L2 Cromatografia de Excluziune Sterica

Metodele cromatografie de permeaie pe gel i cromatografia de excluziune steric au fost

dezvoltate ca variante ale cromatografiei n faz lichid, ambele metode cptnd n ultima perioad
o importan deosebit ca metode de studiu a polidispersitii polimerilor i de determinare a
curbelor de distribuie molecular.
1. Masa molecular medie numeric (aritmetic ), definit prin relaia (1):

n M
Mn i i
n M (1),
n
i i
i

n care ni este fracia numeric a macromoleculelor de mas Mi;

Masa molecular medie gravimetric (ponderat), definit prin relaia (2):

Mw
n M
i i
2

wi M i (2),
n M
i i

n care wi este fracia ponderat a moleculelor de mas Mi;

Mw
IPD (3)
Mn

M
GP (4).
M mer

Principiul metodei. Cromatografia pe gel permeabil i cea de excluziune steric au la baz

fenomenele care apar la trecerea soluiei unui polimer polidispers printr-un strat de umplutur cu
pori de anumite dimensiuni, n pori fiind reinute macromoleculele de dimensiuni adecvate (mai
mici dect diametrul mediu al porilor) iar cele de dimensiuni mai mari ies din coloan odat cu
solventul - figura 1.
Detecia poate fi realizat cu ajutorul unui detector de tip UV-VIS, RI, fluorescen sau
conductometric. n cazul ambelor tipuri de metode, mecanismul principal de reinere este acela de
excluziunea steric, dar n cazul cromatografiei de permeaie pe gel, n literatura de specialitate se
menioneaz faptul c, concomitent cu reinerea steric (datorat dimensiunilor macromoleculelor)
au loc i interaciuni de natur electric, mai ales pentru c n general cromatografia pe gel
permeabil este practicat cu utilizarea unor soluii apoase ale unor acizi, baze, sruri sau soluii
tampon de diferite trii ionice.

1
 Figura 1. Ilustrarea principiului de separare a polimerilor prin CPG i CES
http://www.separations.eu.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/SizeExclusion/
http://www.viscotek.com/the-gpc-sep.htm
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat
ion#
http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/Org
anicSolublePolymers/Hhr/TSKgelGMHhr-Mmixedbed.htm
http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat
n cazul cromatografiei de excluziune steric reinerea are loc pur datorit excluziunii
sterice, aceasta fiind practicat cu utilizarea unor solveni aprotici: dioxan, tetrahidrofuran etc..

Rezervor
solvent de
eluie
(faz mobil)

Sistem de detecie
Sistem de injecie

Colector de fraciuni

2
 Figura 2. Componena unui sistem de CPG sau CES
Cu ct dimensiunea particulelor este mai redus cu att va fi necesar un volum mai mare de
solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie V R. Curba tipic sau de distribuie a
polimerilor obinut prin CPG sau CES se caracterizeaz prin: volumul de eluent care a trecut prin
coloan din momentul injectrii probei (VR) i lrgimea curbei msurat la jumtatea ei W1/2.
Factorii care influeneaz separarea prin cromatografie pe gel permeabil i respectiv forma
curbei obinute sunt: natura i caracterisiticile fazei staionare, natura polimerului, caracteristicile
fazei mobile i condiiile de operare.
Natura i caracterisiticile fazei staionare joac un rol important n obinerea unor
cromatograme corespunztoare, n principal prin mrimea i distribuia porilor, aspecte care
dicteaz i intervalul de separare. n plus faza staionar trebuie s fie stabil i s i menin stabile
proprietile pe o durat ct mai ridicat de timp, s nu interacioneze cu faza mobil sau cu
componenii probei.
Natura polimerului. n condiiile n care dimensiunile porilor fazei staionare rmn
neschimbate (constante) cu ct dimensiunea macromoleculelor este mai redus cu att va fi necesar
un volum mai mare de solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie V R. Volumul
de retenie variaz liniar i cu concentraia polimerului. Caracteristicile fazei mobile determin
volumul hidrodinamic al macromoleculelor n timp ce condiiile de operare determin n unele
cazuri limea cromatogramei.
Etalonarea coloanelor de cromatografie pe gel permeabil/excluziune steric.
Cromatografia pe gel permeabil/excluziune steric nu este o metod absolut (este realativ), fiind
necesar calibrararea (etalonarea) cu etaloane de mas molecular cunoscut. Procedeul uzual
implic utilizarea unor soluii de polimeri cu mas molecular cunoscut i distribuie ngust
IPD=1, n domeniul de mase moleculare de interes. Practic, calibrarea implic trasarea unei drepte
lgM=f(VRi). Determinarea volumelor VRi de eluie se realizeaz prin injecia n coloan a unor
polimeri sau amestecuri de polimeri de mas cunoscut.
Deoarece materialul de umplutur utilizat este unul poros pentru nceput este necesar
determinarea volumul liber al sistemului V0 = V0P (volumului liber al porilor) V0t(care se adaug i
volumul este necesar introducerea unei corecii prin raportarea volumelor de eluie V Ri la volumul
V0. n acest caz, ecuaia dreptei de etalonare va fi o funcie lgM=f(V Ri/V0). Pentru determinarea V0
este necesar s se realizeze o eluie a unui compus (polimer) cu masa molecular peste limita
superioar de separare a umpluturii coloanei.

3
 Figura 3. Cromatograma HPSEC GPC a unui amestec de proteine
Determinarea distribuie de mas molecular prin cromatografie de excluziune steric de
nalt performan (high performance size exclusion chromatography) necesit, de cele mai multe
ori n cazul polimerilor naturali modificarea chimic a probei prin derivatizare.

Modul de lucru
Se pornete sistemul de cromatografie HPSEC i se ateapt o perioad de cel puin 30
minute pentru stabilizarea acestuia. Eluentul utilizat n cazul de fa este tetrahidrofuranul (THF) Se
utilizeaz o coloan cu umplutur din polistiren-divinil-benzen (domeniu de separare 103-105 )
nseriate. Deoarece n cazul polimerilor naturali (lignina) n structura acestor regsim un numr
mare de grupe hidroxilice este necesar blocarea acestora prin modificare chimic. Scopul
modificrilor este reducerea sau nlturarea complet a interaciunilor dintre grupelor funcionale
prezente n structura polimerilor naturali (grupele - OH) i umplutura din care este realizat
coloana. Un efect secundar pozitiv al derivatizrii este creterea solubilitii n solveni organici
aprotici. Principalele metode de derivatizare: acetilarea, metilarea, sililarea.

Trasarea curbei de etalonare-exemplu

Se traseaz curba log M = f (Ve) utiliznd datele din cromatograma de mai jos i tabelul 2.
Pentru etalonarea coloanelor de HP SEC se utilizeaz un amestec de polimeri (standard), de
mase moleculare cunoscute, la alegerea cruia trebuie s se in seama de domeniul de separare al
coloanei. Se reprezint grafic distribuia da mas molecular n coordonate Abs (prob) funcie de
lg.
Se realizeaz calculul masei moleculare medii Mw sau Mn se poate, prin integrarerea curbei
de distribuie i nsumarea valorilor fiMwi.

4
 n cazul sistemului de CPG se utilizeaz standarde (etaloane) de polistiren-sulfonat de sodiu
cu mase cuprinse n intervalul 1000- 100000 Da. Valorile Mw, Mp i Mw/Mn sunt prezentate n
tabelul 1.

PSS3_B
0.20 Base1_basey

5.93867

5.12667
0.15
6.87267

Absorbata
0.10

4.312

0.05

0.00
3 4 5 6 7 8 9
Volum de elutie, mL

Tabel 2 Valorile obinute pentru standardul utilizat pentru calibrare

Lg Lg Lg Ve te
Mp Mw Mn IPD Mp MW Mn (mL)