L3 Cromatografia n faz lichid la nalt presiune (high pressure liquid chromaorgraphy)

Cromatografie - tehnic folosit pentru separarea componenilor unei probe, prin care aceti
componeni se distribuie ntre dou faze, una staionar i una mobil. Faza staionar poate fi un
solid sau un lichid depus pe suport.

Rezervor
solvent de
eluie
(faz
mobil)

Sistem de
Sistem de injecie detecie

Colector de fraciuni

Componenii unui sistem HPLC

1. Rezervor sau rezervoare care conin faza sau fazele mobile; faz mobil - ansamblul format
din gazul purttor i poriunea din eantionul introdus n coloan (GC); un lichid (solvent)
folosit pentru eluarea componenilor probei prin coloan sau dup coloan. Poate fi
monocomponent sau un amestec de solveni (HPLC); Faza mobil trebuie s conin reactivi
chimici puri. nainte de utilizare, faza mobil trebuie filtrat i degazat, atunci cnd se
impune prevenirea formrii bulelor de aer n sistem. Trebuie s se asigure filtrarea fazei
mobile n circuitele sistemului HPLC pentru ndeprtarea impuritilor mecanice (particule,
praf etc).
2. Pomp de nalt presiune. Pompa trebuie s asigure o presiune n domeniul (040) MPa;
Pompa trebuie s asigure un debit cuprins ntre (0,15,0) ml/min; Pulsaiile pompei trebuie
s nu depeasc 2 % vrf la vrf (ca presiune), cnd se monitorizeaz sistemul cu ap, la
o presiune de retur de 14 MPa, la un debit de 1 ml/min, pentru o durat de 10 minute. ntre
pomp i coloan, sistemul HPLC trebuie s dispun de un monitor de presiune i de un
releu limitator de presiune.
3. Dispozitiv de injecie - mijloc tehnic de introducere a probei n coloana cromatografic;
4. Coloan cromatografic - un tub care conine faza staionar prin care trece faza mobil;
faza staionar - solid depus sau nu pe un suport solid care produce separarea constituenilor unei
probe datorit diferenelor de solubilitate i respectiv, de adsorbie; material imobil activ existent n
coloan, depus pe suportul solid sau fiind nsui suportul solid, care produce o ntrziere n trecerea
componenilor probei, ca urmare a proceselor specifice de separare cromatografic (HPLC). .
Materialul de construcie trebuie s fie inert fa de componenii fazei mobile i a probelor de

1
analizat. n acest sens materialele din care se realizeaz pot fi materiale metalice, din sticl sau
material plastic. Mai mult, acestea trebuie i s reziste la presiunea generat de pomp.
5. Detector - dispozitiv care permite conversia concentraiilor componenilor probei n semnal
electric proporional; Caracteristicile detectorului includ:
zgomot de fond - msur a variaiei semnalului de ieire al unui detector n situaia n
care nu se nregistreaz prezena unui component al probei;
limit de detecie - concentraia componentului de interes al probei care d un
semnal de ieire al detectorului, egal (de regul) cu de trei ori zgomotul de fond;
selectivitate - caracteristica unui detector de a reaciona ntr-un grad nalt la anumite
categorii de compui fa de altele;
sensibilitatea unui detector - semnalul produs de unitatea masic a compuilor ntr-
un gaz purttor, care se ncadreaz ntr-una din categoriile urmtoare.
pentru un detector dependent de concentraie, ea se exprim n A x ml x g -1 sau V x ml x g prin
ecuaia:
PxF
S unde
M
S Sensibilitatea;
P Aria integrat a picului (A x s sau V x s);
F Debitul gazului purttor (ml/s);
M Masa eantionului n faza mobil purttoar (g)

pentru un detector dependent de debitul masic, sensibilitatea se exprim n A x s x g-1 sau V x s x g1

prin ecuaia: S = P/M; unde simbolurile sunt aceleai ca la definiia de mai sus;
domeniu liniar al detectorului - domeniul concentraiilor sau al debitelor masice pentru
un component de interes al probei, pentru care sensibilitatea detectorului rmne constant
ntr-o plaj de 5 %. Valoarea sa este dat de raportul dintre limita superioar a liniaritii i
limita de detecie;
domeniu dinamic al detectorului - domeniul concentraiilor sau al debitelor masice ale
unui component al probei, pentru care o modificare a cantitii de prob produce o modificare
msurabil a semnalului de ieire al detectorului;
Detectori utilizai n HPLC:
Detector UV/vizibil - detector care msoar absorbana luminii prin prob;
Detector cu fluorescen - detector care utilizeaz relaia dintre emisia fluorescent i concentraia
compuilor probei care au fost excitai prin absorbia luminii;
Detector electrochimic - detector care poate fi folosit pentru msurarea componenilor probei care
se pot oxida sau reduce electrochimic la electrozi;
Detector selectiv de mas (MS) - conform descrierii de la punctul.
6. Trebuie s se ia n considerare sistemele de prelucrare automat a datelor cu ajutorul
crora se pot efectua analize complete, att calitative, ct i cantitative, respectiv de
integrare sau calculatoare care achiziioneaz i prelucreaz automat datele sub form
digital, livrnd rezultatele analizei.
7. Sistem automat de colectare a fraciunilor componenilor unei probe. Uneori, mai ales n
cazul cromatografiei preparative este necesar ca o parte din componenii probei s fie
colectati n vederea utilizri sau efecturii de analize suplimentare.

Terminologie utilizat n cromatografie

eluie - extragerea i deplasarea constituenilor unei probe din faza staionar de ctre faza
mobil;
cromatogram - un grafic al rspunsului electric al detectorului funcie de timp. Din
cromatogram se obin urmtorii parametri de reinere: timpul de reinere (tR), precum i
nlimea (h) sau aria (A) picurilor (vrfurilor cromatografice) componenilor separai; pe baza
acestor parametri se identific i se determin cantitativ componenii probei;

2
 analiz calitativ: identificarea unui compus prin cromatografie, cu ajutorul unor etaloane, pe
baza parametrilor de reinere (tR);
analiz cantitativ - calcularea concentraiilor compuilor chimici sau a compoziiei probei din
datele picurilor componenilor (arie, nlime) i ale componenilor de referin;
timp de reinere sau de retenie - intervalul de timp scurs de la injectarea probei pn la
nregistrarea valorii maxime a picului componentului din prob;

repetabilitate - limit de acceptabilitate pentru rezultatele msurrilor succesive efectuate asupra

aceluiai msurand, n aceleai condiii de lucru, de ctre acelai operator i n cursul unei
perioade relativ scurte de timp.
Factor de capacitate
V V0 t R t0 t ' R
k' R
V0 t0 t0
Unde
VR = volumul de retentie pentru un anume compus
V0 = volum de retentie faza mobil, solvent sau pentru un compus inert fa de coloan
t R = timp de retenie a compusului R
t 0 = timp de retentie faza mobil, solvent sau pentru un compus inert fa de coloan
t`R = timp de retenie efectiv
Selectivitatea sau factorul de separare

Eficien de separare

3
 Cromatografie n faz normal cromatografie n faz invers

Cromatografie n faz normal se refer la faptul c faza stationar este una polar-
adsorbant de tip silicagel/ alte umpluturi pe baza de silice (SiO 2); principiul separarii: etape repetate
de adsorbtie-desorbtie faz mobil este nepolar (hexan, heptan, THF, amestecuri de alcool
izopropilic cu acetat de etil i o cantitate redus de ap). Componenii nepolari sunt evacuai rapid
(eluie rapid); compuii polari au timpi de retenie ridicai n consecin vor fi evacuai mai greu
din sistem. Timpul de retenie crete i pe msur ce n faza mobil crete cantitatea de solvent
nepolar.
Absorption is the incorporation of a substance in one state into another of a different state (e.g., liquids being absorbed
by a solid or gases being absorbed by a liquid). Adsorption is the physical adherence or bonding of ions and molecules
onto the surface of another phase (e.g., reagents adsorbed to solid catalyst surface).
n cazul cromatografiei lichide la nalt presiune n faz invers (reversed phase HPLC),
faza staionar este nepolar lanturi hidrocarbonate hidrofobe legate de silice. Interaciunile dintre
componenii unei probe de analizat i faza staionar sunt hidrofobe (nespecifice). Ordinea de eluie
este invers compuii polari prezint timpi de eluie mici n timp ce compuii nepolari prezint
timpi de eluie mari. n consecin cei din urm sunt evacuai ultimii din coloan. Faza mobil este
n general polar.

Normal-Phase HPLC : Reversed-Phase HPLC:

Compusul A(galben) este foarte polar; compusul B are o polaritate medie iar C este cel mai puin
polar.
Partea practic

Se realizeaza solutii de concetratie cunoscuta de ftalat de potasiu (0,1....0,5 g/L); guaiacol

(0,05...0,1 g/L) i acid vanilic. Deasemenea se realizeaz i un amestec dintre cele 2 solutii.
Pentru etalonarea calitativ (stabilirea timpilor de retentie a celor 3 compui) se injecteaz
separat cate 200 L n sistemul cromatografic. Se nregistreaz cromatogramele celor 3 compui i
se stabilesc timpii de retenie corespunztori.
Pentru etalonarea cantitativ a sistemului se procedeaz n felul urmtor: se realizeaz
injecii succesive din soluiile compuilor de mai sus, soluii de concentraie diferit i cunoscut.

4
Pentru fiecare tip de soluie se calculeaz cu ajutorul softului Origin suprafetele corespunztoare
picurilor. Se traseaz dreapta de etalonare i se stabilete corelaia Apic=f(C).
Pentru determinarea concentraiilor dintr-un amestec se injecteaz n coloan 200 L se
determin suprafaa celor 3 picuri i ulterior, prin interpolare concentraia.

Momente de dipol ale unor compui organici