Determinarea proteinelor prin Metoda Biuret

Principiul metodei
În mediu alcalin, proteinele formează cu ionii de cupru II (Cu2+) un
complex albastru-violet. Intensitatea culorii variază direct proporțional
cu concentrația proteinelor.

Reactivul Biuret conține:

• sulfat de cupru – dă culoarea albastră a reactivului
datorită ionilor Cu2+ aflați în concentrație 3 mmol / L;
• o soluție de hidroxid de sodiu (soda) de 0,2 mol / L ,
ceea ce face ca mediul de reacție să fie să fie bazic;
• tartrat dublu de sodiu și potasiu – „chelează” ionii Cu2+
și previne precipitația lor într-un mediu alcalin sub
formă de hidroxid de cupru insolubil Cu(OH)2;
• iodură de potasiu, pentru a evita reducerea ionilor
cuprici înainte de utilizarea reactivului.
Limitele metodei
• Este nevoie de cel puțin 3 sau 4 legături peptidice pentru a se forma complexul
proteină – Cu2+ și pentru a obține o colorație detectabilă.
• Reacția nu este foarte sensibilă (concentrația proteică trebuie să fie suficient de
ridicată).
• Legea lui Lambert-Beer este respectată pentru o concentrație în proteină totală
cuprinsă între 0,8 și 10 g/L. Dacă concentrația proteică este peste această
valoare, se repetă testul pe proba diluată ½ cu soluție de NaCl 0,9 %, fără a uita
să se ia în considerare această diluție înainte de a calcula rezultatul (care va fi
înmulțit cu 2).
• Într-un mediu alcalin, anumiți compuși chimici, cum ar fi glucidele reducătoare,
sunt capabili să reducă ionii cuprici la ioni cuproși. Prin urmare, această metodă
face imposibilă determinarea proteinelor în probele complexe, cum ar fi laptele.
A. Procedeul dreptei de etalonare
Principiul metodei
Cu ajutorul unei soluții de albumină serică bovină de concentrație
cunoscută (referință, etalon sau standard), se realizează o gamă de
etaloane (serie de eprubete care conțin un volum identic, dar cantități
crescute și cunoscute ale proteinei de referință). Reacția de culoare se
dezvoltă pentru standarde și pentru proba de analizat. Se citește apoi
absorbanța tuturor soluțiilor. Se desenează dreapta de calibrare A = f
(concentrație). Absorbanța probei, interpolată pe grafic, face posibilă
determinarea concentrației proteinelor din proba de analizat.
 Protocol
1. Partea I a determinării
ealizați diluțiile pentru dreapta de etalonare, preparați martorul și
proba necunoscută, conform schemei de mai jos.

Proba
BSA 6,4 g/dL NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9%
necunoscută
40 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL
20 µL
 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL

NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9% NaCl 0,9% Probă
BSA 6,4 g/dL
20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL necunoscută
40 µL
20 µL
Concentratiile rezultate

BSA 3,2 g/dL BSA 1,6 g/dL BSA 0,8 g/dL BSA 0,4 g/dL BSA 0,0 %
BSA 6,4 g/dL Probă
20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL
20 µL necunoscută
20 µL
2. Partea a IIa a determinării
• Realizarea reacției biuretului pentru etaloane, martor și proba necunoscută.

Biuret
1 mL

BSA 3,2 g/dL BSA 1,6 g/dL BSA 0,8 g/dL BSA 0,4 g/dL BSA 0,0 % Probă
BSA 6,4 g/dL
20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL
20 µL
Martor
 BSA 3,2 g/dL BSA 1,6 g/dL BSA 0,8 g/dL BSA 0,4 g/dL BSA 0,0 % Probă
BSA 6,4 g/dL
20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL 20 µL
20 µL
3. Partea a IIIa a determinării
• Citirea absorbanțelor, trasarea curbei etalon și determinarea concentrației probei.
Deduceți concentrația proteică a eșantionului necunoscut prin metoda curbei de calibrare. folosiți
Microsoft Excel
B. Procedeul coeficientului de absorbție

Legea Lambert Beer: A = ε x c

Þ ε = A/c
ε1 = A1/c1; ε2 = A2/C2............
Þ ε ‾= (ε1 + ε2 + ….+ εn)/n
Þ Cprobă = ε ‾ x Aprobă
 Calculați concentrația probei lucrate prin procedeul coeficientlui molar de absorbție.

Concentration Absorbance des ε Absorbance de Concentration

des standards standards (dL/g) ‾ε l'échantillon de l'échantillon
g BSA/dL (ε=As/cs) inconnu inconnu calculé
avec‾ε

6.4 0.85

3.2 0.4
0.23
1.6 0.19

0.8 0.12

0.4 0.05