Universitatea Tehnic Gheorghe Asachi din Iai

Facultatea de Inginerie Chimic i Protecia Mediului

Departamentul de Inginerie Organic, Biochimic i Alimentar
Specializarea Controlul i Procesarea Alimentelor

Proiect MCTM

Coordonator tiinific:
Prof. dr. ing. Teodor Mluan

Student:
Digori Gheorghe

Iai
2015

Tem: Determinarea ndulcitorilor artificiali

din buturile rcoritoare prin metoda HPLC

Cuprins
I. INTRODUCERE..........................................................................................................................4
1.1 Cromatografia lichid de performan nalt cu faz invers................................................6
1.2. Etapele analizei cromatografice............................................................................................8
II. Determinarea ndulcitorilor din buturile rcoritoare prin metoda HPLC..................................9
2.1 ndulcitorii..............................................................................................................................9
2.2 Metoda HPLC......................................................................................................................11
2.2.4

Instrumente.............................................................................................................13

2.2.5

Pregtirea probelor..................................................................................................13

2.2.6

Analiz HPLC-ELSD..............................................................................................13

2.2.7

Identificarea i cuantificarea ndulcitorilor.............................................................14

2.2.8

Optimizarea..............................................................................................................15

2.2.9

Validarea metodei.................................................................................................20

CONCLUZII..................................................................................................................................22
BIBLIOGRAFIE............................................................................................................................23

I. INTRODUCERE
Cromatografia este o metod fizico-chimic modern, considerat nu doar o metod de
separare; n majoritatea variantelor ea prezint o metod analitic hibrid, care mbin separarea
cu identificarea ulterioar i dozarea componenilor depistai n amestecurile complexe.
Conform aprecierii experilor, cromatografia se consider una din cele 20 descoperiri
importante ale secolului XX, care au contribuit cel mai mult la reformarea tiinei, iar prin
prisma ei se determin nivelul de dezvoltare al industriei i tehnicii, civilizaiei n ntregime.
Totodat, prezint o ramur a analizei instrumentale cu un larg spectru aplicativ n majoritatea
domeniilor i nici o metod analitic nu concureaz cu cea cromatografic, la momentul dat,
dup aplicarea universal i eficacitatea separrii celor mai compuse amestecuri.
Primele descrieri ale procesului de separare sunt ntlnite n lucrrile chimistului german
Runge de prin anul 1850 i ale altor savani, dar n fine ei n-au reuit s formeze o disciplin
tiinific . Fondatorul metodei cromatografice se consider Mihail vet, botanic i chimist rus,
datat cu anul 1903, care a efectuat primele ncercri de separare n domeniul coloranilor vegetali
pe o coloan de oxid de aluminiu. n multe surse literare se ntlnete anul 1906, unde pentru
prima dat n articolul autorului M. vet apare termenul cromatografie, n care se dezvluie
conceptul experien cromatografic . Etap important n cercetare, n 1938, a devenit
descrierea cromatografiei pe strat subire de savanii N. A. Izmailov i M. S. Shraiber, metod
care astzi are o rspndire universal, datorit unui cost redus, a vitezei mari de eluare i a
rezoluiei bune.
Bazndu-se pe fenomenul deja cunoscut, descris n lucrrile lui M. vet, i aplicndu-l n
cazul aminoacizilor, n 1941 savanii englezi A. D. Martin i R. Synge au elaborat metoda
cromatografic de repartiie, pentru care n 1952 au fost decernai cu premiul Nobel. n timpul
cercetrilor, aceiai savani i colegii lor Consden, Gordon au depistat c n afar de silicagel, apa
este reinut i de celuloz. Astfel n 1944 a fost elaborat o nou metod cromatografic pe
hrtie, utilizndu-se ca sorbent al fazei staionare hrtia de filtru.
Un mare succes al savantului Martin n colaborare cu E. T. James a urmat de asemenea n
anul 1952 cu punerea bazelor cromatografiei de gaze (GC), apoi n 1959 savantul Golay a
introdus noiunea cromatografia de gaze pe coloane capilare. Metoda dat este larg rspndit i
pn n prezent.

n timp cromatografia de lichide s-a dezvoltat datorit perfecionrii detectorilor,

pompelor i ca rezultat s-au construit cromatografe de lichide de performan nalt (HPLC). Cu
apariia metodei HPLC (an. 1968) autorii Giddings i Kirkland au propus utilizarea unor faze
staionare cu particule foarte mici, cu trecerea fazei mobile sub presiune.
Un aport colosal la dezvoltarea cromatografiei au depus i savanii A. V. Kiseliov, A. A.
Jucovski, C. I. Sacadnscki, destini cu medalia internaional M. vet Pentru descoperirile
distinse n domeniul cromatografiei i muli ali specialiti n acest domeniu.
Cromatografia ca metod de separare se ncadreaz n grupul de procedee bazate pe
migrarea difereniat a componenilor din amestecul studiat dintre dou faze, adic migrare
difereniat a diferitor molecule. Ea cerceteaz starea termodinamic a sistemelor dintre dou
faze, studiaz natura interaciunii intramoleculare, cinetica proceselor interne i schimbului de
mas ntre faze, proceselor formatoare de compleci, asociaii i multe altele.
Datorit complexitii proceselor de separare, subnelegerii deosebit de multilaterale a
termenului cromatografie este dificil formularea unei definiii generale. ns se poate spune
c toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o faz staionar i o faz mobil,
iar componenii amestecului de analizat sunt antrenai n lungul coloanei de un flux de faz
mobil (gazoase sau lichide), cu viteze diferite, ceea ce constituie principiul fundamental al
separrii. Pe de alt parte, la baza majoritii metodelor cromatografice de separare stau patru
procese fundamentale: adsorbia pe suporturi solide, repartiia ntre faza staionar i aceea
mobil, schimbul ionic i de excluziune. Astfel, principiul separrii poate fi diferit, dar etapele
analizei cromatografice sunt aceleai. Lund n consideraie cele expuse, totodat i numeroii
factori implicai n separare, n asigurarea selectivitii i rezoluiei, precum i caracteristicile
detectorilor utilizai, respectiv de sensibilitatea lor, reproductibilitatea proceselor de separare,
detecie i dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinztoare. De aceea cromatografia se
poate clasifica:
-avnd n vedere natura fazelor staionar i a celei mobile (n faz gazoas, lichid i
faz supercritic);
-n funcie de procesele fizico-chimice care stau la baza separrii (cromatografie de
adsorbie, de repartiie, de schimb ionic, de excluziune, cu formare de perechi de ioni, de
afinitate);

-n funcie de modalitatea de imobilizare a fazei staionare (cromatografie pe coloan i

planar);
-n funcie de starea fizic a celor dou faze (cromatografie gaz-lichid, gaz-solid, lichidlichid, lichid-solid)
Poziia privilegiat a cromatografiei se datoreaz faptului c la baza migrrii se gsete
repetarea echilibrului de repartiie dintre dou faze (staionar i mobil), care pentru un singur
proces se poate realiza extrem de rapid, de repetate ori ntr-un interval de timp scurt.

1.1 Cromatografia lichid de performan nalt cu faz invers.

n anii 70-80 ai secolului XX s-a accelerat dezvoltarea unei noi direcii a cromatografiei
HPLC cu faz invers.
Sensibilitatea nalt, precizia i selectivitatea metodei i-a dat o prioritate considerabil n
studiu farmacocinetic pentru un numr mare de substane medicamentoase, iar rapiditatea
analizei permite efectuarea n instituiile medicale att a investigrilor clinice imense ct i a
analizelor expres i eficace n cazul diagnosticrii urgente sau dozrii preparatului.
O alt cauz este i preponderena metodei HPLC fa de alte metode fizicochimice,
inclusiv i fa de unele metode cromatografice, i anume: domeniul de aplicare s-a majorat cu
dozarea compuilor volatili, uor oxidabili, termolabili fr aplicarea metodelor speciale;
metoda HPLC cu faz invers permite analiza mostrelor apoase, simplificnd prepararea
probelor de material biologic i reducnd timpul unei analize; majoritatea variantelor de
detecie n metoda HPLC nu distrug probele.
Astfel, n caz de necesitate, permite cooperarea cromatografiei cu scop analitic
(separarea, detecia, determinarea cantitativ) i cea cu scop preparativ, totodat este posibil
colectarea fraciilor separate a substanelor analizate pentru identificarea ulterioar i/sau
utilizarea altor metode fizico-chimice de analiz;
n majoritatea cazurilor se exclude necesitatea de a efectua derivatizarea;
metoda HPLC poate fi automatizat complet;
solvenii organici (acetonitrilul, metanolul, parial tetrahidrofuranul) i apa utilizai n
faza mobil permit detecia n UV-VIS ntr-un diapazon larg. Totodat aceti solveni sau

amestecurile lor dizolv practic toate grupele de compui aflai n organismul uman, n materialul
biologic i utilizai ca preparate medicamentoase . a.;
sorbenii utilizai n HPLC cu faz invers se echilibreaz foarte repede cu noii solveni,
ce permit de a realiza uor cromatografia n gradient i a trece de la o metod la alta;
sorbenii le acord posibilitatea de a utiliza solveni cu proprieti ntr-un interval mai
larg, la fel de a aduga diferite tipuri de modificatori (sruri, acizi, baze, reactivi perechi de ioni,
. a.).
Metoda dat ca i orice metod analitic posed i unele dezavantaje:
metodele de detecie existente, uneori, nu posed o suficient sensibilitate necesar
pentru determinarea concentraiile joase a analiilor, ndeosebi n analiza farmacocinetic;
metoda HPLC necesit utilizarea cantitilor mari de solveni organici de o puritate
nalt, care n majoritate sunt destul de costisitori i toxici, n plus regenerarea acestora este
dificil;
utilajul cromatografic, piesele de schimb, coloanele cromatografice, accesorii,
aparatura specific pentru umplerea coloanelor cu sorbeni sunt destul de costisitori, totodat
complicai n deservire;
caracteristica reteniei i selectivitii sorbenilor cu faze inverse se schimb nu numai
trecnd de la o firm la alta, dar i de la serie la serie a unui productor.
Metoda HPLC presupune separarea componenilor de analizat n fluxul fazei mobile
(eluent, ce-i caracterizat de compoziie, fora ionic, pH i ali parametri) n baza diferitor
interaciuni cu sorbenii.
Complicarea mecanismului de separare i majorarea numrului de parametri variabili ai
procesului n mbinare cu eficacitatea mai redus a coloanei cromatografice, dect n GC, duc la
ideea c alegerea i optimizarea condiiilor de separare n metoda HPLC este mult mai dificil,
iar rolul experienei i intuiiei specialistului, n cazul dat, este mai important.
Optimizarea - este cutarea condiiilor optime la efectuarea analizelor. n dependen de
situaie, optimizarea poate fi ndreptat la mbuntirea selectivitii, sensibilitii i altor
parametri, ce determin veridicitatea rezultatelor, precum i mbuntirea raportului
cost/beneficiu, reducerea timpului de analiz, micorarea numrului de operaii manuale, dar fr
pierderi de informaie. Ea se refer la toate etapele de analiz.

Optim este mai bine zis o categorie filozofic. n cromatografie, precum i n alte
domenii persist un permanent compromis ntre calitatea rezultatului finit i cheltuielile la
realizarea lor (de materiale, de timp, de resurse umane). n ce privete cheltuielile pentru o
analiz trebuie adunate neaprat i cele la elaborare. n procesul optimizrii ele cresc monoton,
atunci cnd eficacitatea metodei se apropie asimptotic de o oarecare valoare maxim limita
fizic, determinat printr-un nivel modern de dezvoltare a tehnologiei analitice, i ntr-un
moment oarecare datorit optimizrii excesive metoda devine nerentabil.
Astfel, n rezolvarea sarcinii concrete este destul de important determinarea preventiv a
cheltuielilor posibile la elaborare i aprecierea profunzimii n cercetare.

1.2. Etapele analizei cromatografice

Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul depinde de
scrupulozitatea efecturii fiecrei etape n parte.
Se pot evidenia 3 etape de baz ale acestui proces:
Prepararea probelor toate operaiile de preparare a mostrelor de analizat, care se
finiseaz cu obinerea probelor, injectate direct n coloana cromatografic, inclusiv i
derivatizarea precoloan, n caz de utilizare.
Analiza cromatografic propriu zis din momentul injectrii probei pn la nregistrarea
semnalului electric la ieirea din detector, inclusiv i derivatizarea pe coloan sau postcoloan,
unde ea-i prezent.
Prelucrarea informaiei cromatografice primare, rezultatul creia const n obinerea
mrimilor ce caracterizeaz componena calitativ i cantitativ a probelor de analizat.
Oricare din etapele enumerate are specificul su de realizare i cere o tratare individual
de optimizare.

II. Determinarea ndulcitorilor din buturile rcoritoare prin

metoda HPLC
2.1 ndulcitorii
Aditivii alimentari sunt substane adugate intenionat n produsele alimentare pentru a
ndeplini anumite funcii tehnologice, de exemplu, pentru culoare, ndulcire sau conservare. n
Uniunea European (UE), Legislaia privind aditivii alimentari este reglementat de Directiva
Consiliului 89/107/CEE a Consiliului [1], i se bazeaz pe principiul c aditivii pot fi utiliza i
numai autorizat n fabricarea i prepararea produselor alimentare. Pot fi utilizai numai n cazul
n care tehnologia de fabricare necesit utilizarea lor, ei nu induc eroare consumatorului i nu
prezint niciun pericol pentru sntate.
ndulcitorii formeaz o categorie important de aditivi alimentari care sunt utilizai ntr-o
gam tot mai larg de produse alimentare i buturi. Sunt utilizai pentru a da un gust dulce
produselor alimentare. Directivele menionate mai sus stipuleaz c ndulcitorii pot fi pui la
vnzare c atare sau pot i utilizai n producia de produse alimentare. nainte de a primi
autorizare, ndulcitorii sunt evaluai de ctre Autoritatea European pentru Siguran Alimentar
(EFSA). Lista de ndulcitori autorizai este revizuit n mod regulat de ctre Comisia European,
n conformitate cu avizul EFSA, care ia n considerare cele mai recente progrese tiinifice n
domeniu.
n prezent, sunt utilizai 8 ndulcitori: acesulfam-K (ACS-K), aspartam (ASP), sare de
aspartam-acesulfam, ciclamat (CYC), zaharin (SAC), sucraloza (CL), neohesperidina
dihidrocalcona (NHDC) i taumatina. Unele din ele sunt sintetice: ACS-K, ASP, sare de ASPACS, CYC, SAC, CL sau semisintetice: NHDC, n timp ce taumatina apare n mod natural.
Avnd n vedere discuiile controversate cu privire la efectele lor asupra sntii i
pentru a asigur punerea adecvat n aplicare a legislaiei existene pentru a garanta siguran
consumatorilor, statele membre ale UE sunt obligate s stabileasc sisteme de anchetare regulat
pentru a monitoriza consumul de ndulcitori. Pentru a obine aceast informaie cantitativ,
metodele de analiz sunt necesare pentru a msur nivelul de ndulcitori ntr-o gam larg de
matrici alimentare.

Determinarea ndulcitorilor a determinat deja un mare interes. Cele mai multe metode au
fost dezvoltate pentru ndulcitori individuali. Pentru a da un exemplu, metodele disponibile
pentru determinare SAC din produsele alimentare includ spectrometrie, puls-polarografie
diferenial, sublimare, poteniometrie, cromatografie capilar electrocinetic micelar i
cromatografie lichid de nalt performan (HPLC). Cteva lucrri au demonstrat utilitatea
electroforezei capilare pentru analiz ndulcitorilor artificiali diferii. Deoarece metodele
spectrometrice, gravimetrice sau electrochimice necesit un timp mai lung de lucru, metod
HPLC n combinaie cu detecia UV este tot mai des aleas pentru a determin ndulcitorii
artificiali individuali cum ar fi SAC, ASP, ACS i NHDC. Lips cromoforului din CL face c
detecia prin absorbie UV direct s fie sensibil i dificil. Prin urmare, metod analitic de
determinare implic fie determinarea indicelui de refracie (RI), fie absorbant la o lungime de
und de 200 nm care nu are specificitate. Alte metode, care au fost aplicate cu success, sunt
cromatografia de nalt performan n strat subire, cromatografia de nalt performan de
schimb anionic cu detecie amperometrica sau electroforez capilar indirect cu absorbie UV.
De asemenea, CYC nu se absoarbe n domeniul UV vizibil. Acest neajuns a fost rezolvat prin
utilizarea fotometriei indirecte UV, extracia de ioni pereche, derivatizare, detecia
conductivitii.
n zilele noastre, ndulcitorii artificiali nu sunt utilizai singuri, ci n combina ie. De aceea
este nevoie de metode sigure care s poat acoperi cuantificarea acestora. Cu toate acestea au
fost descrise puine metode de cuantificare pentru determinarea simultan a mai muli ndulcitori.
Astfel, determinarea simultan se face pentru ASP i ACS-K, SAC i ASP, SC i CL.
Separarea i determinarea celor 4 ndulcitori: SAC, ASC-K, CYC i ASP se face prin
cromatografie lichid de nalt performan cuplat cu detecia conductivitii sau prin
cromatografie ionica.
Lucrarea de fa descrie dezvoltarea i validarea metodei de determinare a ndulcitorilor
printr-o metod HPLC combinat cu un detector evaporativ cu mprtierea luminii, care
ndeplinesc cerinele pentru a controla limitele legale ale ndulcitorilor sintetici i semi-sintetici
prevzute n legislaia actual a UE.

2.2 Metoda HPLC

2.2.1. Substane chimice, reactivi i soluii standard

Reactivii analitici, acid formic i trietilamina, au fost obinui din Fluka (Germania), iar
metanolul i acetonea din Merck (Germania). Apa ultrapur cu o rezistivitate > 1818M i cu
carbon organic total <5ngg-1 au fost obinute de la un sistem MilliQ Plus 185.
Standardele individuale pentru fiecare ndulcitor au fost obinute din diferite surse.
Au mai fost utilizate i urmtoarele substane: benzoat de sodiu, cafein, acid sorbic,
acid glutamic, acid fosforic, acid ascorbic, D (o)-sorbitol, acid malic, taurin, d(+)-glucuronolacton, chinin, hemi-sulfat de sare, acid citric monohidrat, zaharoz, fructoz, glucoz i
lactoz.
O soluie tampon cu ph 4,5 a fost pregtit prin dizolvarea a 4 ml de acid formic n 5 l
apa i ajustat la ph 4,5 cu cca. 12,5 ml trietilamina. Faz mobil A a HPLC a fost pregtit prin
amestecarea de 690 ml metanol cu 240 ml soluie tampon i 70 ml aceton, iar faz mobil B s-a
obinut prin amestecarea a 110 ml metanol cu 820 ml soluie tampon i 70 ml aceton.
2.2.2. Probele pentru testare

Probe de buturi energizante (ndulcite cu zahr), buturi rcoritoare cu acid (ndulcite

cu zahr), buturi rcoritoare fr acid ( ndulcite cu zahr), conserve din fructe (cocktailuri de
fructe i de pere ndulcite cu zahr) i iaurturi naturale achiziionate de la magazine de vnzare
cu amnuntul. nainte de utilizare, pentru fiecare prob a fost verificat absena compuilor
interesai pentru a fi folosite ca probe martor, pentru prepararea soluiilor de calibrare i pentru
pregtirea de materiale de testare fortificate.

2.2.3.

Prepararea i calibrarea soluiilor

Standarde de calibrare n soluie tampon

Pentru cuantificarea n timpul procesului de dezvoltare i optimizare a metodei a fost
pregtit o soluie standard care conine toi cei nou ndulcitori n soluia tampon. Concentraia
fiecrui ndulcitor a fost de 500 g ml -1, cu excepia DUL i NHDC care au avut o concentraie
de 100 g ml-1. O serie de 8 soluii de calibrare au fost preparate prin diluia soluiei standard cu
soluie tampon rezultnd concentraii ntre 4-500 g ml -1i de 0,8-100 g ml-1 pentru DUL i
NHDC.
Pentru cunatificare, la finalul etapei de validare, a fost preparat o soluie standard care
conine toi cei 9 ndulcitori, respectnd limita admis de 125 % din MUD. Pentru ndulcitorii
neautorizai (ALI, DUL i NEO) au fost preluate MUD fictive de la cca. 150 g ml -1. O serie de
8 soluii de calibrare au fost pregtite prin diluia soluiei standard cu o soluie tampon care
rezult n intervale de concentraii potrivite cu limitele date.

Soluia de calibrare a matricei

Soluia matrice standard a fost preparat folosind o butur energizant, un compot de
fructe i un iaurt natural. nainte de utilizare butur energizant a fost tratat cu ultrasunete,
fructele din compot i iaurtul au fost omogenizate. O soluie stoc compus din cei 9 ndulcitori a
fost preparat prin cntrirea standardelor pure ntr-un flacon de 100 ml, adaugandu-se cca. 50g
de prob omogenizat, coninutul obinut amestecndu-se timp de 6 ore. O serie de 8 soluii de
calibrare au fost preparate prin diluia soluiei matrice standard cu probele de analizat, rezultnd
concentraii de 12,5-2000 g g-1.
Omogenizarea materialelor de testare
Toate buturile au fost tratate ntr-o baie cu ultrasunete timp de 15 min, unde fructele i
iaurturile au fost omogenizate folosind un blender alimentar i un Ultraturrax.
Fortificarea materialelor de testare

Pentru a compar fiecare tip de calibrare de la fiecare material testat s-au pregtit solu ii
cu concentraii de cca. 2000, 400 i 80 g g-1. Testul de stabilitate a fost efectuat folosind un
material test cu o concentraie de cca. 250 g g-1. Toate acestea au fost pregtite n acelai mod
c la Seciunea 1.3.2.

2.2.4 Instrumente
ndulcitorii au fost separai folosind coloane analitice. Msuratorile cromatografice au
fost efectuate folosind un sistem HPLC format dintr-o pomp cuaternar, un autosampler i o
coloan termostat.

2.2.5

Pregtirea probelor
Fiecare material de testat a fost tratat astfel: 5g de material de testat omogenizat a fost

cntrit ntr-un balon cotat de 50 ml i apoi se completeaz pn la semn cu solu ie tampon. Se

agit energic 5 minute, iar apoi coninutul balonului este transferat ntr-un tub de 50 ml i se
centrifugheaz la 4000 rpm timp de 10 min. Coloanele SPE vidate au fost condi ionate cu 3 ml
metanol, apoi 3 poriuni a cte 2 ml soluie tampon i 2 poriuni cte 5 ml supernatant. Pe
parcursul ntregului proces s-a utilizat un debit de 1-2 ml/min. Dup splarea coloanei SPE cu 3
ml soluie tampon, ndulcitorii au fost colectai prin eluie cu 2 ml etanol, ntr-o eprubet de 5 ml.
Metanolul colectat a fost evaporat la cca. 3,5 ml la temperatur ambiental folosind un curent de
azot i apoi se aduce la semn cu soluie tampon nainte de a se trece la analiz HPLC-ELSD.

2.2.6 Analiz HPLC-ELSD

Separarea HPLC a ndulcitorilor a fost realizat cu ajutorul gradientului de profil cu un
debit de 0,5 ml/min al fazei mobile. Volumul de injectare a fost de 8 l, temperatur tubului a
fost de 85C, iar debitul de azot reglat la 2,5 l/min.

2.2.7 Identificarea i cuantificarea ndulcitorilor

Identificarea fiecrui ndulcitor din materialele test a fost fcut prin comparaia timpilor
de retenie a ndulcitorilor observai n timpul analizei soluiilor standard analizate din acelai lot
de probe, cu timpii de retenie a compuilor eluati n timpul analizei materialelor de testare.
Cuantificarea celor nou ndulcitori a fost realizat prin analiz celor opt soluii de
calibrare standard, folosind condiiile HPLC identice cu cele utilizate pentru materialele de
testare. Determinarea cantitativ a ndulcitorilor din extractul din SPE (C 1i) a fost efectuat prin
conversie n zon de vrf I (Ri) obinut prin analiz extractului injectat n coloan SPE, utiliznd
rezultatul funciei de calibrare. Fracia de mas a ndulcitorilor din materialul de testare a fost
calculat n conformitate cu ecuaia (1.).

Unde: C1i= fractia de mas a ndulcitorilor din extractul SPE g g -1 determinat folosind ecuaia
de calibrare stabilit.
C2i= fracia de mas a ndulcitorilor din materialul test g g-1
M1= masa materialului test luat pentru extractie, 5g
V1= volumul total al probei, 50 ml
V2= volumul de soluie de prob ncarcat pe cartuul SPE, 10 ml
V3= volumul final al extractului SPE, 4 ml.
Experimentele sunt mpartite in doua pri: optimizarea i validarea metodei.

2.2.8 Optimizarea
2.2.8.1

Separarea HPLC

Selectarea unei coloane analitice a fost prima etapa in dezvoltarea noii metode. In
studiul de fata a fost selectata o coloana complet nchis la capate, oferind o separare in 25 de
minute a celor noua indulcitori alesi: ACS-K, ASP, CYC, NHDC, SAC, SCL, ALI, NEO si DUL
(Fig.1).

Fig. 1- Separarea HPLC-ELSD a unor mixturi cu 11 ndulcitori folosind Nucleodur C18 Pyramid
column.
n plus a fost posibil s se separe ali doi ndulcitori neautorizai, de exemplu,
stevioside i rebaudioside A. Cu toate acestea, din cauza probelor limitate, aceti doi compui au
fost exclui din experimente. Aa cum arat Fig.2, prin aplicarea acelorai condiii
cromatografice, separarea ndulcitorilor a fost eficient indiferent de brand-ul coloanei.

Fig. 2- Separarea HPLC-ELSD a unei mixturi cu 9 indulcitori folosind coloane diferite: (a)
Zorbax Extend-C18; (b) Nucleodur C18 Pyramid; (c) Nucleodur C8 Gravity; (d) Purospher Star
RP-18

n ceea ce privete faza mobil i parametrii gradientului, trebuie luate n considerare

mai multe aspecte. nainte de toate, ELSD este limitat pentru utilizarea s n fazele mobile
volatile.
ELSD se bazeaz pe diferenele de volatilitate dintre solvent i prob. Principalul
avantaj al ELSD este c se poate detect orice analit fr a fi nevoie de cromofori sau fluorofori.
Singur condiie este c analitul s fie mai puin volatil ca faza mobil. n al doilea rnd, pentru a
obine timpi de retenie stabili, este aleas o faz mobil tamponat, deoarece ndulcitorii
formeaz molecule polare n faza mobil, frecvent utilizate n cromatografia lichid de faz
invers, i gradul de ionizare al unei molecule afecteaz interaciunile sale cu faza staionar. n

cele din urm, cea mai bun metod de separare a tuturor celor 9 ndulcitori a fost cea care
folosete o soluie tampon apoas compus din acid formic i trietilamina (pH=4,5) i o faz
mobil format dintr-un amestec de metanol i aceton.
2.2.8.2

Detecia ELSD

Un rezultat bun a fost obinut prin utilizarea unei temperaturi de 85C i un debit de azot
de 2,5 l/min.
2.2.8.3 Prepararea probei prin extracie pe faz solid

Prepararea probelor cu succes, de exemplu, matricea de simplificare, au fost realizate

prin adsorbia ndulcitorilor pe cartue SPE, iar desorbtia posibilelor interferente ale matricei a
fost posibil prin splarea cu soluie tampon i prin impregnarea ndulcitorilor cu metanol. Tipul
cartuelor SPE a fost ales pentru a se potrivi cu faz staionara a coloanelelor de separare HPLC.
Pentru a determina un amestec de 3 ndulcitori cu un timp de retenie foarte scurt, se dizolv
amestecul n ap acidifiat cu acid formic 0,1% sau n soluie tampon i apoi se folose te vid
ntr-un cartu SPE condiionat. Fiecare poriune de 5ml din cartu au fost colectate i analizate
prin HPLC. Cel mai mare volum de 30 ml a fost obinut pentru a fi folosit c solvent de splare.
n cele din urm, cele mai bune rezultate au fost obinute prin limitarea volumului probei din
cartu la 10 ml i volumul solventului de splare la 3 ml.
2.2.8.4 Calibrarea

n scopul alegerii tipului potrivit de calibrare, au fost efectuate mai multe experimente
pentru a respecta limitele legale din actuala legislaie a UE.
Ca un exemplu, funcia de calibrare a CL este dat n Fig. 3.

Figura 3.Funcia de calibrare.

Prin urmare, cuantificarea a fost efectuat cu ajutorul conversiei logaritmice n baza 10
att pentru concentraie ct i pentru aria picurilor. Dei aceast este o metod comun de
liniarizare, s-a constatat c pentru majoritatea ndulcitorilor rspunsul de transformare nu a fost
complet linear pe un interval de lucru de 12,5-2000 g g-1 (Fig. 4).

Figura 4. Conversie logaritmic.

Chiar dac coeficienii de corelaie liniar R au fost n cea mai mare parte > 0,98,
distribuirea reziduurilor (Fig. 5), a indicat c modelul nu este adecvat.

Figura 5. Distribuia reziduurilor.

Raspunsul primit de ELSD a fost cel mai bine descris printr-o ecuaie polinomial de
gradul 3 (Fig. 6).

Figura 6. Ecuaia polinomial.

Urmtorul pas a fost de a compara rezultatele obinute de trei materialele test fortificate
cu niveluri diferite de ndulcitori, cuantificate prin utilizarea matricei de calibrare sau etalonare
obinut prin standardele dizolvate n soluie tampon. n cele mai multe cazuri, rezultatele
obinute pe baza soluiilor tampon de calibrare au fost mai aproape de valoarea real dect cele
calculate cu ajutorul curbelor de calibrare. Numai n cazul NHDC din iaurt, matricea de calibrare
a dat rezultate relative mai bune, care ar putea fi din cauza degradrii mai rapide a ndulcitorului
n iaurt.
Scopul final al studiului a fost de a oferi metodologie adecvat pentru a fi utilizat de
ctre laboratoarele particulare sau de agenii pentru a pune n aplicare limitele legislative. Prin

urmare, ntreag abordare a fost n cele din urm adaptat pentru a se potrivi cu limitele legale
prevzute. Nivelul superior al gamei de lucru a fost limitat la cca. 125 % din MUD pentru
ndulcitorii autorizai. Niveluri de concentraie mai mic au fost stabilite cu ajutorul LOQ
determinate. O comparaie a abaterilor standard ale reziduurilor obinute prin ecuaii polinomiale
i liniare nu au artat diferene semnificative ntre cele dou modele de calibrare pentru toi cei 9
ndulcitori.

2.2.9

Validarea metodei
Metoda de validare este una dintre msurile universal recunoscute ca fiind o parte

necesar a unui sistem global de asigurare a calitii n chimia analitic. Validarea metodei de
analiz poate fi considerat ca fiind un proces sistematic de verificare dac o metod de analiz
este acceptat pentru scopul destinat. Validarea prezentat examineaz parametrii de selectivitate,
limit de detecie, limit de cuantificare, precizia i exactitatea metodei folosite pentru cei nou
ndulcitori.
2.2.9.1

Selectivitatea

Selectivitatea reprezint capacitatea metodei de a determina cu exactitate analitul de

interes, n prezena altor componente care pot fi prezente n aceeai prob. S-a stabilit prin
compararea rezultatelor obinute pe o soluie standard de ndulcitori care coninea 16 substane
diferite ntlnite n produse alimentare. Au fost testate urmtoarele substane: benzoat de sodiu,
acid sorbic, acid citric, acid fosforic, acid malic, acid ascorbic, acid glutamic, zaharoz, glucoz,
fructoz, lactoz, cafein, chinin, taurin, D(+)-glucurono-lacton i sorbitol. Singur pereche
de compui care a ntmpinat probleme a fost ALI-CHI. Mai mult, selectivitatea metodei a fost
investigat prin analizarea tuturor probelor martor, materialelor test cum ar fi: buturi
energizante, buturi carbogazoase, buturi rcoritoare fr acid, conserve din fructe i iaurturi
natural. Niciunul din materialele test nu a prezentat alte componente care ar fi putut interfera cu
analiii de interes.
2.2.9.2 Domeniul de lucru
ntreag abordare a fost efectuat ntr-un interval de lucru de 25 g g-1 la 125% din
MUD-uri pentru ndulcitorii autorizai i 125% din 150 g g-1 pentru ndulcitorii neautorizai.

2.2.9.3 Limit de detecie i de cuantificare

Probele martor au fost utilizate pentru a determina nivelul mediu al timpului de retenie a
analitilor de interes i matricea potrivit pentru soluiile de calibrare pentru a estima limit de
detecie (LOD) i limit de cuantificare (LOQ).
LOD au fost determinate de reducerea succesiv a volumului de soluii de calibrare
injectate ce conin cele mai mici concentraii de ndulcitori. Volumul de injectare care a dat un
semnal zgomotos de trei ori a fost utilizat pentru a estima LOD.
LOQ pentru fiecare ndulcitor a fost stabilit n funcie de concentraia care a dat
semnalul sonor. LOD i LOQ sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabel 2. Limita de detecie i limita de cuantificare pentru ndulcitorii analizai.

2.2.9.4 Precizia i autenticitatea metodei

Pentru a se respecta autenticitatea metodei n ceea ce privete concentra ia,

repetabilitatea, exprimate prin deviaia relativ standard a repetabilitaii, au fost efectuate aceste
etape pe 6 probe pentru trei matrici alimentare diferite, fortificate cu toti cei noua indulcitori la 4
niveluri diferite de concentratie.

CONCLUZII
Avnd n vedere practica din zilele noastre de a folosi ndulcitori n combinaie, este
nevoie de metode de ncredere care s poate recunoate ct mai muli ndulcitori. O metod
simpl i rapid este analiza prin HPLC-ELSD deoarece permite separarea i cuantificarea
simultan a nou ndulcitori din produse alimentare diferite. Pentru a se asigur validarea
metodei toate etapele s-au desfurat ntr-un singur laborator. Liniaritatea metodei, autenticitatea,
precizia, selectivitatea, au fost evaluate mpreun cu limitele de detecie i de cuantificare ntr-o
serie de experimente.
Exactitatea metodei a fost satisfctoare avnd recuperrile variind ntre 93-109% pentru
nivelurile de concentraie n jurul MUD-urilor autorizate pentru ndulcitorii acceptai de
legislaie i 100-112% pentru compuii neautorizai (ALI, NEO, DUL). Metod aceast ofer
informaii privind conformitatea etichetelor cu dispoziiile generale stabilite de lege. Este o cale
potrivit de a examina rapid un numr mare de probe ce conin 6 ndulcitori autorizai i 3
neautorizai.

BIBLIOGRAFIE
1. BALOESCU C., CUREA E. Controlul medicamentelor. Bucureti. 1983
2. CASIAN Ana Contributii la optimizarea metodei cromatografice de lichide sub
presiune pentru aplicarea in analiza farmacocinetica Chiinu, 2008
3. Yan Zhu, Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber Journal of
Chromatography A, 1157, pag. 187-196, 2007
4. Yingying Guo, Mingli Ye, Frits S. James Journal of Chromatography A, 1085, pag.
143-146, 2005