1.

Introducere
HPLC – metoda analitica utilizata in scopul separarii, identificarii si dozarii substantelor
organice si anorganice aflate in solutie.

ANALIZE:

• farmaceutice

• clinice

• toxicologice

• de mediu

• industriale

• Alimentare [1]

Părțile componente ale aparatului

[2]
 1. Decrierea metodei
Proba de analizat este introdusă în volum mic în fluxul fazei mobile. Trecerea analitului
prin coloană este încetinită de prezența unor interacții de natură chimică sau fizică in
fazastaționară, acestea trecând de a lungul coloanei. Totalul încetinirilor depinde de fiecare analit
în parte, faza staționară și compoziția fazei mobile. Timpul la care un analit specific eluează (iese
afară din coloană) este numit timp de retenție; timpul de retenție sub condiții particulare este
considerat o caracteristică unică de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane încărcată
cu particule mici (care creează o presiune de împingere mai mare) crește viteza lineară, acordând
compușilor timpul minim să difuzeze prin coloană, conducând astfel la o îmbunătățire a
rezoluției cromatogramei rezultate. (3)

Solvenții comuni care se utilizează includ orice combinație miscibilă cu apa sau lichide
organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conține soluții tampon sau săruri
care ajută la separarea componenților de analizat sau componenți ca acid trifloroacetic care
acționează ca agent de împerechere ionică.

O rafinare mai bună a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziția fazei mobile în
timpul analizei; aceasta este cunoscută sub denumirea de gradient de eluție. Un gradient normal
pentru o fază cromatografică inversă poate se înceapă cu 5% metanol și să crească până la 50%
în 25 minute; gradientul ales depinde de cât de hidrofob este analitul. Gradientul separă
amestecul de analiți în funcție de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza
staționară[4].
 Fotografie a unui aparat HPLC. De la stânga la dreapta: Pompa de gradient, ce asigură
fluxul de solvent, coloana cromatografică, aparat de înregistrare a absorbanţei.

3.1. Timp de retenție

Timpul necesar pentru un anumit compus de a călători prin coloană la detector este
cunoscut sub numele de timp de retenție . Acest timp este măsurat din momentul în care proba
este injectat la punctul în care pe ecran se afișează o înălțime maximă de vârf pentru acel
compus.

Pentru un anumit compus, timpul de retenție va varia în funcție de:

• presiunea folosită (pentru că afectează rata de curgere a solventului);

• natura fazei staționare (nu numai materialul din care este confecționat, dar, de asemenea,
dimensiunea particulelor);
• compoziția exactă a solventului;
 • temperatura coloanei;
Asta înseamnă că, condițiile trebuie să fie atent controlate dacă folosiți timpi de retenție ca o
modalitate de identificare a unor compuși.

1.2.Detectorul
Există mai multe metode de detectare atunci când o substanță a trecut prin coloană. O
metodă comună, care este ușor de explicat foloseste absorbție ultra-violet.

Mulți compuși organici absorb lumina UV de diferite lungimi de undă. Dacă aveți un
fascicul de lumina UV strălucește prin fluxul de lichid care iese din coloană, și un detector UV
de pe partea opusă a fluxului, puteți obține o lectură directă de cât de mult din lumina este
absorbită.

Cantitatea de lumină absorbită va depinde de cantitatea de un anumit compus care trece

prin raza la momentul respectiv.

Metanol, de exemplu, absoarbe la lungimi de undă sub 205 nm, și apă sub 190 nm. Dacă
ați folosind un amestec de metanol și apă ca solvent, prin urmare, ar trebui să utilizați o lungime
de undă mai mare de 205 nm, pentru a evita citirile false de solvent.

Interpretarea de ieșire de la detectorul

Ieșirea va fi înregistrată ca o serie de varfuri - fiecare dintre ele reprezentând un compus

în amestec trece prin detectorul și de a absorbi lumina UV. Atâta timp cât ati fost atenti pentru a
controla conditiile de pe coloana, ai putea folosi timpii de retentie pentru a ajuta la identificarea
compușilor prezenti.
 http://www.waters.com/waters/en_RO/How-Does-High-Performance-Liquid-Chromatography-Work

https://www.researchgate.net/figure/8635374_fig1_Fig-1-Chromatogram-for-a-standard-mixture-of-
biogenic-amines-putrescine-cadaverine