.

Culoarea majorității obiectelor depinde de interacțiunea dintre lumina albă și
electronii atomilor sau moleculelor care alcătuiesc obiectul.
Culoarea percepută a unui obiect are o relație directă cu culoarea luminii
vizibile absorbite. Dacă o soluție pare albastră, aceasta lasă lumina albastra a
soarelui să treacă prin ea.
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie
Când lumina albă trece printr-o soluție colorată, o parte din lumină este
absorbită și o parte din lumină este transmisă. Lumina absorbită este măsurată
în densitate optică (DO) sau absorbanță (A). Această lumină absorbită este
captata de o celula fotoelectrică, care transformă energia luminii în energie
electrică măsurată de un galvanometru.
Mulți compuși incolori pot fi colorați cu reactivi corespunzători. Intensitatea
culorii compusului necunoscut este comparată cu un standard (cu concentrație
cunoscută). Absorbanța este proporțională cu concentrația substanței și poate fi
determinată cu un instrument optic numit colorimetru sau spectrofotometru.
 Recapitularea principiilor de spectrofotometrie
Măsurarea intensității culorii unei soluții colorate prin fotometrie este guvernată de
legea Beer-Lambert: cantitatea de lumină absorbită de o soluție colorată este
proporțională cu concentrația soluției și lungimea căii parcurse de lumina din soluție.

A = absorbanță (fără unitate)

ε = coeficientul de absorbție molară, caracteristic speciei absorbante la o lungime de
undă dată și reflectă probabilitatea sa de absorbție a unei cuante de lumină (L / mol /
cm).
l = lungimea căii parcurse de lumină în soluție, exprimată în centimetri (cm)
C = concentrația speciei absorbante în soluție, exprimată în moli pe litru (mol / L)
Recapitularea principiilor de spectrofotometrie
O aplicație a legii lui Beer-Lambert este determinarea concentrației
unei soluții folosind tehnica curbei de calibrare. Pentru a cunoaște
concentrația unei soluții / probe, se efectuează mai întâi o curbă de
calibrare folosind dilutii ale unei soluții standard (soluție cu
concentrație cunoscută).
 Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
Cele mai frecvente metode spectrofotometrice pentru determinarea
concentrației proteice sunt: metoda Bradford, metoda Biuret, metoda Lowry,
metoda Amido Black, metoda BCA. Metoda Bradford este mai simpla, mai
rapidă și mai sensibilă decât metoda Biuret și Lowry. Reactivul „Bradford”
conține colorantul Coomassie G250 Bright Blue. În soluție, colorantul Coomassie
are o formă roșie cationică, care se absoarbe la 470 nm.
 Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
În mediu metanoic acid Coomassie G250 formează un complex cu proteinele. Legarea sa la
proteine duce modificarea structurii avand o formă anionică, albastră, care se absoarbe la
595 nm. Intensitatea culorii măsurate la 595 nm este direct proporțională cu cantitatea de
proteine din probă: cu cât este mai mare concentrația de proteine, cu atât culoarea este
mai albastră.
Coomassie G250 Bright Blue se leagă de proteine prin interacțiuni non-covalente. Este
adsorbit pe proteine în principal prin interacțiuni ionice care implică grupările sulfonice acide
ale colorantului și aminoacizii bazici (arginină, histidină și lizină) ai proteinei, dar și prin
interacțiuni hidrofobe (aminoacizi hidrofobi), forța Van der Waals și legături de hidrogen.
Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
Reactivi
• Reactiv Bradford: 100 mg de colorant Coomassie G250 se dizolvă în
50 ml de etanol 95%; soluția alcoolică se amestecă cu 100 ml acid
fosforic 85% și se ajustează la un litru cu apă distilată.
• Albumină serică bovină (BSA): soluție standard la 2 mg / ml preparat
extemporaneu în același mediu cu extracția proteinelor.
• Ser sau extract proteic total: țesutul (aproximativ 30 mg) este
omogenizat în 300 µL de tampon PBS 1X pentru a rupe membranele
celulare; extractul este centrifugat timp de 20 minute la 12.000 g
(11.300 rpm) și 4 ° C; supernatantul este pastrat la 4 ° C.
 Dozarea proteinelor prin metoda Bradford
• Modul de lucru
Microtub 1 2 3 4 5 6 7

Solutie standard BSA (μL) 0 25 50 75 100 125 150

Solutie tampon PBS (μL) 200 175 150 125 100 75 50

Concentratie Standard (mg/mL) 0 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50

Reactiv Bradford (µl) 250 250 250 250 250 250 250

Se amestecă, se incubează 15 minute și se citește absorbanța la 595 nm la spectrofotometru

Absorbanta Standard (A595) A1 = A2 = A3 = A4 = A5 = A6 = A7 =

 Dozarea proteinelor prin metoda Bradford

Standard (BSA) concentration Absorbance Chart Title

(mg/mL) y = 1,2611x
0 0,0161 R² = 0,9944
0,25 0,4696
0,50 0,7561 2
1,8
1,6
0,75 0,9888 1,4
1,2
1
1,00 1,2882 0,8
0,6
0,4
1,25 1,5541 0,2
0
1,50 1,8032 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Ecuația dreptei A = f (C) este de forma y = ax ± b

Folosind Xcell, vă rugăm să obțineți ecuația dreptei