Determinarea cromatografica a cafeinei din bauturi

racoritoare

Introducere

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC), este o metoda analiticǎ utilizatǎ

pentru separarea compușilor chimici dintr-un amestec, ȋn scopul determinǎrii cantitative a acestora.
Principiul separǎrii cromatografice constǎ ȋn distribuția speciilor prezente ȋntr-un amestec ȋntre douǎ
faze, faza mobilǎ constituitǎ dintr-un solvent sau un amestec de solventi şi faza staționarǎ solidǎ sau
lichidǎ.
Cafeina (C8H10N4O2) este un compus organic, prezent ȋntr-o mare varietate de produse
alimentare (folosit ca aditiv în produsele de consum), băuturi şi medicamente. Cafeina este una dintre
cele mai frecvent ingerate substanţe farmacologic active. Este o pulbere albă, fără miros, cu gust uşor
amărui, solubilă ȋn cloroform şi parţial solubilă ȋn apă şi etanol. Ingestia de cafeina ȋn cantitǎți mari
poate avea efecte adverse asupra sănătăţii umane, cu risc crescut asupra femeilor şi copiilor.
Riscurile consumului în cantităţi mari includ o toxicitate generală, efecte cardiovasculare,
descreşterea densităţii osoase şi a echilibrului calciului, provoacă modificări de comportament
(agitaţie, insomnii), incidenţa crescută a cancerului, precum şi pierderea fertilităţii la bărbaţi. Se
recomandă ca aportul zilnic de cafeină să fie limitat la 400 mg/kg corp pentru adulţii sănătoşi, 300
mg/kg corp pentru femeile la premenopauză şi 2,5 mg/kg corp pentru copii. Cantităţi >500-600
mg/zi provoacă nervozitate, anxietatate, insomnie.

Structura cafeinei
(1,3,7-trimethilxanthina)

Principiul metodei

Cafeina se determinǎ din eșantioane de mărci diferite de sucuri, prin cromatografie lichidă de
înaltă performanțǎ (HPLC), la o singură lungime de undă. Concentrațiile cafeinei ȋn bǎuturi
rǎcoritoare dulci sunt cuprinse de obicei ȋn intervalul 0 - 0,1 %, procente de masǎ. Aceastǎ metodǎ se
aplicǎ ca procedură standard pentru verificarea respectǎrii reglementǎrilor legale privind conținutul
de acid benzoic și cafeină ȋn bǎuturile rǎcoritoare, dar poate fi extinsǎ utilizând substanțe standard
adecvate, ȋn condiții asemǎnǎtoare de lucru şi pentru determinarea unor alți compuşi organici cu
potențial cancerigen ca: acetaldehida, butilparaben, lanolina și glutamat monosodic.

Aparatură şi materiale

Reactivi
- apă ultrapură HPLC,
- metanol de puritate cromatografică,
- acetonitril de puritate cromatografică,
- alcool izopropilic,
- cafeină, substanţa standard
- fosfat de sodiu,
- diverse băuturi răcoritoare

Condiţii de lucru:
- instrument: HP-1100 HPLC
- coloană: 4 X 125 ODS Hypersil 5 µm (C18 column)
- fazǎ mobilă: metanol/apă (80/20) % procente de volum
- debit: 0,7 mL/min
- regim de eluţie: Isocratic
- detector UV/VIS: citirile se fac la 270 nm;
- timp de analiză: 10 min
- volum de injectare: 10.0 µL
- soluţii standard de lucru:10 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 70 mg/L, 100 mg/L

Pre- coloanǎ
degazare pomp filtru
injector coloanǎ
ǎ

detecto
probǎ r
fazǎ
mobilǎ

Integrato deşeuri
r

Fig. 1. Schema bloc a cromatografului HP seria 1100 HPLC

Modul de lucru

Se prepară o fază mobilă cu un raport volumetric de 80/20: metanol/apă. Toate soluțiile se

preparǎ utilizând solvenți de puritate HPLC.
Se prepară o soluţie etalon stoc de 1000 mg/L cafeina, care este apoi este degazeificată şi
răcită la 1,8 °C. Din soluţia stoc se prepară diferite soluţii de lucru de concentraţii: 10, 30, 50, 80, 70
şi 100 mg/L.
Cafeina se determinǎ din eşantioane de băuturi răcoritoare diferite. Un volum de 5 mL din
fiecare probă de băuturǎ răcoritoare (Coca-Cola, Mountain Dew, Sprite şi Red Bull) se dilueazǎ la 10
mL cu amestecul de solventi utilizat ȋn prepararea fazei mobile metanol/apă. Toate probele vor fi
degazate la vid pentru ȋndepartarea dioxidului de carbon, apoi filtrate (prin hârtie de filtru cu
dimensiunea porilor de 22 m) pentru îndepărtarea impurităţilor.
 Prepararea soluţiilor standard

Din soluţia stoc se prepară soluţii standard ȋn baloane cotate de 10 mL cu concentraţii

cuprinse ȋntre 10 – 100 mg/L
Calculul concentrațiilor se face pe baza legii echivalenţei:

C1V1 = C2V2
C2 = C1V1/ V2
In prealabil coloana se clǎteşte cu solvent sau amestec de solvenți de lucru.
Condiţiile cromatografice de lucru sunt:
- presiunea ȋn coloana cromatograficǎ 4000 psi (1 psi = 0,07031 kg/cm2),
- debitul de fazǎ mobilǎ 1,5 mL/min,
- temperatura 25 0C. V
- volumul de probǎ este de 10 L.
Fiecare analizǎ se repetǎ de minim trei ori.
Proba de analizat este introdusă în bucla de injectare, în fluxul fazei mobile. Trecerea
analiţilor prin coloană este încetinită de prezenţa unor interacţii de natură chimică sau fizică ale
acestora cu fazele mobilǎ şi staţionară, datoritǎ cărora, analiţii parcurg coloana cu viteze diferite.
Timpul necesar parcurgerii coloanei cromatografice depinde de intensitatea interacțiilor, de structura
fiecǎrui analit şi de debitul de fazǎ mobilǎ stabilit ȋn metoda de lucru. Timpul necesar parcurgerii
coloanei cromatografice de cǎtre fiecare analit se numeşte timp de retenţie. Timpul de retenţie în
condiţiile de lucru ale metodei este considerat o caracteristică de identificare a analitului dat.
Cu ajutorul soluţiilor standard de lucru de concentraţii 10, 30, 50, 80, 70 şi 100 mg/L de
cafeină se vor realiza curbele de calibrare, determinându-se timpul de retenţie. Identificarea analiților
separați din coloana cromatograficǎ se face cu detectorul spectrofotometric, la lungime de undă de
270 nm, unde apare maximul de absorbtie al cafeinei. Relaţia dintre concentraţia şi aria picului
fiecǎrui component trebuie sǎ fie liniară cu un factor de regresie de 0,999.

Etapele de lucru:
- se degazează bautura răcoritoare
- ȋntr-un balon cotat de 10 mL se adaugă 5 mL bautură răcoritoare degazată ȋn prealabil şi se aduce
la semn cu apă ultrapură
- volume de 10 L din soluția astfel preparatǎ se filtrează pe filtre cu dimensiunea de pori de 0.45
µm şi se injectează ȋn aparat
- pentru trasarea curbei de calibrare se utilizează soluţii standard de cafeină preparate cu
concentraţii cuprinse ȋntre 10-100 mg/L, ȋnregistrându-se cromatogramele pentru soluţiile standard şi
integrandu-se picurile corespunzătoare cafeinei
- se trasează curba de calibrare
- se injectează proba de analizat pregatită ȋn prealabil
- se determină aria picului componentului de analizat din probă
- se interpolează valoarea ariei pe curba de calibrare
- se calculează rezultatul final ţinȃnd seama de diluţia efectuată

Prezentarea rezultatelor
3
 Se traseazǎ curbele de calibrare utilizȃnd soluţii de concentraţii 10, 30, 50, 80, 70
şi 100 mg/L pentru cafeină. Se determinǎ ariile peak-urilor din masuratorile efectuate pe
cromatogramele corespunzatoare cafeinei, la toate concentrațiile de soluții standard de lucru.

4.0x10 7

3.5x10 7

3.0x10 7

2.5x10 7

2.0x10 7
A re a

1.5x10 7

1.0x10 7

5.0x10 6

0.0

-5.0x10 6

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00

Fig. 3. Curba de calibrare pentru cafeină

Standard Denumire Conc. Raspuns Valoare %

peak standard calculata Deviatie
mg/L

Std 1 cafeina 10.000 3629817.257 9.736 -2.64

Std 2 cafeina 30.000 11012731.222 30.490 1.63

Std 3 cafeina 50.000 17819340.989 49.624 -0.75

Std 4 cafeina 70.000 25166049.723 70.277 0.40

 Std 5 cafeina 100.000 35694502.146 99.874 -0.13

Sa se completeze tabelul de mai jos cu datele rezultate din curba de calibrare.

Tabelul 1. Date rezultate din curba de calibrare

Concentraţi Aria Ecuaţia curbei de calibrare
e cafeină, mg/L
10
30 y = ………
50 R2 = ………….
RSD % = ……
70
100

Sa se calculeze concentratia cafeinei din bautura energizanta a carei cromatograma este

reprezentata mai jos.

Tabelul 2. Concentraţia de cafeină din băutura energizanta analizata

5
 Aria obţinută pentru picul cafeinei din proba de analizat se interpolează pe curba de calibrare
şi se obţine concentraţia acesteia din soluţia preparată ȋn balonul de 10 mL. Tinȃnd seama de diluţia
iniţială a probei se calculează rezultatul final exprimat ȋn mg cafeină continuţi ȋntr-un litru de băutură
răcoritoare.
Pentru o arie a picului cafeinei din proba de …… rezultă din curba de calibrare:
C = …………. mg/L
Rezultat final:
C = ……. mg/L

Aplicaţii

1. Pentru o arie a picului cafeinei din proba de 4683706 rezultă din curba de calibrare: c =
11,714 mg/L. Sa se calculeze concentratia cafeinei din proba de analizat, tinand cont de modul de
prelucrare al acesteia.
2. Calculați rezoluţia unei separări cromatografice, pentru care timpii de retenţie a doi
compuşi separaţi sunt tr1=3,5 min şi tr2=5,2 min, iar lăţimea picurilor la bază este w 1=0,5 min, iar
w2=0,7 min.
3. Să se calculeze retenţia relativă ȋntre doi compuşi ale căror volume de retenţie sunt 10 mL,
respectiv 12 mL, iar volumul mort al coloanei fiind de 2 mL.
4. Sa se verifice din datele din tabelul de mai jos, ecuatia dreptei de regresie si valoarea
obtinuta pentru concentratia cafeinei din proba analizata cromatografic,

Ccafeina, Aria Ecuatia curbei de calibrare

mg/L
10 4609210.50 y = 4.00 + 0.005x
R2 = 0.9996
30 11994739.80 RSD % = 8.0887
Pentru o arie a picului cafeinei din proba de 4683706:
50 17973901.79 C = 11.714 mg L-1
Rezultat final:
70 26415006.28
11.714x5/2 = 29.285 mg L-1
100 42030534.95
7