LUCRARE PRACTIC|

DIFUZIUNEA {I


1 OSMOZA

A. Studiul influen]ei unor factori fizici

asupra ratei difuziunii
A1. Definirea [i explicarea fenomenelor de
agita]ie termic\, difuziune [i osmoz\
A2. Legile osmozei. Solu]ii false [i solu]ii
adev\rate
A3. Osmolalitate [i osmolaritate. Calculul
presiunii osmotice
A4. Aplica]ii medicale

B. Metoda celor dou\ micrometre pentru

m\surarea dimensiunilor celulare
B1. Microscopul optic
B2. Micrometrul ocular [i micrometrul
obiectiv

C. Evaluarea cantitativ\ a fenomenului de

osmoz\
C1. Osmoza la celulele vegetale
C2. Osmoza la nivelul hematiei

D. Exerci]ii [i întreb\ri
La nivelul membranelor naturale se petrec schimburi de substan]\ f\r\ de care celulele vii
nu ar putea supravie]ui. Acestea implic\ fenomene de transport ale solventului sau/[i ale
solvi]ilor intra- [i extracelulari. Lucrarea de fa]\ v\ permite s\ observa]i [i s\ `n]elege]i
fenomenul de transport membranar al solventului, osmoza, utilizând drept modele de studiu
c e l u l a v e g e t a l \ [i h e m a t i a , comparativ. Ca urmare a transportului transmembranar de
ap\ (solventul uzual al solu]iilor biologice), celulele `[i modific\ dimensiunile. Pentru a observa
aceste modific\ri de ordin microscopic vom utiliza m i c r o s c o p u l o p t i c , iar pentru a le
evalua cantitativ, vom ata[a acestuia dou\ micrometre, utilizând m e t o d a c e l o r d o u \
micrometre.

1
 LUCRARE PRACTIC|

☺ PARTEA PRACTIC|

Difuziunea poate fi influen]at\ de greutatea

a) Materiale necesare : molecu-lar\ [i de concentra]ia moleculelor.

3 eprubete cu agar




solu]ii 5 mM de :
metil orange
a ) Efectul greut\]ii moleculare
Mod de lucru:
P

bicromat de potasiu 1. Lua]i trei eprubete con]inând deja o coloan\ de agar

sulfat de cupru (10 ml gel polizaharidic, `n stare semifluid\).

2. Ad\uga]i 3 ml din solu]iile de aceea[i concentra]ie a

Substan]a Distan]a unor compu[i colora]i, cu masa molecular\ diferit\
(timp: 2 ore) (prezentate al\turat).
Metil orange
Bicromat de 3. Nota]i nivelul la care se g\se[te limita de separa]ie a
potasiu celor dou\ medii, pentru fiecare eprubet\.
Sulfat de
cupru 4. La sfâr[itul orelor de lucr\ri practice: nota]i nivelul la
Tabel de rezultate care a ajuns solu]ia colorat\ [i m\sura]i distan]a pe
care a difuzat.

Nota]i datele `n tabelul de rezultate.

b) Materiale necesare:

3 eprubete cu agar

solu]ii de metil orange de
b)Efectul gradientului de
concentra]ii :
concen-tra]ie
1 mmol, 5 mmol, 10 mmol
sol. metil
orange
Distan]a
(timp: 2 ore)
Mod de lucru:
1. Lua]i alte trei eprubete cu agar. P
1 mmol
2. Ad\uga]i `n fiecare eprubet\ 3 ml din solu]ia aceluia[i
5 mmol compus (metil orange) dar de concentra]ii diferite.
10 mmol
Tabel de rezultate 3. 3. Realiza]i acelea[i m\sur\tori ca [i la punctul a) [i
nota]i rezultatele `n tabelul de rezultate.

2
 LUCRARE PRACTIC|

B. Metoda celor dou\ micrometre pentru

 m\surarea dimensiunilor celulare

Participarea fenomenului de osmoz\ la schimbul

surs\ de de substan]\ dintre celul\ [i mediul `nconjur\tor poate fi
lumin\ observat\ prin experien]e simple, utilizând microscopul
optic.

lentil\ Descrierea microscopului optic

condensor Microscopul optic obi[nuit (fig. 4) este un sistem
de lentile convergente astfel realizat `ncât s\ poat\ fi
preparat folosit pentru observarea unor structuri cu dimensiuni `n
lentil\
general de ordinul micrometrilor (10-6 m) format din:
obiectiv Partea optic\
optic\, care se compune dintr-un sistem de
iluminare [i dou\ sisteme de lentile convergente:
obiectivul cu distan]\ focal\ de câ]iva milimetri [i
ocularul, cu distan]\ focal\ de ordinul centimetrilor.
Sistemul obiectiv este alc\tuit dintr-un sistem
lentil\ centrat de lentile a[ezate `ntr-o anumit\ ordine `ntr-un tub
ocular metalic montat direct sau prin intermediul sistemului
revolver la partea inferioar\ a tubului microscopului.
Obiectivele au notat\ puterea m\ritoare care variaz\ `ntre
imagine x10 [i x90.
Sistemul ocular este alc\tuit dintr-un sistem de
lentile situate la partea superioar\ a tubului
a) Mersul razelor de
microscopului. Puterea m\ritoare a ocularelor care
lumin\ la microscop
variaz\ `ntre x5 [i x15. Exist\ microscoape monoculare
Fig. 4 (a, b) [i binoculare (cu dou\ oculare).
Microscopul optic Oc
- schem\

b) Este reprezentat\
schematic alc\tuirea
[i formarea imaginii
în microscop:

Oc = ocular; R
Ob = obiective;
R = sistem revolver;
Ob
Mv = macroviza; Pl
mv = microviza;
c = condensor; Mv
d = diafragm\; mv
l = surs\ de lumin\ c, d
(poate fi plasat\ [i la
exterior, `n fa]a
microscopului). l
3

obiectiv
u mediu cu
? indice n
preparat lamel\
lam\
Fig. 4
(c) Microscopul optic —
detaliu la nivelul
obiectivului
(d) Imagine de ansamblu
Puterea de rezolu]ie a
microscopului este limitat\ de
distan]\ minim\ ε. Astfel, `n
cazul microscopului optic ε
este de 0,38 µm. La valori mai
mici ale acestuia apar
fenomene de difrac]ie [i, deci,
nu mai este posibil\ formarea
unei imagini clare.
LUCRARE PRACTIC|
Sistemul de iluminare serve[te pentru a aduce
la obiectul examinat lumina de la o surs\ natural\ sau ar-
tificial\. Este situat sub platina microscopului [i se
compune din surs\ de lumin\ (natural\ sau, de obicei,
artificial\ - bec electric), oglind\, diafragm [i condensor.
Unele microscoape au un sistem de iluminare cu bec
situat `n piciorul microscopului [i oglinda deta[abil\.
Partea mecanic\ serve[te la sus]inerea p\r]ii optice
[i a obiectului examinat. Ea se compune din picior,
coloan\, platin\ [i un dispozitiv de punere la punct
format din [urubul macrometric [i cel micrometric.
Puterea m\m \ ritoare a microscopului este dat\ de
produsul dintre puterea m\ritoare a obiectivului [i cea a
ocularului. Microscoapele optice actuale ating o putere
m\ritoare de x2000.
c
Principalele m\rimi caracteris-
tice unui microscop optic:
Puterea de rezolu]ie
rezolu]i e (sau separatoare)
separatoare
reprezint\ calitatea cea mai important\ a unui microscop.
Ea reprezint\ capacitatea unui sistem optic de a separa
dou\ puncte apropiate (al\turate) astfel `ncât aceste
puncte s\ fie percepute distinct la nivelul imaginii finale.
Prin termenul general de rezolu]ie se `n]elege abilitatea
unui sistem optic de a detecta detaliile unui obiect.
Puterea de rezolu]ie este invers propor]ional\
propor]ional \ cu
minim \ ( ε ) `ntre dou\
distan]a minim\ dou \ puncte luminoase
luminoa se
ale obiectului, percepute separat. Prin urmare,
dac\ se noteaz\ puterea de rezolu]ie cu P, rezult\ c\
1
P= . Cu cât ε este mai mic cu atât puterea de rezolu]ie
ε
P este mai mare. Distan]a minim\ ε, denumit\ [i
distan]\
distan] \ minim\
minim \ rezolutiv\
rezolutiv \ sau minimum
separabil este dat\ de formula lui Abbé:
Abbé
1,22 λ
ε=
2n sin u
unde:
λ = lungimea de und\ a luminii utilizate la
microscop
n = indicele de refrac]ie al mediului (aer) prin care
trece lumina (dintre obiectiv [i lama din sticl\ pe
care se afl\ preparatul care este observat la
microscop)
4

~n condi]iile actuale,
pentru examenul `n lumina
alb\, jum\tatea unghiului
de deschidere maxim al
unui obiectiv neputând
dep\[i 71˚, distan]a mini-
m\ dintre dou\ puncte
care pot fi v\zute separat
este de 0,38 µm.
Din formula lui Abbé se
poate observa c\ puterea de
rezolu]ie se poate m\ri prin
utilizarea unei surse cu λ
cât mai mic, ca `n cazul
microscopului cu radia]ii
ultraviolete [i, `ndeosebi, `n
cazul microscopului
electronic (v. [i curs).
Fig. 5 Formarea imaginii la microscop
LUCRARE PRACTIC|
u = jum\tatea unghiului de deschidere a conului
luminos ce cade pe obiectiv (v. fig. 4c).
Se observ\ c\ ε este cu atât mai mic (iar rezolu]ia este
mai mare) cu cât n [i u sunt mai mari. M\rimea n X sinu
se nume[te apertur\
apertur \ nume
nu meri
me ric
ri c \ [i poate fi m\rit\ `n
dou\ moduri:
1. M\rind indicele de refrac]ie al mediului existent `ntre
obiectiv [i lama ce con]ine preparatul; astfel,
obiectivele sunt de dou\ feluri: uscate [i umede (cu
imersie), dup\ cum `ntre ele [i lamel\ exist\ aer (n =
1) sau un mediu cu indicele de refrac]ie mai mare
decât 1 (ex: ulei de cedru,
n = 1,52).
2. M\rind unghiul u, prin construc]ie (obiective cu
distan]a focal\ foarte mic\, care s\ poat\ fi apropiate
foarte mult de preparat).
Puterea separatoare a unui microscop optic este, deci,
limitat\ de lungimea de und\ a radia]iei utilizate (vizibil,
390 — 720 nm), de indicele de refrac]ie al mediului (care
nu poate dep\[i 1,5) [i de construc]ia obiectivului, care
impune o valoare maxim\ a unghiului u.
• Puterea de m\m\rire (P) este m\rimea numeric egal\ cu
raportul dintre unghiul u’ sub care se vede imaginea
la microscop [i m\rimea obiectului AB.
u'
P=
AB
Puterea de m\rire se exprim\ `n dioptrii [i este invers
propor]ional\ cu distan]ele focale ale obiectivului [i
ocularului.
• Puterea de p\ p\trundere este o calitate ce apar]ine
obiectivelor cu putere de m\rire mic\. Datorit\
acestei calit\]i se poate vedea `n profunzimea
obiectului examinat. Ea variaz\ `n raport invers cu
m\rimea unghiului de deschidere a obiectivului.
etin\\
retin
5
 LUCRARE PRACTIC|

☺ PARTEA PRACTIC|

c Principiul metodei
Se suprapune imaginea microscopic\ a obiectului
de m\surat peste imaginea unei sc\ri gradate etalonat\ `n
Ansamblul metodelor cu prealabil.
ajutorul c\rora se pot m\sura Se utilizeaz\ dou\ tipuri de micrometre (fig. 6):
dimensiunile obiectelor ocular [i obiectiv. Micrometrul obiectiv este o lam\ de
microscopice se nume[te
sticl\ pe care sunt marcate diviziuni echidistante cu
micro
microme
crometrie.
metrie.
valoare cunoscut\ de 10µµm. El serve[te la etalonarea
micro
microme
crometru
metrului
trului ocular;
ocular acesta este un disc de sticl\
Materiale necesare:
necesare introdus `n sistemul ocular [i la rândul lui are marcate

micrometru ocular diviziuni echidistante (sub form\ de re]ea). Imaginea lui

micrometru obiectiv este dat\ numai de lentila ocular, `n timp ce micrometrul

microscop optic obiectiv este m\rit de `ntreaga putere m\ri-toare a
microscopului.
A etalona micrometrul ocular `nseamn\ a stabili
o coresponden]\ `ntre o diviziune a micrometrului ocular
[i un anumit num\r de diviziuni ale micrometrului
obiectiv. ~n acest fel, diviziunile micrometrului ocular
pot fi exprimate `n unit\]i de lungime.

Mod de lucru: P
1) Se a[eaz\ pe platina microscopului lama
micrometru obiectiv (cu scala `n sus). Aceasta se fixeaz\
cu ajutorul celor doi cavaleri.

2) Realiza]i acum imaginea la microscop: se aduce

`n axul microscopului obiectivul x10 prin rotirea
sistemului revolver. Privind din lateral, se rote[te viza
macrometric\ spre `nainte [i se coboar\ tubul micros-
Fig. 6 copic pân\ ce obiectivul se apropie de preparat. Viza
Micrometrul ocular (cu p\trate) macrometric\ se mişc\ foarte `ncet. Apoi, privind prin
[i micrometrul obiectiv ocular, cu ajutorul aceluia[i [urub macrometric, rotit `n
10 20 30 sens invers, se ridic\ `ncet tubul pân\ ce apare imaginea
`n câmpul microscopului. ~n continuare se procedeaz\ la
completarea punerii la punct a imaginii cu ajutorul [uru-
bului micrometric care va fi mi[cat `n ambele sensuri. Se
recomand\ ca `ntotdeauna când examina]i un preparat la
microscop s\ ]ine]i permanent mâna pe [urubul
micrometric. Folosind obiectivul x10 se formeaz\
imaginea diviziunilor micrometrului obiectiv.

6

Fig. 10
Celule vegetale `n
mediul hiperton
Materiale necesare:

microscop binocular

lame [i lamele de sticl\

3 vase Petri

solu]ii cu osmolarit\]i
diferite :
- NaCl 9 g/l (mediu "izoton")
- NaCl 20 g/l (mediu "hiperton")
- ap\ distilat\ (mediu "hipoton")

pipete Pasteur

3 frunze (segmente de 2-3
cm) de Valisneria spiralis

lam\ pentru sec]ionarea
frunzelor [i realizarea
preparatului microscopic
LUCRARE PRACTIC|
☺ PARTEA PRACTIC|
a) Osmoza la alga Vallisneria spiralis
Utilizând microscopul optic, ve]i observa
modific\rile unor celule vegetale ( alga Vallisneria
spiralis) puse `n medii izoosmotice, hipoosmotice [i
hiperosmotice.
Cele mai evidente modific\ri apar `n privin]a
volumului [i formei celulare. Pentru a le observa ave]i
nevoie de a m\sura dimensiunile unei celule prin metoda
descris\ anterior, micrometria.
Mod de lucru: P
1) Se pun `n cele 3 vase Petri respectiv cca 20 ml mediu
hipoton, mediu izoton [i mediu hiperton [i `n fiecare
câteva frunzuli]e de plant\.
2) Se las\ astfel 20 minute dup\ care se examineaz\ la
microscop câte o frunz\ din fiecare mediu. Pentru a fi
examinat\ la microscop, frunza, a[ezat\ pe lama de
sticl\, se sec]ioneaz\ `n grosime (tangen]ial, cu o lam\ de
ras pentru a ob]ine un fragment cât mai transparent). Se
a[eaz\ fragmentul de frunz\ pe lama de sticl\, apoi se
a[eaz\ pe platina microscopului `n a[a fel `ncât frunza s\
se afle `n dreptul orificiului central al platinei. Se
folose[te obiectivul x10.
3) Se rote[te dispozitivul revolver [i se formeaz\
imaginea cu obiectivul x20, care a fost folosit [i pentru
etalonarea micrometrului ocular.
4) Se m\soar\ diametrul longitudinal [i transversal
pentru un num\r de 10 celule; datele se trec în tabel, `n
care:
I = mediu izo- osmotic;
II = mediu hipoosmotic;
III = mediu hiperosmotic;
L = diametru longitudinal;
T = diametru transversal
m = media aritmetic\
b) Osmoza la hematii
Pentru a pune `n eviden]\ fenomenul de osmoz\ la
nivelul biomembranelor, se poate realiza un experiment
asem\n\tor, dar de data aceasta utilizând eritrocitele;
7
 LUCRARE PRACTIC|
acestea reprezint\ un model de studiu deosebit de
I II III accesibil `n raport cu alte celule animale. ~n plus aceast\
L T L T L T alegere este dictat\ [i de frecventa varia]ie a volumului
1
celular, ca urmare a varia]iei presiunii osmotice, intra sau
2
extraeritrocitar, `n raport cu o larg\ categorie de st\ri,
fiziologice sau patologice, ale organismului (de exemplu
3 simpla manevr\ de injectare intravenoas\ a unor solu]ii
hipo- sau hiperosmolare poate avea un astfel de efect).
4

5 Mod de lucru: P
6 Ve]i observa dimensiunea transversal\ ("diametrul")
celulelor. Se va lucra cu 5 recipiente: `n A ave]i o
7 suspensie de eritrocite `n mediu izoosmotic lor (NaCl 9
g/l); `n B [i B1 ave]i solu]ii hipoosmotice de concentra]ii
8
diferite (NaCl 3 g/l [i respectiv 6 g/l); `n C ave]i solu]ie
9 izoosmotic\ (NaCl 9 g/l); `n D ave]i solu]ie
hiperosmotic\ (NaCl 40 g/l).
10
m 1) Pune]i cu o pipeta Pasteur câte 1 ml suspensie din re-
tabel de rezultate cipientul A `n fiecare dintre recipientele B, C, D.

2) ~n continuare, la anumite intervale de timp (precizate

`n tabel), ve]i lua câte o pic\tur\ din con]inutul recipien-
telor B, C [i D [i o ve]i examina la microscop.
pentru B 35 minute Ve]i remarca c\ celulele puse `n C (mediu izoosmotic)
pentru B1 nu-[i modific\ dimensiunile. Celulele puse `n D (mediu
35 minute
hiper-osmotic) se ratatineaz\ (`[i mic[oreaz\ diametrele
pentru C 20 minute [i cap\t\ un aspect crenelat). Celulele puse `n B1 [i
pentru D 30 minute scoase dup\ primul interval de timp sunt turgescente (au
intervale de timp diametrele m\rite) iar cele puse `n B sunt par]ial sau total
distruse (fenomenul de hemoliz\).

Descrie]i ce observa]i.

8
 LUCRARE PRACTIC|

t
~n organism, presiunea exercitat\ prin intermediul pistonului (`n fig.11) este `nlocuit\ de
presiunea creat\ de “pompa cardiac\” care men]ine o presiune hidrostatic\ superioar\ presiunii
oncotice (presiunea oncotic\ poate fi definit\ ca fiind presiunea osmotic\ determinat\ doar de
macromolecule, `n cazul `n care membrana este permeabil\ atât la ap\ cât [i la molecule mici) la
nivelul capilarelor glomerului renal. Aceasta determin\ un flux net de ap\ ([i microelemente) din
plasm\ spre exteriorul capilarului (spa]iul Bowman), fenomen de ultrafilatrare plasmatic\
(primul satdiu `n formarea urinii). Este u[or de `n]eles de ce, `n caz de hipotensiune arterial\
marcat\, presiunea hidrostatic\ din capilarele glomerulare devine inferioar\ presiunii oncotice [i
ultrafiltrarea renal\ se opre[te, clinic apãrând anuria.

a) b)

Fig. 11
a) Fenomenul de osmoz\; b) Fenomenul de osmoz\ invers\
Explica]ii în text.

9
 LUCRARE PRACTIC|

 D. Exerci]ii [i întreb\ri:

1. Un subiect de 60 kg prezint\ urm\toarele caracteristici:

- masa lichidelor extracelulare = 20 % din masa corpului
- masa lichidelor intracelulare = 50 % din masa corpului
Ionograma a permis evaluarea presiunii osmotice a plasmei: 280 mOsmoli/l.
a. Aceste cifre sunt normale?
b. Calcula]i presiunea osmotic\ în fiecare compartiment.
c. S\ consider\m c\ subiectul prime[te o perfuzie de NaCl intravenoas\ de 36,27 g în 2 litri de ap\.
În care sens se vor face deplas\rile de ap\ [i ce volum de ap\ va trece dintr-un compartiment în
altul, presupunând c\ membrana care separ\ cele 2 compartimente este impermeabil\ la ioni [i c\
subiectul nu elimin\ nici o cantitate de ap\. Care va fi presiunea osmotic\ a plasmei la echilibru?
( Se dau : Na+ = 23; Cl- = 35.5)

2. Se utilizeaz\ un epiteliu simplu asimilabil unei membrane biologice pentru a realiza un

osmometru.
2
Presiunea limit\ de ruptur\ a acestei membrane este de 1,013 x 105 N/m . Ce se întâmpl\ dac\ una
dintre fe]ele membranei fiind în contact cu apa pur\, cealalt\ este introdus\ în:
a. solu]ie de NaCl 4 g/l
b. solu]ie de uree 10 g/l
c. solu]ie de NaCl 1 g/l
Se dau: T = 27 °C
R = 8,32 joule/mol/Kelvin
2
g = 9,8 m/s
3. Calcula]i puterea rezolutiv\ limit\ în cazul unei surse de lumin\ verde (λ = 520 nm) la un
microscop cu imersie bun\ (apertura numeric\ = 1,6).
Cum este rezolu]ia în compara]ie cu a unui microscop cu apertura numeric\ = 0,65 [i lumin\ alb\
(0,55 x 10 —6m)?
4. Lichidele fiziologice, din corpul uman,
con]in mai mult\ sare decât apa dulce
(din râuri) [i mai pu]in\ sare decât
apa de mare. De ce în realitate nu se
produce efectul din figura 10?

Fig. 12
a) Ap\ de mare,
b) Ap\ dulce (râu)
a) b)

10