C1

Înțelegerea noțiunii de proteom

si a principalelor instrumente
de lucru si aplicații ale
proteomicii.
■ Adrian Onu, Dr. St. Nat.
■ Facultatea de Inginerie Medicală.
■ Institutul Național de Cercetare-Dezvoltare Medico-Militara
„Cantacuzino”.
1.1 Noțiuni fundamentale: Principalele concepte și
instrumente de lucru în proteomică: metodologie
analitică, baze de date.
1.2 Structura primară a proteinelor și proprietățile
acestora (compoziție, proprietăți, funcții).
1.3 Modificări în structura de bază a proteinelor și
interpretarea acestora.
1.4 Structura spațială a proteinelor. Descriere și
caracterizare.
1.5. Metode fizice simple de caracterizare a proteinelor
(spectroscopie de UV și de fluorescență).
1.1 Noțiuni fundamentale: Principalele concepte și
instrumente de lucru în proteomică: metodologie
analitică, baze de date.
 Ce este proteomica

• Proteomica este disciplina care se ocupă cu

studiul proteomilor.
• Proteomul este întregul set de proteine
exprimate de un genom, celulă, țesut sau
organism, într-un anumit interval de timp.
 Istoric

• Termenul de proteom a fost inventat Marc

Wilkins a în 1994, într-un simpozion care a avut
loc la Siena, în Italia.
• Wilkins a folosit termenul pentru a descrie
întregul complex al proteinelor ​exprimate de un
genom, celule, țesut sau organism.
• Prima referire într-un text apare în 1995, prin
publicarea tezei de doctorat a lui Wilkins.
 Este OMICA doar modă

•Proteomica și disciplinele înrudite fac parte din unul dintre cele mai
populare concepte din ultima vreme.

•OMICS devine o modă. Cotidiene de marca precum New York Times și

The Wall Street Journal au avut articole amuzante despre proliferarea
cuvintelor științifice care se încheie în OME, identificând mii.

•Conceptul pleacă de la botanistul Hans Winkler în 1920, când a propus

termenul "genom" pentru a se referi la un set de cromozomi (genele
dintr-un chromozom). Concepte similare ar fi biom (colecție de lucruri vii)
și rizom (sistem de rădăcini) - au aceeași vârstă, fiind bazate pe sufixul
grecesc -OM (OME) "având natura de, „de tipul”, „în ansamblul lor”.

Nature 494, 416–419 (2013)

Big biology: The ’omes
puzzle

Nature 494, 416–419 (2013)

 Big biology:
The ’omes
puzzle

Nature 494, 416–419 (2013)

 Transcriptomica
● Transcriptomica este studiul transcriptomului – un set complet de transcrieri
ARN, care sunt produse de către genom.
● Adecvate metodelor de high-throughput, folosind analiza microarray sau
next-gen.
● Compararea transcriptomului permite identificarea de gene care sunt
exprimate diferențiat în populațiile de celule distincte sau ca răspuns la
diferite tratamente.
● Pentru cantitate scăzută (pete de sange) se pot folosi metode de amplificare
● Sunt detectate doar gene si ARN exprimate la momentul eșantionării
● Bioinformatica - standarde limitate de prelucrare complexă a datelor și de
analiză (RNAseq), mai multe studii de benchmarking necesare folosind
datele de la consorții - cum ar fi eforturile (SEQC FDA). Soluții de stocare a
datelor și de acces la resurse computaționale.
 Analiza transcrierii genei - nivel
ARNm
Metodele bazate pe
hibridizare

Hibridizare
Macroarrays Microarrays Northern blots

Metode bazate pe PCR

ARNm ●Real time PCR
(Transcriptomica) ●qRT-PCR;

●RT-PCR

semicantitativ
DNA
Proteine
(Genome) (Proteomica)
Gena reporter

P
● gena T

●Transcriptional fusion of gene

promotor with reporter gene
 Fenomul (Phenome)
● Ceea ce lipseşte în era postgenomica
sunt descrieri amănunţite, exacte ale
fiecărei caracteristici fizice şi
comportamentale ale unei persoane.
● Aceste descrieri într-o formă adecvată
computerelor poate „vedea” modul în
care astfel de trăsături fenotipice s-ar
putea corela cu geonomica și
proteomica .
 Interactome
● Dogma centrală a biologiei moleculare
este, în esenţă, o lista de elemente.
● ADN → ARN, care codifică proteina.
● Asta s-ar putea traduce in trei "Omici”
de bază (a genomului, transcriptomului
și a proteomului), dar viața se
desfășoară doar pentru că aceste părți
lucrează împreună – Interactome
● Interactomul descrie toate aceste
interacțiuni moleculare.
 Viitorul tehnologiilor OMICS

Costul secvenţierii se reduce, tehnologiile devin mult mai

avansate și puternice, platformele se dezvoltă rapid – un atu
puternic pentru transcriptomică în omică integrată.
Proteomica, dezvoltarea în prima
decadă și după

Scott D. Patterson & Ruedi H. Aebersold, Proteomics: the first decade and beyond; Nature Genetics 33,
311 - 323 (2003)
Structura celulei eucariote

1. Nucleosol
2. Nucleu
3. Ribozom
4. Vezicule
5. Reticul endoplasmic rugos
6. Aparat Golgi
7. Citoschelet
8. Reticul endoplasmic neted
9. Mitocondrie
10. Vacuole
11. Citosol
12. Lizozom
13. Centriole
 Pași necesari analizei
proteomice
Omogenizare Solubilizare
● Suspensie celule, ● Solubilizare diferențială. Extracție
material, sediment ● Solubilizare completă. ● Spargere celule
● Resuspensie celule, ● Omogenizare celule
material, sediment

Sedimentare Purificare Analiza

● Depunere prin ● Cromatografie de ● Electroforeza pe gel
centrifugare sau afinitate ● Blotting
ultracentrifugare. ● Cromatografie de ● Spectrometrie de masa
● Sedimentare schimb ionic ● Metode biofizice
diferențială prin ● Cromatografie de
centrifugare sau excluziune
ultracentrifugare. moleculară.
 Electroforeza
● Ca instrument analitic, electroforeza este simplă,
rapidă și foarte sensibilă.
● Electroforeza este o metodă prin care se
analizează moleculele încărcate care se
deplasează în lichid sau gel.
● Este utilă în principal pentru separarea proteinelor
și acizilor nucleici.
● Viteza de migrare prin câmp electric depinde de
intensitatea câmpului, de sarcina netă, de
dimensiunea și forma moleculelor, de tăria ionică
și de vâscozitate.
 Metode de
electroforeză
Electroforeza în gel este
o metodă utilizată în
biochimie si biologie
moleculară pentru a
separa o populație mixtă
de fragmente de
proteine de lungime
diferita și pentru a
estima dimensiunea
fragmentelor, aceasta
separare depinzând de
încărcare și mărime, prin
aplicarea unui câmp
electric.
 2D PAGE
Electroforeza în gel de poliacrilamidă (PAGE)
este o metodă utilizată în biochimie si biologie
moleculară pentru a separa o populație mixtă de
fragmente polipeptidice. Acestea sunt separate
inițial după pI (încărcare) și apoi în prezență de
SDS după mărime.
Ca urmare separarea este bidimensională.
Metode cromatografice
de înaltă și ultraînalta
performanță.
Spectrometria
de masa
Experimentul tipic de
proteomică.
• În etapa 1, probele care
urmează să fie analizate sunt
izolate, iar lizatul de celule sau
țesuturi este fracționat cu
diverse metode biochimice.
• Ulterior, proteinele sunt
degradate enzimatic la
peptide pentru etapa 2, iar
apoi, in etapa 3, peptidele
sunt separate prin
cromatografie lichidă de înaltă
presiune și trimise unui sistem
de spectrometrie de masă.
• Rezultatul experimentului este
identificarea peptidelor și, prin
urmare, a proteinelor care
alcătuiesc proteomul.
 2D PAGE și cancer

Imagini de electroforeză pe gel de poliacrilamidă (2D-PAGE) ale celulelor epiteliale mamare normale și de carcinom ductal
in situ (DCIS), arătând expresia scăzută a transgelinei (săgeți) între țesutul normal și DCIS.
Imaginile imunohistochimice prin colorarea transgelinei în țesutul normal și DCIS confirmă tendința de expresie observată
în analiza 2D-PAGE.

Julia D. Wulfkuhle, Lance A. Liotta & Emanuel F. Petricoi,Proteomic applications for the early detection of cancer, Nature Reviews Cancer 3, 267-275 (April 2003)
 Spectrometria de masa
și cancer

● Spectrele MALDI MS ale unui ser de la persoane cu cancer

pulmonar și subiecții de control. În imagine este prezentată
intensitatea medie a spectrului la cazurile patologice (linia roșie)
și subiecți sănătoși (linia albastră).
● Săgețile indica valori m / z discriminatorii.
 Spectrometria de masa și
metabolismul proteic
• Proteinele sunt marcate metabolic
în timpul cultivării. Reactivii pot
conține, de asemenea, etichete
(tag-uri de afinitate), pentru a
permite izolarea selectivă a
peptidelor marcate după digestia
proteinelor.
• Fiecare peptidă generată de
reacția enzimatică efectuată în
apă grea este marcată la capătul
carboxiterminal.
• Diferența de masă dintre perechile
de peptide generate de marcarea
metabolică depinde de compoziția
de aminoacizi din peptide și este,
prin urmare, variabilă.

Mass spectrometry-based proteomics, Ruedi Aebersold and Matthias

Mann, Nature 422, 198-207(13 March 2003), doi:10.1038/nature01511
 Software proteomică
● Analize de secvențe de proteine și
identificarea lor.
● Analize de spectrometrie de masă și
electroforeza 2-D.
● Caracterizarea proteinelor și definirea
funcțiilor lor.
● Definirea de familii, modele și profile.
● Modificări post-transnaționale.
● Structura proteinelor.
● Interacțiunea proteină-proteină.
● Căutare similitudini / aliniere.
 Uniprot - EMBL
● Conține cea mai
cuprinzătoare gama de
baze de date de
proteomică, disponibile
gratuit, din lume.

● Este dezvoltata prin

efort mondial, iar
instrumentele acoperă
o gamă completă de la
biologie moleculara la
secvențe de nucleotide.
http://www.uniprot.org/
 Uniprot - EMBL

http://www.uniprot.org/
Swiss-Prot
 SWISS-2DPAGE
● SWISS-2DPAGE conține
date despre proteine
identificate pe diferite
hărți 2-D PAGE
SDS-PAGE.

● Permite localizarea de
proteine pe hărțile 2-D
sau afișează zona de pe
o hartă 2-D PAGE în
care ar putea să
găsească o proteină din
baza de date UniProtKB /
Swiss-Prot.
http://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/
 PRIDE
● PRoteomics
IDEntifications
database, este o baza
de date centralizată,
conformă cu
standardele, publică
pentru proteomică
făcând inclusiv analize
de modificări
post-translaționale și
pe baza datelor de
spectrometrie de masă.
http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/
 PRIDE

● PRIDE este un membru în consorțiul

ProteomeXchange (PX), care oferă un punct de lucru
unic pentru transmiterea datelor de proteomică bazate
pe spectrometrie de masa pe baza de depozitate în
domeniul public. Seturile de date sunt trimise la
PRIDE prin ProteomeXchange și sunt gestionate de
către experți biocuratori.
● PRIDE este gestionat de EMBL-EBI – Institutul
European de Bioinformatică
● EMBL-EBI conține și oferă informații primare pe baza
studiilor biomedicale, efectuează cercetări de bază în
biologie computațională și oferă un amplu program de
formare de utilizatori, pentru cercetătorii din mediul
academic și industrie.
1.2 Structura primară a proteinelor și proprietățile
acestora (compoziție, proprietăți, funcții).
 Proteine

● Proteinele sunt o categorie importantă de

macromolecule biologice.
● Proteinele sunt polimeri de aminoacizi. Acești
aminoacizi constituenții sunt în cele mai multe
cazuri 20 de L-amino acizi.
● Termenul de polipeptidă este folosit alternativ
pentru polimerul proteic în mod uzual la
secvențe sub 40 reziduuri.
 Aminoacid

● Aminoacizii (Acizii aminați)

sunt structuri chimice în
care, în general, de un
atom de carbon sunt
legate doua grupări (amino
și carboxil) caracteristice
întregii clase și un radical
care este specific fiecărui
tip de aminoacid.
 Nomenclatura chimică
a aminoacizilor
● Aminoacizii se
denumesc
Aminoacizi folosind
cuvântul
monoaminici„acid“,
și urmat
monocarboxilici -
de „amino“ și numele
Exemplu; acid
acidului
amino-aceticcorespunzător.
(glicina,
glicocol)
Prin prefixele „di“, „tri“
etc., se arată numărul
de grupe amino și
Aminoacizi monoaminici și dicarboxilici
carboxil.
Exemplu: acid α-aminoglutaric
(acid glutamic)
 Nomenclatura chimica
a aminoacizilor
Aminoacizi
hidroxilați
● Poziția relativă a două grupe Exemplu: acid α
amino β hidroxi
funcționale se precizează cu literele propanoic (serină)
grecești „α“, „β“, „γ“, „δ“, „ε“. în care Alternativ: Acid
2-amino-3- hidroxi
acidul este α dacă grupările amino propanoic
și carboxil se leagă de același
carbon, β dacă grupările amino și Aminoacizi
carboxil se leagă la atomi de carbon diaminici și
monocarboxilici
alăturați, iar, pe măsură ce crește Exemplu: acid α, ε
distanța, se vor numi γ, δ, ε. diamino-capronic
(lizină)
Alternativ: acid 2,6
diamino-capronic
 Nomenclatura chimica
a aminoacizilor
● În cazul compușilor
aromatici, se folosesc
prefixele „orto“, „meta“,
„para“ după poziția Exemplu;
substituentului . para-hidroxifenilalanina

● R
● orto

● meta

● para

Fenilalanina
 Caracterul chiral
● Caracterul levogir sau
dextrogir al unei
substanțe este legat
de rotația planului de
polarizare a luminii,
fenomen cunoscut sub
numele de chiralitate
● Două substanțe cu
structură chimica
identica dar cu
Front. Pharmacol., 22 November 2010 | doi: 10.3389/fphar.2010.00137
proprietăți chirale
diferite se numesc
enantiomeri.
 Caracter amfoteric

● Caracter de ion amfoteric

(amfolit, zwitterion) NH2 - caracter bazic
|
R-CH- COOH - caracter acid
● Ionii amfoterici sunt
structuri chimice care, în
cadrul aceleiași molecule,
conțin ambele tipuri de
sarcina.
 pH-ul și constanta de aciditate

● pH-ul reprezintă logaritmul (în baza 10) cu semn schimbat al

concentrației ionilor din soluție. Prin noțiunea de pH se exprimă
cantitativ aciditatea (sau bazicitatea) unei substanțe, pe baza
concentrației ionilor numiți hidroniu H3O+.
● Constanta de aciditate (Valoarea pKa) este o constantă care
arată în ce măsură o substanță este într-o stare de echilibru
reversibil cu schimb de protoni într-o soluție apoasă. pKa este o
constantă de echilibru, care exprimă tăria unui acid. Aceasta
este reprezentată ca valoare logaritmică negativă.
 Punctul Izoelectric (1)

● La valori ale pH-ului între cele două valori pKa, predomină

caracterul amfoteric, dar coexistă în echilibru dinamic cu
cantități mici de ioni negativi și pozitivi. Exact între cele
două valori pKa, sarcinile nete negative și pozitive sunt in
echilibru, astfel încât încărcarea totală este zero.
● Acest pH este cunoscut sub numele de punct izoelectric
pI, calculat ca pl = ½ (pKa1 + pKa2).
 Punctul Izoelectric (2)

● Aminoacizii au valori ușor diferite ale pKa, astfel încât au

puncte izoelectrice diferite. Pentru aminoacizi cu lanțuri
secundare ale catenei laterale, valoarea pKa este
hotărâtoare.
● Astfel, pentru Asp, Glu cu sarcini negative ale lanțurilor
secundare, pI = ½ (pKa1 + pKaR), pKaR fiind pKa catenei
laterale.
● Cisteina are, de asemenea potențial negativ al catenei
laterale cu pKaR = 8.14.
● Pentru Lys, Arg și cu sarcini pozitive ale lanțurilor
secundare, pI = ½ (pKaR + pKa2).
 Punctul Izoelectric (3)

● Aminoacizii au mobilitatea zero în electroforeză, adică nu

se deplasează, la un pH egal cu punctul lor izoelectric,
acest comportament, fiind de obicei, mai mult exploatat
pentru peptide si proteine decât pentru un singur
aminoacid.
● Aminoacizii au solubilitate minimă la punctul lor izoelectric
și ca urmare unii aminoacizi (în special, cu catene
secundare non-polare) pot fi izolați prin precipitare din apa
prin ajustarea pH-ului la punctul izoelectric cerut.
 Caracter amfipatic
● Termenul „hidrofob” ● Termenul amfipatic,
definește o substanță care amfifilic (amphi = de
„fuge” de apa ,care nu se ambele părți; pathos =
îmbibă de apă, care nu are afecțiune, philos = iubire).
afinitate pentru apă.
● Referitor la o substanța
care are afinitate pentru
● Termenul ”hidrofil” doi solvenți nemiscibili.
definește o substanță care Substanțele amfipatice
absoarbe apa, care se (sau amfifile, amfilofile) au
îmbibă ușor cu apă, care o extremitate polara (pol
are afinitate pentru apă, hidrofil) si una nepolară
sau este avid de apă. (pol hidrofob).
 Scări de
hidrofobicitate sau
index hidropatic
● In cadrul scării de
● Scări de hidrofobicitate hidrofobicitate, o valoare
sau index hidropatic sunt mai pozitivă indica
seturi de valori care aminoacizii mai hidrofobi.
definesc relativa afinitate
sau lipsa de afinitate
pentru apă (hidrofile sau ● In cadrul indexului
hidrofobe) a radicalilor hidropatic valoarea
(reziduurilor) de pozitivă indica hidrofilia, iar
aminoacizi. cea negativă hidrofobia.
 Scări de
hidrofobicitate sau
index hidropatic

Alan Majerník, Gerhard Gottschalk, and Rolf Daniel Screening of Environmental DNA Libraries for the
Presence of Genes Conferring Na+(Li+)/H+ Antiporter Activity on Escherichia coli: Characterization of
the Recovered Genes and the Corresponding Gene ProductsJ. Bacteriol. 2001;183:6645-6653.
 Aminoacizi încărcați

Încărcați pozitiv Încărcați negativ

Arginină Histidină Lizină Acid aspartic Acid glutamic

( R/ Arg) (H / His) ( K/ Lys) ( D/ Aps) ( E/ Glu)

pKa 2,03
pKa 2,15 pKa 1,95 pKa 2,16
pKa 2,03

pKa 9,00 pKa 9,16

pKa 9,09 pKa 9,66 pKa 9,58

pKa 3,71

pKa 4,15
pKa 6,04

pKa 10,67

pKa 12,10
 Aminoacizi neîncărcați și cu
proprietăți particulare
Aminoacizi neîncărcați Aminoacizi cu proprietăți particulare
Serina Treonina Asparagină Glutamină Cisteină Glicină Prolină
(S/ Ser) (T / Thr) (N/ Asn) (Q/ Gln) (C/ Cys) (G/ Gly) ( P/ Pro)

pKa 2,13 pKa 2,20 pKa 2,16 pKa 2,18

pKa 1,91 pKa 2,34
pKa 1,95

pKa 8,96
pKa 10,47
PKa 9,00

pKa 10,28
pKa 9,58
pKa 8,76
pKa 9,05

pKa 8,14
 Aminoacizi hidrofobi
Aminoacizi hidrofobi Aminoacizi hidrofobi aromatici

Alanina Valina Izoleucina Leucina Metionina Fenilalanina Tirozina Triptofan

( A/ Ala) (V / Val) ( I/ Ile) ( L/ Leu) ( M/ Met) (F / Phe) ( Y/ Tyr) ( W/ Trp)
pKa 2,38

pKa 2,16 pKa 2,18

pKa 2,18 pKa 2,24

pKa 2,27 pKa 2,26

pKa 9,34
pKa 2,33

pKa 9,04
pKa 9,09
pKa 9,08
pKa 9,60 pKa 9,58
pKa 9,52
pKa 9,71

pKa 10,10

pKa CRC Handbook of Chemistry, 2010

 Proprietățile
aminoacizilor (1)
Aminoacid 3-Litere 1-Litera Polaritatea Sarcina Indexul Lungimea
ε la λ
catenei catenei hidropatic de undă max
laterale laterale (pH pentru −3 −1
(x10 M
7.4) absorbanța −1
maximă cm )
λ (nm)
max
Alanină Ala A nepolară neutră 1.8

Arginină Arg R polară pozitivă −4.5

Asparagină Asn N polară neutră −3.5

Acid aspartic Asp D polară negativă −3.5

Cisteină Cys C nepolară neutră 2.5 250 0.3

Acid glutamic Glu E polară negativă −3.5

Glutamină Gln Q polară neutră −3.5

Gliicină Gly G nepolară neutră −0.4

Histidină His H polară Pozitivă 3.2 211 5.9

/neutră

Izoleucină Ile I nepolară neutră 4.5

 Proprietățile
aminoacizilor (2)
Aminoacid 3-Litere 1-Litera Polaritatea Sarcina Indexul Lungimea
ε la λ
catenei catenei hidropatic de undă max
laterale laterale (pH pentru −3 −1
(x10 M
7.4) absorbanța −1
maximă cm )
λ (nm)
max
Leucină Leu L nepolară neutră 3.8

Lizină Lys K polară pozitivă −3.9

Metionină Met M nepolară neutră 1.9

Fenilalnină Phe F nepolară neutră 2.8 257, 206, 0.2, 9.3, 60.0
188

Prolină Pro P nepolară neutră −1.6

Serină Ser S polară neutră −0.8

Treonină Thr T polară neutră −0.7

Triptofan Trp W nepolară neutră −0.9 280, 219 5.6, 47.0

Tirozină Tyr Y polară neutră −1.3 274, 222, 1.4, 8.0, 48.0
193

Valină Val V nepolară neutră 4.2

1.3 Modificări în structura de bază a proteinelor și
interpretarea acestora.
 Aminoacizi rari
Ornitina
● Termenul de aminoacizi rari se
referă în general la toți acei
aminoacizi care nu sunt
încorporați în proteine.
● Mulți dintre ei, ca ornitină sau
citrulină, sunt mai degrabă
intermediari comuni ai
metabolismului de bază.
Citrulina
● Sunt cunoscute peste 200 de
structuri diferite.
● O serie dintre aceste structuri se
pot regăsi în proteine cum ar fi
citrulina fiind identificate proteine
citrulinate.
 Derivați ai cisteinei

● Selenocisteina există in mod Selenocisteina

natural ca bloc de construcție al
selenoproteinlor. Este un analog
al cisteinei cu o grupă selenol
care conține seleniu în locul
grupării tiol (care conține sulf).

● Cistina este un dimer al cisteinei

oxidate care are funcții biologice:
o funcție redox prin gruparea tiol Cistina
(SH) și o legătură mecanică, care
permite proteinelor să-și păstreze
structura 3-dimensională.
 Aminoacizi rari

● L-Ornitina este produsa prin Ornitina

acțiunea arginazei pe L-arginină,
cu crearea de uree, cu rol în
preluarea aminelor și eliminarea
acestora. Ornitina este reciclata
fiind un fel de catalizator.

● Citrulina este produsă tot în ciclul Citrulina

ureei, ca produs secundar al
producției enzimatice de oxid
nitric din arginina.
 Aminoacizi rari
- ciclul ureei
(diagrama informativă

● 1 - L-ornitina
● 2 - carbamoil fosfat
● 3 - L-citrullina
● 4 - argininosuccinat
● 5 - fumarat
● 6 - L-arginina
● 7 - urea
● L-Asp - L-aspartat
● CPS-1 - carbamoil fosfat
sintetază I
● OTC - ornitin transcarbamilaza
● ASS - argininosuccinat
sintetază
● ASL - argininosuccinat liază
● ARG1 - arginaza 1
 Aminoacizi oxidati
Oxidant Ținta de reacție
● Sistemele biologice sunt HO • Toate reziduurile
expuse în mod continuu la RO • Cele mai multe reziduuri
oxidanți endogeni și ROO • Cys, Met, Trp, Tyr
exogeni, specii de radicali CO3- • Cys, Met, Tyr, Trp, His
liberi cu ambii radicali liberi. NO2 • Cys, radicalii Tyr / Trp
● În organism oxidarea este O2- • Superoxid dismutaza, unii ioni metalici de
rezultatul interacției lor tranziție, clustere Fe-S, radicali Tyr / Trp
externe cum ar fi radiații 1O2 Cys, Met, Trp, Tyr și His
ionizante (ultraviolet, HOCI / HOBr Cys, Met, cistină, gruparea amino His-α,
Lys, Trp
gamma, X și așa mai
Acidul Peroxinitrous Cis, Met, Tyr, Trp, selenocisteină
departe), dar și (ONOOH)
metabolismului intern.
● Radicalii liberi rezultati lumina UVB Trp, Tyr, cistină
acționează asupra
aminocizior din proteine aldehide reactive Cis, Arg, Lys,, gruparea amino His-α
rezultând modificări.
HOSCN Cis, selenocisteină
H2O2 Cis, selenocisteină
Biochem J. 2016 Apr 1; 473(Pt 7): 805–825.
 Aminoacizi oxidati
Amino acid Modifications by RONS Biological relevance

Leucine 3-Hydroxyleucine, 4-Hydroxyleucine, 10-fold increased levels of

5-Hydroxyleucine δ-hydroxyleucine in type IV cataractous
human lenses compared with normal
lenses
Histidine 2-Oxohistidine, Aspartate, Asparagine Age-dependent loss of histidine and
accumulation of 2-oxohistidine, loss of
histidine in ß-amyloid peptide
(connection to Alzheimer's disease)
Methionine Methionine sulfoxide, Methionine ß-amyloid peptide contains Met residue
sulfone at position 35 → Oxidation leads to
neurotoxicity, aggregation and free
radical/ROS formation (connection to
Alzheimer's disease)
Cysteine Disulfid(-S-S-)protein bonds, Thiyl eNOS uncoupling and eNOS protein
radicals radical formation resulting in
cardiovascular diseases
Phenylalanine Ortho-tyrosine, Meta-tyrosine, Parkinson's disease
Nitrophenylalanine
Tyrosin Dityrosine, DOPA, 3-Chlorotyrosine, 3-Nitrotyrosine: connection to
3-5- age-related muscle loss and
Dichlorotyrosine, 3-Bromotyrosine, 3-5- Alzheimer's disease, systemic lupus
Dibromotyrosine, 3-Nitrotyrosine erythematosus in general:
atherosclerosis, neurodegeneration,
cataracts
Tryptophan N-formylkynurenine, Kynurenine N-formylkynurenine, kynurenine:
Hydroxytryptophan, Nitrotryptophan cataract development
 Modificări ale
aminoaciziolor
Adăugarea de grupe hidrofobe pentru localizarea in
membrana celulară
● miristilarea, atașarea unei grupări miristat, un acid saturat
C14
● palmitoilarea, atașarea palmitatulului, un acid saturat C14
● izoprenilarea sau prenilarea, adăugarea unei grupări
isoprenoide
● glipidarea – adăugarea unei grupări ancoră
glicosilphosphatidyilinositol (GPI)
 Modificări ale
aminoaciziolor

Adăugarea de grupări chimice diverse.

● acilare, acetilare (la capătul N-terminal sau la lizină, formilare,
alchilare (de obicei la lizină sau arginină).
● glicozilarea - adăugarea unui grup glicozil la arginină,
asparagină, cisteină, hidroxilizină, serină, treonină, tirozină sau
triptofan rezultând o glicoproteină .
● polisialilalizarea, malonizarea, hidroxilarea (la prolină sau
lizină), iodarea (tiroglobulină )
● adăugarea de nucleotide cum ar fi ADP-ribozilarea
● fosforilare, adăugarea unei grupări fosfat, de obicei la serină,
treonină și tirozină (O - legat) sau histidină (N - legat)
● succinilarea - adăugarea unei grupări succinil la lizină
● sulfatare - adăugarea unui grup sulfat la o tirozină .
 Modificări ale
aminoaciziolor
Adăugarea de alte proteine sau peptide.
● Ubiquitinilarea – legarea covalentă de ubiquitină.
Modificarea chimică a aminoacizilor:
● citrulinarea sau deiminarea, conversia argininei la
citrulină
● deamidare, conversia glutaminei la acid glutamic sau
asparagina la acidul aspartic
● conversia la o alchenă prin beta-eliminare a
fosfotreoninei și fosfoserinei sau deshidratarea treoninei
ori serinei
● carbamilare N-terminală sau a catenei laterale la
grupările amino de la lizină și arginină.
 Modificări ale
aminoaciziolor
Modificări structurale:
● punți disulfurice - legarea covalentă a două cisteine
● clivaj proteolitic, scindarea unei proteine la o legătură
peptidică
● formarea isoaspartat, prin ciclizarea asparaginei sau
acidului aspartic
● Racemizare
●de prolină prin prolil izomeraza

●de serină prin serin epimerază

●de alanină și de metionină în organisme particulare.

1.4 Structura spațială a proteinelor. Descriere și
caracterizare.
 Structura proteinelor
● Structura primară se
referă la secvența de
aminoacizi liniară a
lanțului polipeptidic.
Structura primară
reprezintă înșiruirea
reziduurilor peptidice
înregistrate de la
capătul amino terminal
(N-terminal) până
capătul carboxil
terminal (C-terminal).
 Structura primară a
proteinelor
● Structura primară se
referă la secvența de
aminoacizi liniară a
lanțului polipeptidic.
Structura primară
reprezintă înșiruirea
reziduurilor peptidice
înregistrate de la
capătul amino terminal
(N-terminal) până
capătul carboxil
terminal (C-terminal).
 Legătura peptidică -
Reacția de condensare
● În timpul acestei reacții se formează legături noi
între atomi ce aparțin la molecule distincte,
numite legături peptidice. Rezultatul reacției
sunt peptidele.
 Coplanaritatea
legaturii peptidice
● Legăturile peptidice au o
a doua formă de
rezonanță
comportându-se ca o
legătura dublă.
● Ca urmare la legătura
peptidică (C = O și N-H),
toate sunt într-un singur
plan.
● Astfel, nu există rotație
liberă în jurul legăturii.
Orice rotație este
limitată făcând-se cu
aport energetic
 Coplanaritatea
legăturii peptidice

● Un lanț polipeptidic poate fi astfel imaginat ca o serie de plane rigide separate

prin grupări metilen substituite, -CH (R). Legăturile peptidice rigide limitează
numărul de conformații ale lanțului polipeptidic.
● Rotația este permisă doar în jurul legaturilor Cα. Prin convenție, unghiurile care
rezultă din rotații sunt marcate φ (phi) pentru N-Cα, legătura și ψ (psi) pentru
legătura Cα-C. φ și ψ au valoarea de 0 ° dacă cele două legături peptidice
conectate la un singur un atom de carbon sunt în același plan. In principiu, φ si
ψ poate avea orice valoare între -180 ° și + 180 °, dar mai multe valori ale lui φ
si ψ sunt interzise prin împiedicare sterică dintre atomii din catena polipeptidică
și catene laterale de aminoacizi.
 Coplanaritatea
legaturii peptidice
 Structura secundară a
proteinelor
● Structura secundară se referă la
zone locale cu geometrie relativ
riguroasă definite ca sub-structuri.
Există două tipuri principale de
structuri secundare, alfa helix și
beta pliată (beta-sheet) propuse în
1951 de către Linus Pauling.
 Structura secundară a
proteinelor

● Structura secundară
rezultă din limitarea
rotației planelor unele
față de altele.
● Unghiurile posibile sunt
calculate și evidențiate
prin diagrama
Ramachandran și sunt
([φ,ψ] plot), în 1963 de
G. N. Ramachandran.
 Structura secundară a
proteinelor
● Structura secundară
este stabilizată prin
legături de
hidrogen.

● Legăturile de
hidrogen au loc
între grupări
chimice polare
-C=O și N-H ale
legăturii peptidice.

● Exemplu α-keratina
care are o structură
regulată care se
repetă la fiecare
0,54 nm.
 Structura secundară a
proteinelor
● Structura secundară se referă la
zone locale cu geometrie relativ
riguroasă definite ca sub-structuri.
Există două tipuri principale de
structuri secundare, alfa helix și
beta pliată (beta-sheet) propuse în
1951 de către Linus Pauling.
 Structura terțiară a
proteinelor
● Structura terțiară se referă la structură tridimensională a unei
singure molecule a unei proteine. Structurile secundare alfa helix
și beta pliata sunt aranjate într-o structura globulară prin
„îngroparea” reziduurilor hidrofobe și stabilizarea prin punți
disulfurice .

http://bio1151b.nicerweb.com/
 Structura cuaternară a
proteinelor
● Structura cuaternară a proteinelor se bazează pe
asamblarea structurilor terțiare deja formate, în mod
uzual aparținând lanțurilor diferite al unei aceeași
proteine sau ale proteinelor diferite.
 Dimensiunea
proteinelor
● Clasificate în funcție
de dimensiunea lor
fizică, proteinele
sunt nanoparticule
(definiție: 1-100 nm).
1.5. Metode fizice simple de caracterizare a
proteinelor (spectroscopie de UV și de
fluorescență).
 Absorbția în UV a
proteinelor

● Proteinele din soluție absorb lumina ultravioletă, cu maxime de absorbție

la 280 și 200 nm. Aminoacizii cu inele aromatice au vârful de absorbție
la in regiunea 280 nm. Legăturile peptidice absorb la 220 nm.
 Absorbția în UV a
proteinelor
● Plecând de la absorbția la 280 se pot cuantifica proteinele. Exista o relație liniară între
absorbția in UV si concentrația proteinei.
● In acest mod pot fi dozate proteinele. Albumina bovina serica (BSA) este un exemplu.
 Fluorescența
triptofanului

● Aminoacizii prezintă și fenomenul de fluorescență. Acesta constă in emisia luminii la o

lungime de unda mai mare decât cea absorbită, datorită pierderilor de energie neradiativă
în mediu.
● Profilul în roșu reprezintă absorbția, iar cel albastru emisia.
 Fluorescența
triptofanului

● Pe acesta bază se poate estima cat de expus este triptofanul la mediu, el,
datorită comportării hidrofobe, preferând spatiile ce nu sunt in contact cu apa și
implicit gradul de denaturare a proteinei.

Dongping Zhong et al. PNAS 2002;99:13-18