Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ELECTROFOREZA
Curs 9-10
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive
Electroforeza reprezintă o metodă de analiză și separare bazată pe migrarea particulelor solide încărcate electric (ioni,
macromolecule cu sarcină electrică, coloizi, unele celule, precum bacterii sau eritrocite) dispersate într-un lichid sub
acțiunea unui camp electric. Mediul în care se pot deplasa speciile încărcate electric pot fi:
1) mediu liber nelegat (pe o coloană de lichid);
2) mediu fixat (pe suport poros).
Astfel, daca se stabileste o diferenta de potential intre extremitatile unei solutii sau benzi de hartie (gel sau alte materiale),
impregnata cu un electrolit convenabil, pe care se depune o picatura de analit, constituientii ionici ai analitului se vor deplasa
sub actiunea campului electric cu viteza lor proprie. Aceasta viteza poate fi urmarita si masurata.
Prin electroforeza se pot determina marimea, forma si sarcina unei molecule, masa moleculara etc.
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive
O specie chimica cu sarcina q , aflata intr-un camp electric de intensitatea E(volti/cm) va fi supus unei forte FE data de
relatia:
Deplasarea specie ionice se realizeaza intr-un fluid, acestei deplasari i se opune forta de frecare Stokes data de relatia :
în care η este vâscozitatea mediului lichid în care sarcina se deplasează, r este raza speciei ionice (considerata sferică),
iar ve este viteza de deplasare
Forţa de frecare creşte proporţional cu creşterea razei speciei ionice, viscozităţii mediului în care se deplaseaza şi viteza
de deplasare. La o deplasare cu viteza constanta cele doua forte sunt egale (FE=Ff). Viteza de deplasare va fi data de
relatia:
Daca se considera ca primul termen al relatiei de mai sus ca fiind mobilitatea electroforetica:
Viteza de migrare a ionilor depinde de mai multi factori si anume: sarcina electrica, marimea si forma particulelor, forta
ionica, vascozitatea si pH-ul electrolitului, tensiunea aplicata, temperatura, natura suportului solid (hartie
cromatografica, acetat de celuloza, gel, etc.).
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive
Mobilitatea electroforetica a particulelor se defineste ca distanta parcursa in unitatea de timp (secunda) intr-un camp
electric de o forta electrica egala cu o unitate de potential si este determinata si de caracteristicile constructive ale celulei de
electroforeza si de caracteristicile componentelor analizate astfel:
𝑙 𝑙′
µe = d 𝑡 𝑉 ( 𝑙 )
l’/l - factor de corectie care caracterizeaza sinuozitatea fasciculelor capilare ale hartiei si depinde de tipul de hartie folosit
(pentru hartia cromatografica Schleicher-Schull 202, l’/l = 0,58 ± 0,06).
ELECTROFOREZA SISTEMELOR BIOLOGICE
• Multe molecule biologice sunt amfoliti care există ca anioni sau cationi in functie de pH:
• Soluţie cu pH < pI (punctul izoelectric - pH-ul la care amfolitul are suma sarcinilor electrice
zero), amfolitul are sarcina +ve,
• Soluţie cu pH > pI, amfolitul are sarcina –ve,
• In cazul in care se formeaza combinatii complexe, sensul migrarii este in functie de
incarcarea ionilor rezultati.
• Migrarea particulelor in campul electric se produce spre polul de semn opus incarcarii
particulelor:
- Cationii migreaza spre catod (-) - (cataforeza)
- Anionii migreaza spre anod (+) - (anaforeza).
- La punctul izoelectric, nu are loc migrarea electroforetica
Componenta echipamentului de electroforeza
1
2
2 2 2 2 1 n
c1z1 c 2 z 2 c3z 3 c n z n ci z i2
2 i 1
unde c1, c2, ..., cn sunt concentraţiile molare ale diverşilor ioni în soluţie şi z1, z2, ..., zn sarcinile lor
-Forta ionica trebuie sa fie bine corelata cu tensiunea aplicata precum si cu timpul de electroforeza.
-pentru solutii tampon cu o forta ionica μ = 0,05 - 0,1 trebuie sa se aplice o tensiune mica pe o
durata de timp mai lunga.
-pentru solutii tampon cu forta ionice (μ = 0,05 sau mai mica) se reduce durata de migrare si se
creste tensiunea.
Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza
Surse de alimentare
• Sursă de alimentare: curent continuu intre 2 electrozi
• Fluxul de curent produce căldura care incalzeste proba si
determina:
- Creşterea vitezei de migraţie si extinderea tipurilor de probe
- Formarea de curenti de convectie care determina amestecarea
probelor
- Instabilitate termică a probelor sensibile la căldură
• Evaporarea apei determina concentrarea ionilor, creşterea
vascozitatii soluţiei tampon si scade rezistenţa electrica
• Pentru a minimiza problemele: se utilizeză surse de alimentare cu
putere constantă si mare
Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza
Detecţia şi cuantificarea
• Rapida ca:
-% din fiecare fracţiune prezentă
- concentraţia absolută
• Prin densitometrie:
- benzile electroforetice se trec printr-un sistem optic de masurare
- absorbanţa fiecărei fracţiuni afisată pe o diagramă
Electroforegrama
Detectoarele sunt plasate la catod/anod, in conditii comune, toate speciile
sunt conduse in aceasta directie de catre forta electromotoare.
Detectoare de tip spectrometre cu absorbtie UV, de fluorescenta si MS etc.
Detectoare sensibile sunt necesare pentru concentratii mici.
TIPURI DE ELECTROFOREZA
Caracteristici
• Migraţia moleculelor incărcate
• Mediu de migrare depus pe un suport
-Medii poroase de gel de tip: agaroză, acetat de celuloza, poliacrilamidă
- Pot fi uscate şi reutilizate
• Acelaşi pH şi domeniu de rezistenţă electrica
• Separare bazată pe mobilitate electroforetică
• Separă coloizi macromoleculari de exemplu: proteine in ser, urină, LCR,
eritrocite, acizi nucleici
Electroforeza in gel de agaroza
-Cea mai comuna metoda de separare in laboratorul biomedical
-Separarea este bazata pe diferenta de mobilitate a moleculelor incarcate sub infuenta campului electric.
Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza in gel de agaroza:
-tehnica standard,
-electroforeza in gel de SDS-agaroza (la care adaugarea SDS - sodium dodecil sulfat in compozitia suportului
electroforetic permite separarea fractiunilor pe baza masei moleculare)
•Avantaje:
-gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate
-rapiditatea, conferita de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independentei totale a
celor doua module (de migrare si colorare)
-gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minima a factorului uman la metodele manual;
-diversificarea parametrilor investigati (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale si patologice)
-aplicabilitatea in cazul mai multor lichide biologice (ser dar si urina, LCR si altele), precum si faptul ca pentru aceste
lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel inlaturat un neajuns important.
Aplicatii ale electroforezei in gel de agaroză (EGA)
Avantaje:
- Viteza de separare ridicata
- Posibilitatea de a stoca membrane transparente
Dezavantaje:
- Presare inainte de utilizare
- Curăţare pentru efectuarea densitometriei
Electroforeză in gel de poliacrilamidă (PAGE)
Separarea se realizeaza in functie de greutatea moleculara a proteinelor si dimensiunea componentelor
probelor
• Utilizare:
Pentru a evalua puritatea proteinei
Pentru a determina MW proteinelor
b) Metode non-denaturare
• Separarea proteinelor se bazează pe:
- Mobilităţile electroforetice diferite
- Efectul de “cernere” moleculara a gelului
• Utilizare
- Pentru a obţine proteine native/enzime
- Pentru a studia activitatea biologica
Concentrarea izoelectrică (isoelectrofocusing)
Caracteristici:
• Se utilizeaza pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine)
• Proteinele se deplaseaza in zona in care: pH-ul mediu = pI => sarcina = 0
• pI este limitat intr-un domeniul de pH ingust =>zone ascuţite pentru proteine
Metoda de lucru :
- Folosirea gelurilor orizontale pe sticlă / folii de plastic
- Să introduc amfoliţii in gel => se crează gradientul de pH
- Se aplică o diferenţă de potenţial in gel
- Anod => zona cu pH-ului cel mai mic
- Catod => zona cu pH-ului cel mai mare
- Proteinele migrează pană cand se ajunge la pH = pI
Se spală cu soluţie de fixare pentru eliminarea amfoliţilor
- Colorare, decolorare, vizualizare
Electroforeza bidimensinală (2D)
Reprezinta tehnica de separare care consta in combinarea a doua tehnici electroforetice:
-separarea izoelectrica prin care proteinele se separa pe baza sarcinii electrice, folosing geluri cu gradient de pH urmata de
separarea SDS-PAGE prin care proteinele se separa pe baza greutatii lor moleculare
• prima dimensiune utilizand IEF (concentrarea izoelectrica)
- intr-un mediu cu pori mari
- amfoliţii formează gradientul de pH
• a doua dimensiune utilizand EG, dependentă de greutatea
moleculară
- in poliacrilamidă
- liniar sau gradient
• Metoda O'Farrell:
- Denaturare prin utilizarea β-mercaptoethanol (prima D)
şi SDS (a doua D)
• Detectează proteine folosind coloranţi (Coomassie), radiografie, fluorografie
• Separă 1100 de culori (autoradiografie)
Optimizarea proceselor electroforetice
Optimizarea electroforezei
efectele endo-osmotice.
Aplicatii: Separarea proteinelor plasmatice
Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la
pH 9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH 8.5.
Utilizarea amidoschwarz-ului drept colorant confera rezolutie, specificitate si sensibilitate
metodei, putand fi detectate, chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.
Metode:
–Electroforeza in: amidon gel, agar gel, acetat celuloza, PAGE, EC
O proteina in solutie care are un pH inferior punctului sau izoelectric se va comporta ca o baza si
va accepta protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata pozitiv. In mediu acid:
O proteina in solutie care are un pH superior punctului sau izoelectric se va comporta ca un acid
si va ceda protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata negativ.
In mediu bazic:
Prin electroforeza serului uman se obtin astfel sase fractii proteice: albumina, alfa1, alfa 2, beta
1 si 2 si gama globuline.
Se realizeaza astfel o migrare reprezentata grafic (electroforegrama).
Interpretarea principalelor modificari pe electroforeza proteinelor serice
Modificari la nivelul albuminelor Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele
•bisalbuminemii tranzitorii sau permanente Cresc in: sindrom nefrotic, diabet zaharat, miocardoscleroza,
•analbuminemie congenitala endocardite bacteriene, arsuri, boli infectioase, rheumatism, reactii
•hipoalbuminemia apare in: inflamatorii
-insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.
severa) Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in:
-diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii hepatita cronica, reactii de faza acuta insotite de hemoliza, terapie
-pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva cu estrogeni, sarcina
(gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri) Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in:
-hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse poliartrita reumatoida, boli cu complexe imune circulante
(tireotoxicoza, sindrom Cushing) Scaderea alfa-1 globulinelor apare:
•hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent •in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii
la pacientii cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma de proteine
perfuziilor cu albumina •in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina
Metode alternative care implica detectarea potentiometrica sau conductometrica sunt, de asemenea,
utilizate
Detectare potentiometrica: un ISE cu spectru larg
Detectarea conductometrica: cum ar fi IC
Acrilamida
CH2=CH-CO-NH2
Random Retea
EC proteinelor si peptidelor
EC carbohidratiilor cu detectie indirecta UV
300 mM dietilamina
(DEA), + 20 kV
Debit scazut: DEA 0,25%
in 2 propanol/apa 80:20,
4 mL/ min.
17 analiti in 5 minute
EC a aminoacizilor cu detector UV
Separare:
- dupa derivatizare
Fara derivatizare
- cationic
- anionic
Separarea aminoacizilor prin EC cu detector MS