INTRODUCERE

Aditivii alimentari sunt substante adaugate intentionat in produsele alimentare pentru a

indeplini anumite functii tehnologice, de exemplu, pentru culoare, indulcire sau conservare. In
Uniunea Europeana (UE), Legislatia privind aditivii alimentari este reglementata de Directiva
Consiliului 89/107/CEE a Consiliului [1], si se bazeaza pe principiul ca aditivii pot fi utilizati
numai autorizat in fabricarea si prepararea produselor alimentare. Pot fi utilizati numai in cazul
in care tehnologia de fabricare necesita utilizarea lor, ei nu induc eroare consumatorului si nu
prezinta niciun pericol pentru sanatate.
Indulcitorii formeaza o categorie importanta de aditivi alimentari care sunt utilizati intr-o
gama tot mai larga de produse alimentare si bauturi. Sunt utilizati pentru a da un gust dulce
produselor alimentare. Directivele mentionate mai sus stipuleaza ca indulcitorii pot fi pusi la
vanzare ca atare sau pot si utilizati in productia de produse alimentare. Inainte de a primi
autorizare, indulcitorii sunt evaluati de catre Autoritatea Europeana pentru Siguranta Alimentara
(EFSA). Lista de indulcitori autorizati este revizuita in mod regulat de catre Comisia Europeana,
in conformitate cu avizul EFSA, care ia in considerare cele mai recente progrese stiintifice in
domeniu.
In prezent, sunt utilizati 8 indulcitori: acesulfam-K (ACS-K), aspartam (ASP), sare de
aspartam-acesulfam, ciclamat (CYC), zaharina (SAC), sucraloza (SCL), neohesperidina
dihidrocalcona (NHDC) si taumatina. Unele din ele sunt sintetice: ACS-K, ASP, sare de ASPACS, CYC, SAC, SCL sau semisintetice: NHDC, in timp ce taumatina apare in mod natural.
Avand in vedere discutiile controversate cu privire la efectele lor asupra sanatatii si
pentru a asigura punerea adecvata in aplicare a legislatiei existente pentru a garanta siguranta
consumatorilor, statele membre ale UE sunt obligate sa stabileasca sisteme de anchetare regulata
pentru a monitoriza consumul de indulcitori. Pentru a obtine aceasta informatie cantitativa,
metodele de analiza sunt necesare pentru a masura nivelul de indulcitori intr-o gama larga de
matrici alimnetare.

Determinarea indulcitorilor a determinat deja un mare interes. Cele mai multe metode au
fost dezvoltate pentru indulcitori individuali. Pentru a da un exemplu, metodele disponibile
pentru determinare SAC din produsele alimentare includ spectrometrie, puls-polarografie
diferentiala, sublimare, potentiometrie, cromatografie capilara electrocinetica micelara si
cromatografie lichida de inalta performanta (HPLC). Cateva lucrari au demonstrat utilitatea
electroforezei capilare pentru analiza indulcitorilor artificiali diferiti. Deoarece metodele
spectrometrice, gravimetrice sau electrochimice necesita un timp mai lung de lucru, metoda
HPLC in combinatie cu detectia UV este tot mai des aleasa pentru a determina indulcitorii
artificiali individuali cum ar fi SAC, ASP, ACS si NHDC. Lipsa cromoforului din SCL face ca
detectia prin absorbtie UV directa sa fie sensibila si dificila. Prin urmare, metoda analitica de
determinare implica fie determinarea indicelui de refractie (RI), fie absorbanta la o lungime de
unda de 200 nm care nu are specificitate. Alte metode, care au fost aplicate cu success, sunt
cromatografia de inalta performanta in strat subtire, cromatografia de inalta performanta de
schimb anionic cu detectie amperometrica sau electroforeza capilara indirecta cu absorbtie UV.
De asemenea, CYC nu se absoarbe in domeniul UV vizibil. Acest neajuns a fost rezolvat prin
utilizarea fotometriei indirecte UV, extractia de ioni pereche, derivatizare, detectia
conductivitatii.
In zilele noastre, indulcitorii artificiali nu sunt utilizati singuri, ci in combinatie. De aceea
este nevoie de metode sigure care sa poata acoperi cuantificarea acestora. Cu toate acestea au
fost descrise putine metode de cuantificare pentru determinarea simultana a mai multi indulcitori.
Astfel, determinarea simultana se face pentru ASP si ACS-K, SAC si ASP, SCA si SCL.
Separarea si determinarea celor 4 indulcitori: SAC, ASC-K, CYC si ASP se face prin
cromatografie lichida de inalta performanta cuplata cu detectia conductivitatii sau prin
cromatografie ionica.
Lucrarea de fata descrie dezvoltarea si validarea unor metode de determinare a
indulcitorilor printr-o metoda HPLC combinata cu un detector evaporativ cu mprtierea luminii
si prin cromatografie ionica, care indeplinesc cerintele pentru a controla limitele legale ale
indulcitorilor sintetici si semi-sintetici prevazute in legislatia actuala a UE.

I.

Metoda HPLC

1. Partea experimentala
1.1.

Substante chimice, reactivi si solutii standard

Reactivii analitici, acid formic si trietilamina, au fost obtinuti din Fluka (Germania), iar
metanolul si acetonea din Merck (Germania). Apa ultrapura cu o rezistivitate > 18M si cu
carbon organic total <5ngg-1 au fost obtinute de la un sistem MilliQ Plus 185.
Standardele individuale pentru fiecare indulcitor au fost obtinute din diferite surse.
Au mai fost utilizate si urmatoarele substante: benzoat de sodiu, cafeina, acid sorbic,
acid glutamic, acid fosforic, acid ascorbic, D (o)-sorbitol, acid malic, taurina, d(+)-glucuronolactona, chinina, hemi-sulfat de sare, acid citric monohidrat, zaharoza, fructoza, glucoza si
lactoza.
O solutie tampon cu pH 4,5 a fost pregatita prin dizolvarea a 4 ml de acid formic in 5 l
apa si ajustata la pH 4,5 cu cca. 12,5 ml trietilamina. Faza mobila A a HPLC a fost pregatita prin
amestecarea de 690 ml metanol cu 240 ml solutie tampon si 70 ml acetona, iar faza mobila B s-a
obtinut prin amestecarea a 110 ml metanol cu 820 ml solutie tampon si 70 ml acetona.
1.2.

Probele pentru testare

Probe de bauturi energizante (indulcite cu zahar), bauturi racoritoare cu acid (indulcite

cu zahar), bauturi racoritoare fara acid ( indulcite cu zahar), conserve din fructe (cocktailuri de
fructe si de pere indulcite cu zahar) si iaurturi naturale achizitionate de la magazine de vanzare
cu amanuntul. Inainte de utilizare, pentru fiecare proba a fost verificata absenta compusilor
interesati pentru a fi folosite ca probe martor, pentru prepararea solutiilor de calibrare si pentru
pregatirea de materiale de testare fortificate.
1.3.

Prepararea si calibrarea solutiilor

1.3.1. Standarde de calibrare in solutie tampon

Pentru cuantificarea in timpul procesului de dezvoltare si optimizare a metodei a fost

pregatita o solutie standard care contine toti cei noua indulcitori in solutia tampon. Concentratia
fiecarui indulcitor a fost de 500 g ml -1, cu exceptia DUL si NHDC care au avut o concentratie
de 100 g ml-1. O serie de 8 solutii de calibrare au fost preparate prin dilutia solutiei standard cu
solutie tampon rezultand concentratii intre 4-500 g ml-1 si de 0,8-100 g ml-1 pentru DUL si
NHDC.
Pentru cunatificare, la finalul etapei de validare, a fost preparata o solutie standard care
contine toti cei 9 indulcitori, respectand limita admisa de 125 % din MUD. Pentru indulcitorii
neautorizati (ALI, DUL si NEO) au fost preluate MUD fictive de la cca. 150 g ml -1. O serie de
8 solutii de calibrare au fost pregatite prin dilutia solutiei standard cu o solutie tampon care
rezulta in intervale de concentratii potrivite cu limitele date.
1.3.2. Solutia de calibrare a matricei
Solutia matrice standard a fost preparata folosind o bautura energizanta, un compot de
fructe si un iaurt natural. Inainte de utilizare bautura energizanta a fost tratata cu ultrasunete,
fructele din compot si iaurtul au fost omogenizate. O solutie stoc compusa din cei 9 indulcitori a
fost preparata prin cantarirea standardelor pure intr-un flacon de 100 ml, adaugandu-se cca. 50g
de proba omogenizata, continutul obtinut amestecandu-se timp de 6 ore. O serie de 8 solutii de
calibrare au fost preparate prin dilutia solutiei matrice standard cu probele de analizat, rezultand
concentratii de 12,5-2000 g g-1.
1.4.

Pregatirea materialelor de testare

1.4.1. Omogenizarea materialelor de testare

Toate buturile au fost tratate ntr-o baie cu ultrasunete timp de 15 min, unde fructele si
iaurturile au fost omogenizate folosind un blender alimentar si un Ultraturrax.
1.4.2. Fortificarea materialelor de testare
Pentru a compara fiecare tip de calibrare de la fiecare material testat s-au pregatit solutii
cu concentratii de cca. 2000, 400 si 80 g g-1. Testul de stabilitate a fost efectuat folosind un

material test cu o concentratie de cca. 250 g g-1. Toate acestea au fost pregatite in acelasi mod
ca la Sectiunea 1.3.2.
1.5.

Instrumente

Indulcitorii au fost separati folosind coloane analitice. Masuratorile cromatografice au

fost efectuate folosind un sistem HPLC format dintr-o pompa cuaternara, un autosampler si o
coloana termostatata compartimentata. Extractiile pe faza solida au fost efectuate sub vid.
1.6.

Metoda

1.6.1. Pregatirea probelor

Fiecare material de testat a fost tratat astfel: 5g de material de testat omogenizat a fost
cantarit intr-un balon cotat de 50 ml si apoi se completeaza pana la semn cu solutie tampon. Se
agita energic 5 minute, iar apoi continutul balonului este transferat intr-un tub de 50 ml si se
centrifugheaza la 4000 rpm timp de 10 min. Coloanele SPE vidate au fost conditionate cu 3 ml
metanol, apoi 3 portiuni a cate 2 ml solutie tampon si 2 portiuni a cate 5 ml supernatant. Pe
parcursul intregului proces s-a utilizat un debit de 1-2 ml/min. Dupa spalarea coloanei SPE cu 3
ml solutie tampon, indulcitorii au fost colectati prin elutie cu 2 ml etanol, intr-o eprubeta de 5 ml.
Metanolul colectat a fost evaporat la cca. 3,5 ml la temperatura ambientala folosind un curent de
azot si apoi se aduce la semn cu solutie tampon inainte de a se trece la analiza HPLC-ELSD.
1.6.2. Analiza HPLC-ELSD
Separarea HPLC a indulcitorilor a fost realizata cu ajutorul gradientului de profil cu un
debit de 0,5 ml/min al fazei mobile. Volumul de injectare a fost de 8 l, temperatura tubului a
fost de 85C, iar debitul de azot reglat la 2,5 l/min.
1.6.3. Identificarea si cuantificarea indulcitorilor
Identificarea fiecarui indulcitor din materialele test a fost facuta prin comparatia timpilor
de retentie a indulcitorilor observati in timpul analizei solutiilor standard analizate din acelasi lot
de probe, cu timpii de retentie a compusilor eluati in timpul analizei materialelor de testare.

Cuantificarea celor noua indulcitori a fost realizata prin analiza celor opt solutii de
calibrare standard, folosind conditiile HPLC identice cu cele utilizate pentru materialele de
testare. Determinarea cantitativa a indulcitorilor i din extractul din SPE (C 1i) a fost efectuat prin
conversie in zona de varf I (Ri) obtinut prin analiza extractului injectat in coloana SPE, utilizand
rezultatul functiei de calibrare. Fractia de masa a indulcitorilor i din materialul de testare a fost
calculata in conformitate cu ecuatia (1.).

Unde: C1i= fractia de masa a indulcitorilor i din extractul SPE g g -1 determinat folosind ecuatia
de calibrare stabilita.
C2i= fractia de masa a indulcitorilor i din materialul test g g-1
M1= masa materialului test luata pentru extractie, 5g
V1= volumul total al probei, 50 ml
V2= volumul de solutie de proba incarcat pe cartusul SPE, 10 ml
V3= volumul final al extractului SPE, 4 ml.
Experimentele sunt impartite in doua parti: optimizarea si validarea metodei.

2.1.
2.1.1.

Optimizarea
Separarea HPLC
Selectarea unei coloane analitice a fost prima etapa in dezvoltarea noii metode. In

studiul de fata a fost selectata o coloana complet inchisa la capate, oferind o separare in 25 de
minute a celor noua indulcitori alesi: ACS-K, ASP, CYC, NHDC, SAC, SCL, ALI, NEO si DUL
(Fig.1).

Fig. 1- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 11 indulcitori folosind Nucleodur C18 Pyramid
column.

In plus a fost posibil sa se separe alti doi indulcitori neautorizati, de exemplu,

stevioside si rebaudioside A. Cu toate acestea, din cauza probelor limitate, acesti doi compusi au
fost exclusi din experimente. Asa cum arata Fig.2, prin aplicarea acelorasi conditii
cromatografice, separarea indulcitorilor a fost eficienta indiferent de brand-ul coloanei.

Fig. 2- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 9 indulcitori folosind coloane diferite: (a)
Zorbax Extend-C18; (b) Nucleodur C18 Pyramid; (c) Nucleodur C8 Gravity; (d) Purospher Star
RP-18

In ceea ce priveste faza mobila si parametrii gradientului, trebuie luate in considerare

mai multe aspecte. Inainte de toate, ELSD este limitata pentru utilizarea sa in fazele mobile
volatile.
ELSD se bazeaza pe diferentele de volatilitate dintre solvent si proba. Principalul
avantaj al ELSD este ca se poate detecta orice analit fara a fi nevoie de cromofori sau fluorofori.
Singura conditie este ca analitul sa fie mai putin volatil ca faza mobila. In al doilea rand, pentru a
obtine timpi de retentie stabili, este aleasa o faza mobila tamponata, deoarece indulcitorii
formeaza molecule polare in faza mobila, frecvent utilizate in cromatografia lichida de faza
inversa, si gradul de ionizare al unei molecule afecteaza interactiunile sale cu faza de stationare.

In cele din urma, cea mai buna metoda de separare a tuturor celor 9 indulcitori a fost cea care
foloseste o solutie tampon apoasa compusa din acid formic si trietilamina (pH=4,5) si o faza
mobila formata dintr-un amestec de metanol si acetona.
2.1.2.

Detectia ELSD

Un rezultat bun a fost obtinut prin utilizarea unei temperaturi de 85C si un debit de azot
de 2,5 l/min.
2.1.3.

Prepararea probei prin extractie pe faza solida

Prepararea probelor cu succes, de exemplu, matricea de simplificare, au fost realizate prin

adsorbtia indulcitorilor pe cartuse SPE, iar desorbtia posibilelor interferente ale matricei a fost
posibila prin spalarea cu solutie tampon si prin impregnarea indulcitorilor cu metanol. Tipul
cartuselor SPE a fost ales pentru a se potrivi cu faza stationara a coloanelelor de separare HPLC.
Pentru a determina un amestec de 3 indulcitori cu un timp de retentie foarte scurt, se dizolva
amestecul in apa acidificata cu acid formic 0,1% sau in solutie tampon si apoi se foloseste vid
intr-un cartus SPE conditionat. Fiecare portiune de 5ml din cartus au fost colectate si analizate
prin HPLC. Cel mai mare volum de 30 ml a fost obtinut pentru a fi folosit ca solvent de spalare.
In cele din urma, cele mai bune rezultate au fost obtinute prin limitarea volumului probei din
cartus la 10 ml si volumul solventului de spalare la 3 ml.
2.1.4.

Calibrarea

In scopul alegerii tipului potrivit de calibrare, au fost efectuate mai multe experimente
pentru a respecta limitele legale din actuala legislatie a UE.
Ca un exemplu, functia de calibrare a SCL este data in Fig. 3a.

Prin urmare, cuantificarea a fost efectuata cu ajutorul conversiei logaritmice in baza10

atat pentru concentratie cat si pentru aria peak-urilor. Desi aceasta este o metoda comuna de
liniarizare, s-a constatat ca pentru majoritatea indulcitorilor raspunsul de transformare nu a fost
complet linear pe un interval de lucru de 12,5-2000 g g-1 (Fig. 3b).

Chiar daca coeficientii de corelatie liniara R au fost in cea mai mare parte > 0,98,
distribuirea reziduurilor (Fig. 3c), a indicat ca modelul nu este adecvat.

Raspunsul primit de ELSD a fost cel mai bine descris printr-o ecuatie polinomiala de
gradul 3 (Fig. 3d).

Urmatorul pas a fost de a compara rezultatele obtinute de trei materialele test fortificate
cu niveluri diferite de indulcitori, cuantificate prin utilizarea matricei de calibrare sau etalonare
obtinuta prin standardele dizolvate in solutie tampon. In cele mai multe cazuri, rezultatele
obtinute pe baza solutiilor tampon de calibrare au fost mai aproape de valoarea reala decat cele
calculate cu ajutorul curbelor de calibrare. Numai in cazul NHDC din iaurt, matricea de calibrare
a dat rezultate relative mai bune, care ar putea fi din cauza degradarii mai rapide a indulcitorului
in iaurt.
Scopul final al studiului a fost de a oferi metodologie adecvata pentru a fi utilizata de
catre laboratoarele particulare sau de agentii pentru a pune in aplicare limitele legislative. Prin
urmare, intreaga abordare a fost in cele din urma adaptata pentru a se potrivi cu limitele legale
prevazute. Nivelul superior al gamei de lucru a fost limitat la cca. 125 % din MUD pentru
indulcitorii autorizati. Niveluri de concentratie mai mica au fost stabilite cu ajutorul LOQ

determinate. O comparatie a abaterilor standard ale reziduurilor obtinute prin ecuatii polinomiale
si liniare nu au aratat diferente semnificative intre cele doua modele de calibrare pentru toti cei 9
indulcitori.
2.2.

Validarea metodei
Metoda de validare este una dintre masurile universal recunoscute ca fiind o parte

necesara a unui sistem global de asigurare a calitatii in chimia analitica. Validarea metodei de
analiza poate fi considerata ca fiind un proces sistematic de verificare daca o metoda de analiza
este acceptata pentru scopul destinat. Validarea prezentata examineaza parametrii de selectivitate,
limita de detectie, limita de cuantificare, precizia si exactitatea metodei folosite pentru cei noua
indulcitori.
2.2.1.

Selectivitatea

Selectivitatea reprezinta capacitatea metodei de a determina cu exactitate analitul de

interes, in prezenta altor componente care pot fi prezente in aceeasi proba. S-a stabilit prin
compararea rezultatelor obtinute pe o solutie standard de indulcitori care continea 16 substante
diferite intalnite in produse alimentare. Au fost testate urmatoarele substante: benzoat de sodiu,
acid sorbic, acid citric, acid fosforic, acid malic, acid ascorbic, acid glutamic, zaharoza, glucoza,
fructoza, lactoza, cafeina, chinina, taurina, D(+)-glucurono-lactona si sorbitol. Singura pereche
de compusi care a intampinat probleme a fost ALI-CHI. Mai mult, selectivitatea metodei a fost
investigata prin analizarea tuturor probelor martor, materialelor test cum ar fi: bauturi
energizante, bauturi carbogazoase, bauturi racoritoare fara acid, conserve din fructe si iaurturi
natural. Niciunul din materialele test nu a prezentat alte component care ar fi putut interfera cu
analitii de interes.
2.2.2.

Domeniul de lucru

Intreaga abordare a fost efectuata intr-un interval de lucru de 25 g g -1 la 125% din

MUD-uri pentru indulcitorii autorizati si 125% din 150 g g-1 pentru indulcitorii neautorizati.

2.2.3.

Limita de detectie si de cuantificare

Probele martor au fost utilizate pentru a determina nivelul mediu al timpului de retentie a
analitilor de interes si matricea potrivita pentru solutiile de calibrare pentru a estima limita de
detectie (LOD) si limita de cuantificare (LOQ).
LOD au fost determinate de reducerea succesiva a volumului de solutii de calibrare
injectate ce contin cele mai mici concentratii de indulcitori. Volumul de injectare care a dat un
semnal zgomotos de trei ori a fost utilizat pentru a estima LOD.
LOQ pentru fiecare indulcitor a fost stabilita in functie de concentratia care a dat
semnalul sonor. LOD si LOQ sunt prezentate in Tabelul 3.

2.2.4.

Precizia si autenticitatea metodei

Pentru a se respecta autenticitatea metodei in ceea ce priveste concentratia,

repetabilitatea, exprimate prin deviatia relativa standard a repetabilitatii, au fost efectuate aceste
etape pe 6 probe pentru trei matrici alimentare diferite, fortificate cu toti cei noua indulcitori la 4
niveluri diferite de concentratie.

II. Metoda IC

1. Partea experimentala
1.1.

Reactivi

Aspartam, ciclamat de sodiu, acesulfam-K, zaharina de sodica, au fost achizitionate de la

Sigma (St. Louis, MO, USA). Ceilalti reactivi au fost printre cei cu reactivitate de nivel ridicat
sau puritate. Apa distilata deionizata de 18.3 M cm a fost utilizata pe tot parcursul. Solutiile din
stoc au fost pregatite separat prin dizolvarea unor cantitati potrivite din aceste componente in apa
deionizata.
1.2.

Instrumentatie

Un model Dionex ICS-2000 ion cromatograf echipat cu o capacitate de stocare a 25 l

proba. Un Dionex Ionpac AG11 cu coloana (50 mm x 2 mm i.d.) si un Dionex Ionpac AS11 cu
coloana de separare (250 mm x 2 mm i.d.) au fost utilizate pe parcurs. Eluentul a fost obtinut
printr-un generator de eluent cu KOH.
Suprimarea a fost realizata de catre un Dionex ASRS UL TRAII (2mm) cu supresor autoregenerativ (modelul de reciclare). Temperatura coloanei a fost de 30 C si curentul electric de
lucru a fost de 40 mA. Debitul eluentului este de 25 ml/min. Toate instrumentele de control si
colectarea de date au fost realizate de catre un Dionex Chromeleon 6.5. Volumul de injectie este
de 25 l.
1.3.

Pregatirea probelor reale

Toate probele, inclusive doua bauturi cola acidulate (proba A si proba B), o bautura de
fructe (proba C) o conserva de fructe (proba D), au fost procurate de la piata locala. Acestea au
fost pretratate prin proceduri relevante dupa cum urmeaza, solutiile finale fiind filtrate printr-un
filtru Nylon inainte de analiza.
1.3.1.

Bauturile cola acidulate

Cele doua bauturi cola acidulate au fost decarbogazificate pentru 5 min intr-o baie
ultrasonica inainte de a fi diluate in apa. Un volum de 1 ml de bautura cola (A si B) au fost
diluate direct in apa deionizata intr-un balon de 50 ml.

1.3.2. Sucul de fructe

Un volum de 1 ml de suc de fructe (C) a fost diluat direct in apa deionizata intr-un balon
de 100 ml.
1.3.3.

Conserva de fructe

Un total de cca. 5 g de fruct conservat (D) a fost cantarit ai apoi taiat in bucati apoi
introdus intr-un balon de 50 ml, a fost adaugata apa 30 ml, balonul a fost tratat cu ultrasunete,
apoi solutia a fost diluata pana la 50 ml. 1 ml din solutia diluata obtinuata prin procesul anterior a
mai fost diluata in apa deionizata pana la 100 ml.
2. Rezultate si comentarii
2.1.

Conditii de separare

In aspartam se gaseste fenilalanina, deci trebuie sa utilizam un program gradient pentru a

separa fenilalanina din aspartam.
Principiul de alegere a concentratiei este acela de a imbunatati separarea la fel si pentru
scurtarea timpului de analiza. Utilizand programul gradient, fenilalanina poate fi bine separata de
aspartam, si alti trei indulcitori pot fi separati, rezolutia avand varfuri de: 3.02, 5.85, 13.42 si
3.91, iar timpul de analiza este de asemeni scurt. Tabelul 1 arata valorile programului gradient.

Tabelul 1 - Conditii de separare ale gradientului

2.2.

Interfata experimentului

In general, unii anioni anorganici cum ar fi Cl, NO3, SO4 2, PO43, anumiti acizi
organici cum ar fi formiat, acetat si unii acizi organici cum ar fi benzoatul, citratul sunt in mod
natural conservati sau adaugati intentionat in bauturi racoritoare, care probabil interfereaza
detectarea celor patru indulcitori.

In conditiile experimentului, cei mai comuni sapte anioni organici F, Cl, NO 3, NO2,
Br, SO42, PO43 si cativa acizi organici incluzand formiat, acetat, benzoat, si citrat, nu au
interferat cu detectarea celor patru indulcitori.
Timpul de retentie a F, Cl, NO3, NO2, Br, SO42 si PO43 a fost: 2.477, 3.756,
4.003, 4.860, 6.147, 6.520 si 8.850 min, respectiv timpul de retentie pentru formiat, acetat,
benzoat, si citrat au fost 2.847, 2.627, 5.603 si 3.687 min.
In comparatie, timpul de retentie a aspartamului, ciclamatului de sodiu, acesulfam-K,
zaharinei sodice au fost 3.583, 4.412, 8.597 si 10.460 min.

2.3.

Liniaritate, precizie si limite de detectie

In conditiile optime ale experimentului, toti analitii au aratat buna relatie liniara,
sensibilitate si reproductibilitate. Repetand de zece ori, deviatiile relative standard (RSD) a
timpului de retentie, aria peak-urilor, inaltimile peak-urilor sunt aratate in Tabelul 2.

Tabelul 2- Liniaritatea si detectia limitelor a 4 indulcitori (Y1 ecuatia inaltimii, Y2 ecuatia

ariei)

Si in acest mod, corelarea coeficientilor de inaltime pentru aspartam, ciclamatului de

sodiu, acesulfam-K, zaharinei sodice au fost 0.9992, 0.9997, 0.9990 si 0.9994, corelarea
coeficientilor de zona au fost 0.9996, 0.9998, 1 si 0.9998 respectiv. Limitele de detectie pentru
aspartam, ciclamat de sodiu, acesulfam-K si zaharina sodica au fost 0.87, 0.032, 0.019 si 0.045
mg/l. In comparatie cu ADI a celor patru indulcitori, limitele de detectie sunt mult mai joase.
Tabelul 2 arata liniaritatea si limitele de detectie a celor patru indulcitori. Figura 1 arata
cromatograma solutiilor standard. Dintre valorile RSD si limitele de detectie putem deduce ca
detectarea conductibilitatii supresoare este eficace simultan si separat si detecteaza cei patru
indulcitori. De asemeni putem spune ca este o metoda foarte sensibila pentru detectare pentru cei
patru indulcitori datorita limitelor foarte joase de detectare a celor patru.

Figura 1. Cromatograma solutiilor standard: (1) fenilalanina; (2) aspartam (20 mg/L); (3)
ciclamat de sodiu (5 mg/L); (4) acesulfam-K (5 mg/L); (5) zaharina sodica (10mg/L)
3.4.

Analiza probelor reale

Toate probele au fost analizate conform conditiilor experimentului. Figurile 2-4 arata
cromatograma probelor. Tabelul 3 arata rezultatele tuturor probelor. Tabelul 4 arata datele de
recuperare a probelor reale. Datele au fost obtinute din matricile testate cu analitii de interes.

Figura 2. Cromatograma bauturii cola B: (1) aspartam; (2) ciclamat de sodiu; (3) acesulfam-K;
(4) zaharina sodica.

Figura 3. Cromatograma sucului de fructe: (1) aspartam.

Figura 4. Cromatograma cromatogramei a bauturii cola A: (1) aspartam; (2) ciclamat de sodiu;
(3) acesulfam-K; (4) zaharina sodica.

Tabelul 3- Rezultatele analitice si datele obtinute pentru indulcitorii din probe

Tabelul 4- Datele de recuperare a indulcitorilor din probe

CONCLUZII
Avand in vedere practica din zilele noastre de a folosi indulcitori in combinatie, este
nevoie de metode de incredere care sa poate recunoaste cat mai mult indulcitorii. O metoda
simpla si rapida este analiza prin HPLC-ELSD deoarece permite separarea si cuantificarea
simultana a noua indulcitori din produse alimentare diferite. Pentru a se asigura validarea
metodei toate etapele s-au desfasurat intr-un singur laborator. Liniaritatea metodei, autenticitatea,
precizia, selectivitatea, au fost evaluate impreuna cu limitele de detectie si de cuantificare intr-o
serie de experimente.
Exactitatea metodei a fost satisfacatoare avand recuperarile variind intre 93-109% pentru
nivelurile de concentratie in jurul MUD-urilor autorizate pentru indulcitorii acceptati de
legislatie si 100-112% pentru compusii neautorizati (ALI, NEO, DUL). Metoda aceasta ofera
informatii privind conformitatea etichetelor cu dispozitiile generale stabilite de lege. Este o cale
potrivita de a examina rapid un numar mare de probe ce contin 6 indulcitori autorizati si 3
neautorizati.
A fost dezvoltata cromatografia de inalta performanta de schimb ionic cuplata cu eluentul
generator KOH si detectarea conductibilitatii supresive pentru separarea simultana si detectarea
celor patru indulcitori. In cadrul acestei metode, poate fi obtinuta in mod imbunatatit, o foarte
joasa conductibilitate si sensibilitate a indulcitorilor si este de asemeni o noua si foarte sensibila
analiza pentru determinarea simultana a celor patru indulcitori din probe reale, detectarea are
limite joase: 1 ppm pentru aspartam, 0.05 ppm pentru ciclamatul de sodiu, acesulfam-K si pentru
zaharina sodica. Rezultatele probelor reale analizate sunt satisfacatoare.

BIBLIOGRAFIE

1. Yan Zhu, Yingying Guo, Mingli Ye, Frits S. James Journal of

Chromatography A, 1085, pag. 143-146, 2005
2. Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber
Journal of Chromatography A, 1157, pag. 187-196, 2007