Lc 1 Metodele de studiere a structurii celulelor

1 Metode microscopice .Cu ajutorul aparatelor optice speciale (microscopul fotonic ,microscopul electric )se obtine o imagine
marita a unui obiect de mici dimensiuni si se determina structura fina a obiectelor .Metodele microscopice pot fi applicate atât
la stadiul celulei vii ,cât si la stadiul celulei fixate cu ajutorul agentilor chimici anorganici(bicromat de potasiu,acid cromic
etc),organici(alc.etilic,acetone etc)sau fizici (congelarea,deshidratarea etc).Microscopul fotonic mareste capacitatea de
revolutie a ochiului uman cu cca 1000 de ori .Aparatul foloseste lumina naturala sau artificiala .Imaginea obtinuta este marita si
inversata .În microscopia fotonica in cîmp intunecat se foloseste un condenser special cu fond negru pentru iluminarea cu raze
laterale .În microscopia fotonica cu contrast de faza se foloseste un condensor si un obiectiv special pentru inlaturarea
diferentelor de indici de refractie a luminii .În microscopia fotonica cu fluorescență se foloseste proprietatea unor substante de
a ilumina (fluorescență) sub actiunea radiatiilor ultraviolete.Microscopul electric foloseste ca sursa de lumina un fascicul de
electroni accelerate,iar rolul de lentil il indeplineste câmpul electric si magnetic .Imaginile formate pot depasi marimea
structurilor studiate de 250000-1000000de ori.Microscopul electric poate fi cu transmisie –imaginile sunt intr-un plan (pe
ecran )si baliaj –imaginile sunt tridimensionale (in spatiu)

2 Metode citochimice .Se utilizeaza substante chimice ce dau reactii de culoare(metoda Lugol) ,de precipitare a unor ioni
metalici (metoda Feulgen pentru AND) 3 Metode imunocitochimice.Se utilizeaza pentru determinarea substantelor cu
proprietati antigenice (proteine)prin formarea complexelor dintre aceste substante si anticorpi.4Metode cromatografice si
electroforetice.Se folosesc pentru separarea compusilor chimici –aminoacizi si proteine din omogenatele celulare.5Metode
enzimatice .Se utilizeaza pentru evaluarea enzimelor prin depistarea produselor activitatii sale .6Metoda citochimice se
folosesc pentru studiul compozitiei chimice a organitelor celulare (nucleul).7Autoradiografia .Se utilizeaza in evaluarea
macromoleculelor (proteine,acizi nucleici)prin marcarea compusului cu un element radioactive.8 Ultracentrafugarea
diferentiata .Se utilizeaza la studiul constituentelor celulare (organitelor) ca urmare a sedimentarii diferintiate in functie de
dimensiunea lor.9Criofractura si criodecopajul.se foloseste pentru studiul morfologiei membrane celulare ca urmare a
congelarii rapide la 160 grade C si a analizei amprentei pe suprafata ghetii .10 Culturi de celule in vitro.Se utilizeaza pentru
studiul interactiunii celulelor ,precum si al proceselor metabolice din celule .

Componentele microscopului OPTIC sunt :

Oculare,Tuburi oculare ,Prisma binoculara,Revolverul ,Coloana ,Viza macrometrica ,Viza micromerica ,Surubul condensorului
,Talpa microscopului,Suport pentru lumina artificiala ,Condensor,Masuta ,Obiectivul,Sistemul car mobil.

Ocularele(ocular) -Ele sunt sistemele de lentile cele mai apropiate de vizorul observatorului. Sunt cilindri goi în
partea superioară a microscopului echipat cu lentile convergente. În funcție de existența unuia sau a doi oculare,
microscoapele pot fi monoculare sau binoculare. Obiectivele prezintă în alcătuirea lor un sistem de lentile
convergente fixate într-o armătură metalică, ce se înșurubează în orificiile calotei inferioare a revolverului. Microscopul
prezintă obiective uscate cu putere de mărire: 6x, 10x, 20x, 40x și obiective cu imersie (ulei de cedru, glicerină) cu
putere de mărire de 90x. Tubul ocular-Are o formă cilindrică și în interior este negru pentru a evita disconfortul
reflexiei luminii. Capătul tubului este locul unde sunt plasate ocularele.
Revolverul-Este o piesă rotativă în care obiectele sunt înșurubate. Când rotim acest dispozitiv, țintele trec prin axa
tubului și sunt plasate în poziție de lucru. Se numește revolver de zgomotul produs de pinion pentru a se potrivi într-
un loc fix.Coloana-este piesa de pe spatele microscopului. Atașat la tub în partea superioară și în partea inferioară este atașat
la piciorul dispozitivului. Măsuța microscopului sau platina este un dispozitiv de formă rotundă sau pătrată, pe care se fixează
preparatul de examinat. În centru prezintă o deschidere circulară sau elipsoidală prin care trec razele de lumină spre preparatul
de cercetat. Măsuța microscopului se poate deplasa în plan orizontal în vederea examinării preparatului pe toată suprafața sa,
cu ajutorul a două șuruburi (vize) concentrice ce se află sub măsuța microscopului, în partea dreaptă. Pe fața superioară a
măsuței se găsește un dispozitiv special de prindere a lamei port obiect precum și două rigle cu ajutorul cărora se stabilesc
coordonatele preparatului. Talpa sau piciorul microscopului asigură stabilitatea aparatului, fiind confecționată din metal greu.
În talpa microscopului se găsește montată sursa de lumină. . Coloana sau brațul microscopului este atașată la piciorul
microscopului printr-un dispozitiv de articulație și la ea sunt montate măsuța sau platina microscopului, tubul microscopului și
dispozitivul de punere la punct a imaginii. Dispozitivul de punere la punct a imaginii este reprezentat prin două șuruburi, care
poartă denumirea de vize: - viza macrometrică, prin a cărei rotire se coboară sau se ridică tubul microscopului, imprimând o
cursă rapidă, cu pas mare, având rol în prinderea imaginii; - viza micrometrică, ce imprimă o mișcare lentă și redusă, fiind
folosită pentru punerea la punct a imaginii. Sistemul de iluminare se compune din sursa de lumină, diafragme, lentile, prisme,
filtre de lumină.Sistemul mecanic de reglaj -Orice microscop prezintă un stativ pe care sunt dispuse sistemul optic, de iluminare
şi măsuţa cu proba. Prin sisteme şurub – piuliţă, sursa de lumină şi diafragmele au posibilităţi de centrare faţă de axul optic,
ceea ce asigură o iluminare perpendiculară, uniformă.
 Principiile de baza in timpul lucrului la microscop

Pentru utilizarea corectă a microscopului și o examinare adecvată a preparatului microscopic este necesar de a parcurge, intr-o
ordine anumita, o serie de etape, fară care studiul poate deveni mai dificil. 1. Lucrul cu microscopul se desfășoară şezându-se
pe scaun. 2. Inainte de a începe lucrul este necesar de controlat microscopul dacă nu sunt defecte tehnice vizibile. 3. Cu o cârpă
moale și curată de șters componentele optice a microscopului. 4. Microscopul se pune în fața utilizatorului, puțin în
stânga(dreapta) la o distanță comodă de la marginea mesei. In timpul lucrului microscopul nu se mişcă. 5. De conectat
microscopul la rețeaua de curent de 220V şi de apăsat butonul electrie pentru a aprinde lumina artificială. 6. De deschis
diafragmul iris și de ridicat condensorul la maximum (aproape de suprafața platinei). 7. Utilizând macroviza de coborât măsuța
microscopului. 8. Preparatul microscopic, după ce a fost șters, se aşează pe măsuța microscopului, între lamele metalice ale
sistemului "car mobil", astfel încât colțurile lamei să fie perfect ataşate de acestea. Este de menționat că preparatul histologic
permanent se așează cu lamela în sus. 9. Apoi prin rotirea şuruburilor laterale ale sistemului "car mobil" de adus în dreptul
axului optic regiunea preparatului microscopic cu fragmentul care trebuie examinat. 10. Prin rotirea celor două macrovize cu
ambele mâni, în acelaşi sens, și în acelaşi timp, de ridicat măsuța microscopului până când distanța dintre lentila frontală a
obiectivului și lamela preparatului histologic va fi de aproximativ 0,4-0,9 cm. 11. Apoi se reglează distanța interoculară prin
apropierea sau îndepărtarea celor două tuburi oculare, astfel încât să putem privi cu ambii ochi, în același timp, la un singur
câmp microscopic bine delimitat.12, In continuare, privind prin oculare (ocular), rotim macroviza pâna când va fi observată in
câmpul microscopic o imagine clară a preparatului examinat. 13. de menționat că folosirea macrovizei încetează în momentul
prinderii unei imagini clare cu un obiectiv de putere mică de marire. 14. Pentru reglarea luminozității microscopice rotim
şurubul condensorului, ridicându-l sau coborându-l pe acesta. 15. Lucrul cu microscopul începe cu folosirea obiectivelor cu
puterea mică de mărire: x4; x10. 16. Dacă în câmpul mieroscopic nu apare nici o imagine este necesar de repetat toate
manipulațiile expuse anterior în punctele 6, 7, 9, 10, 12, 14, 15. 17. Dacă se doreşte observarea unor detalii structurale ale
preparatului examinat, obiectivul cu putere mică de mărire se înlocuieşte cu obiectivul cu putere mare de mărire, realizând
această manipulație prin răsucirea simplă a sistemului de revolver, până se aduce în câmpul de observație a obiectului dorit
(Figura 2). 18. Clarificarea imaginii la obiectivul cu putere mare de mărire se face doar prin intermediul I microvizei. 19. În
situația când se examinează preparatul cu obiectivul de imersie, se ține cont de următoarele manipulații: -după ce preparatul
examinat a fost adus în dreptul axului optic a câmpului microscopic, pe suprafața lamei în zona preparatului studiat se depune
o picătură de ulei de imersie. -apoi, privind din lateral, ridicăm măsuța microscopului, folosind macroviza, până când lentila
frontală a obiectivului de imersie va intra în contact cu picătura de ulei. -din acest moment, se ridică la maximum condensorul și
privindu-se prin oculare se face clarificarea imaginii cu ajutorul microvizei. 20 După examinarea preparatului microscopic se
coboară măsuța microscopului, prin folosirea macrovizei, cu 1-2 cm şi se îndepărtează preparatul histologic de pe măsuța
microscopului. În cazul utilizări obiectivului de imersie, lentila frontală a obiectivului și preparatul histologic, obligatoriu, se
șterg cu cârpa înmuiată în benzen. 21 După folosire microscopul se deconectează de la rețeaua electrică și se acoperă cu husa
din polietilenă.

Etapele de pregatire a preparatelor microscopice

Preparatele microscopice pot fi: frotiuri, amprente de organe, preparate microscopice temporare și permanente. Pentru studiul
celulelor, tesuturilor şi organelor, în scop de diagnostic sau cercetare se folosesc preparate microscopice temporare şi
permanente. Pentru a pregăti un preparat pentru microscopie este necesar de a efectua unele procedee sau etape după cum
urmează : 1. Recoltarea. 2. Fixarea fragmentului recoltat. 3. Condensarea materialului biologic fixat. 4. Secționarea la
microtom. 5. Colorarea. 6. Montarea în balsam. 1. Recoltarea. Prelevarea probelor biologice, destinate pregătirii pentru
microscopie, poate fi efectuată de la plante, animale vii sau de la cadavre. În cazurile recoltării materialului biologic de la
animalele vii se recurge la: biopsie, endoscopie, frotiuri, amprente de organe, puncție și recoltarea intraoperatorie. Recoltarea
post-mortem se efectuează de la animale de experiență, sacrificate de necesitate, în scop de diagnostic sau cercetare și de la
cadavre (in cazul dat materialul trebuie să fie recoltat imediat după sacrificare sau moartea animalului, pentru a evita instalarea
modificărilor structurale ale țesuturilor). Întotdeauna, recoltarea începe de la organele uşor alterabile: sistemul nervos central,
glandele endocrine și exocrine, analizatorii, miocardul (15-30 min. după exitus), apoi organele parenchimatoase, cele cavitare,
muşchii, formațiunile cartilaginoase și fragmente osoase, intr-un interval de timp de până la 1 oră după moartea animalului/
individului. Dimensiunile fragmentului recoltat se stabilesc în funcție de mărimea organului și a fixatorului utilizat ulterior. În
cazurile organelor parenchimatoase dimensiunile sunt aproximativ de 0,5-1cm3, la organele cavitare și foițe membranoase 1-
2cm3, la vase sanguine și nervi de 1- 2cm3,la vasele sanguine si nervi de 1-2 cm,etc. Toate piesele recoltate trebuie să fie
numerotate și înregistrate (se scrie data, Nr de identitate, denumirea organului etc.). 2. Fixarea fragmentului
recoltat. Fixarea materialului recoltat are rolul de a menține caracteristicele țesuturilor prezente în momentul prelevării
probelor. Fragmente se pun în substanța fixatoare pe un timp optim de fixare de 1-3 zile. Tipurile de substanțe fixatoare și
timpul optim de fixare trebuie să fie alese diferit, în funcție de natura compuşilor chimici ce trebuie conservați și de reacția de
culoare care trebuie să fie obținută. Astfel, pentru fixarea proteinelor şi în cazul folosirii unor coloranți uzuali se folosesc fixatori
SIMPLI: formolul cu timpul optim de fixare 1-3 zile, acetona - 1-3 ore, alcoolul etilic 1-24 ore. Pentru fixarea lipidelor, glucidelor
sau acizilor nucleici, se utilizează amestecuri fixatoare (COMPUŞI): SUSA - 1-24 ore de fixare, RAMONY CAJAL -1-2 zile ect. Dacă
fixatorii utilizați conțin substanțe care vor influența negativ, în continuare, la pregătirea preparatului, piesele de material
biologic este necesar de a le spăla în apă curgătoare. 3. Condensarea materialului biologic. Procesul de condensare
a materialului biologic permite formarea piesei biologice cu o așa densitate care va prevede ulterior obținerea secțiunilor
preparatului histologic cu o grosime de cca 6µm. Condensarea preparatului poate fi obținută prin: - înghețarea materialului
biologic. - includerea în parafină. Având în vedere că cel mai des pentru condensarea preparatului biologic se folosește
metoda includerii în parafină, aceasta va fi descrisă ulterior. Pentru a include materialul recoltat în parafină este necesar de a
desfăşura un ansamblu de operațiuni reprezentate în felul următor: Deshidratarea - se execută prin trecerea pieselor recoltate
prin băile de alcool etilic, în concentrații crescande (70°, 80°, 90°, 96° și alcool etilic absolut – 100 de grade). În fiecare baie
piesele ținânduse aproximativ 6-8 ore. Nu se recomandă trecerea bruscă a pieselor în concentrațiile mai mari de alcool etilic (de
exemplu de la 70° în 96°). Clarificarea - această etapă se caracterizează prin îndepărtarea alcoolului etilic din piese și înlocuirea
lui cu o substanța miscibilă atât cu alcoolul, cât și cu masa de incluzie. Pentru această operațiune se utilizează alcoolul amilic sau
benzenul, folosindu-se 3 bãi în care piesele se lasă 6- 8 ore, la o temperatură de 37°C. –Impregnarea- piesele sunt ținute într-o
baie ce contine un amestec de alcool amilic sau benzen cu parafina lichidă 1:1 (se tine în termostat la 56°C) Apoi piesele se
introduc într-o baie de parafina simplă unde se lasă 4 ore. Apoi piesa se introduce într-un amestec de parafina simpla cu 5%
ceară de albine și se menține în termostat 4 ore la 56°C.- Turnarea blocului – parafina lichidă se toarnă într-o tăviță metalică,
după care se aşeaza piesele pe fundul tăviței în șiruri paralele, distanțate la 1,5 cm. -Răcirea și modelarea - blocul de parafină
obtinut, se lasă la răcire treptată, minim 12 ore. După răcire blocul se împarte în blocuțele paralelipipedice formate dintr-o
singură piesa. Blocuțele, dacă este necesar, se fixează de o plăcuță din lemn, care va permite fixarea piesei de port-obiectul
microtomului. 4. Secționarea la microtom. Pentru pregătirea secțiunilor din blocul cu piesa inclusă, se utilizează
microtomul de parafină (microscopia optică) și ultramicrotomul la piese înghețate (microscopia electronică) . Cuțitele speciale
ale microtomului permit obținerea secțiunilor cu diferite grosimi: > 3-8 µm – din piese incluse în parafină; > 10-25 µm - din
piesele înghețate în camera a crio-microtomului; > 0,08-0,1 µm – din piesele pregătite în mod special pentru microscopia
electronică. Tipurile de microtoame : Sanie, Rotativ ,Criostat, Crioultra- microtom. Microtom sanie MS-2 pentru piese incluse
in parafin .Microtom rotativ MPS- 2 pentru piese incluse în parafin. Microtom pentru pentru piese incluse in parafin. Microtom
criostat - pentru pregătirea secțiunilor la temperatura -20°C se utilizează in histochimie și imunocitochimie .Crioultra-microtom-
microtom pentru microscopie electronică . În cazul metodei de condensare (includere în parafină) secțiunile obținute se
selectează și se stochează pe un suport de culoare închisă pentru aprecierea calității. In urmare, secțiunile alese se mută în apă
încălzită la o temperatură de 50°C. Aceasta operațiune va permite lipirea secțiunilor pe lame curate, ce au aplicate pe suprafața
lor o peliculă de ovalbumină Mayer. Lamele se spală cu apă și se tin în termostat 10 minute la 37°C să se usuce. 5 Colorarea
sectiunilor obtinute permite stabilirea unui contrast optim intre diferite componente celulare si tisulare pentru evidentierea
selective a unor elemente intercelulare etc.Metode de colorare : Clasice,Speciale, Histochimice,Impregnarea .Tipuri de
coloranti: Bazici (bazofili) – coloranții cu ajutorul cărora se identifică ( în mod special ) nucleul celular se numesc coloranți
nucleari: hematoxilină (colorează în albastru-violet); carmina (roşu-deschis); safranina (roşu închis); azura II (violet). Acizi (oxifili)
-coloranții cu ajutorul cărora se identifică citoplasma celulară și structurile celulare cu polaritate pozitivă - proteine: eozina
(colorează în roz sau roşu). Naturali- se obțin prin amestec de coloranți bazici cu cei acizi, ca exemplu hematoxilina- eozină cu
albastru de metilen. Se utilizează pentru identificarea țesuturilor conjunctive și formațiunilor vasculare. Hematoxilin-eozina
oferă o rapiditate de executare și obținere a imaginei clare cu evidențierea structurilor suficiente pentru examinare.
Metacromazie - însuşirea de a se colora diferit în raport cu colorantul utilizat sau cu țesuturile din jur . 6 Montarea în
balsam. Pentru formarea preparatelor histologice permanente piesele colorate se montează conservanți transparenți
(balsam CANADA, ABIES, substanțe sintetice). Pe preparatul clarificat se depun câteva picături de balsam. Peste câteva minute
xilenul care este prezent în balsam se evaporează și preparatul devine montat în substanța dură și transparentă cu o refracție
asemănătoare cu cea a sticlei. Pentru preparatele care necesită o păstrare mai îndelungată, pe preparat, după depunerea
balsamului, se aplică lamela astfel în cât să se evite formarea bulelor de aer.

Deosebirile dintre microscopul optic si cel electric

Microscoapele optice nu vor putea da imagini clare ale unor obiecte cu dimensiuni mai mici de circa 0,15 µm,dar cu ajutorul
microscopului electronic putem examina structuri celulare de mici dimensiuni, denumite ultrastructuri (complexe
macromoleculare și organite). Puterea separatoare a putut fi sensibil marita cu ajutorul microscopului electronic, deorece
lungimea de unda a undei asociate electronului este mult mai mica decat a radiatiilor vizibile sau ultraviolete utilizate de
microscopul optic.Din punct de vedere constructiv, microscopul electronic are o structura mult mai complexa decat
microscopul optic. Totusi, partile principale ale microscopului electronic indeplinesc aceleasi functii ca si lentilele microscopului
optic. Microscopul electric - folosește un fascicul de electroni în locul unui fascicul de lumină.

Caracteristiciile prin care se deosebesc Microscop optic Microscop electronic

Spectrul electromagnetic FOTONI- spectrul vizibil ELECTRONI
Lentile (sisteme de modulare a sticlă electromagnetice
undelor)
Puterea de rezoluție 0,2 µm (200 nm) 0,002 nm (2pm)
Puterea de mărire maximă x 2.000 x 10.000.000
Imaginea este produsă de o sursă de sursă de lumină albă / UV / LASER sursă de electroni
radiații
Proiecția imaginii directă ochiul uman / film fotografic / indirectă ecran fluorescent / film
camere video de înaltă rezoluție /camere video de înaltă rezoluție
Imagini colorate de cele mai multe ori nu
Mediul de examinare aer vid
Preparatul examinat celule fixate sau vii Celule fixate
Includere (consitență) parafină / înghețare rășini (plastic) / vitrificare
Grosimea secțiunii ~ 5 µm ~ 50 nm
Suport pentru preparat lama de sticlă grilă de cupru