Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Editura
SfntulAlbu
Ierarh Nicolae
ISBN 978-606-577-071-3
MICROSCOPIE GENERAL
Examinarea microscopic a produselor alimentare i furajere
GHID DE EXAMINARE
Examinarea microscopic
este o metod aplicat
pentru identificarea, pe baza
MICROSCOPIC
caracterelor microscopice caracteristice sau prin compararea cu o mostr de
referin, a componentelor normale sau strine din produsele alimentare sau
furajere. Aceste produse pot fi materii prime, adjuvani sau produse finite.
Prin component strin se nelege orice material diferit de structura normal a
produsului, i a crui prezen este condiionat de deficiene de prelucrare,
depozitare sau transport a produsului respectiv. In aceast categorie intr materiale
de contaminare, rezultate n urma fenomenelor de descompunere (texturi degradate
n urma unor aciuni de natur parazitar sau a unor fenomene fizico-chimice,
parazii sau fragmente ale acestora, etc.), materiale din mediul de prelucrare (nisip,
pamnt, fragmente de sticl, rugin, lemn, plastic, textile, metal, etc.) sau alte
corpuri organice sau anorganice (fragmente de insecte, fire de pr, dejecii ale
insectelor, pasrilor sau animalelor, oase, pene, cristale, etc.).
Examinarea microscopic are ca scop identificarea acestor componente prin
comparatie sau pe baza unor caractere identificabile la microscop. Acest mod de
examinare este facilitat de efectuarea unor teste suplimentare bazate pe reacii
chimice i care pot ajuta la confirmarea identitii structurilor examinate.
Aparatur si echipament de laborator
Pentru
-2-
luminos pentru a face legtura ntre obiectiv i ocular. La corpul de legtur este
ataat tubul binocular i un ghidaj prismatic sau cu elemente de rostogolire n care
intr revolverul cu obiectivele (fig. 1).
Preparatul pentru examinare care mai este denumit i obiect, este aezat de
regul, pe o lam portobiect din sticl. Preparatul poate fi examinat direct sau poate
fi acoperit cu o lamel din sticl, de indice de refracie (n) i grosime standardizate
(d)1. Pentru acurateea examinrii este recomandat numai utilizarea lamelor i
lamelelor standardizate.
Valorile standard sunt d= 0,17 mm i ni= 1,524 pentru lamele iar pentru lame d = 1 mm.
-3-
-4-
1.1.2. Obiective
Obiectivele (fig. 1) sunt fixate n revolver cte patru sau cinci (n funcie de
tipul constructiv) i au puteri de mrire diferite. Puterea de mrire este notat pe
partea
exterioar
tubului
obiectivului,
alturi
de
apertura
numeric
Fig. 4.
marcajele acestora.
Pe suprafaa extern a tubului obiectivului se gsesc
marcate indicative
-5-
lentilele care
compun obiectivele
Tipul obiectivului
Aberaie sferic
Aberaie cromatic
2
3
-6-
d =
Unde :
(1 / 2)
NA
(1)
d = limita rezoluiei
= lungimea de unda a luminii transmise
NA = apertura numerica
-7-
Acromat
Plan
acromat
Plan
fluorit
Plan
apocromat
Putere de mrire
(magnificaie)
Apertura
numeric (NA)
Distana de
lucru (mm)
Codul de
culoare al
obiectivului
4x
10 x
20 x
40 x
60 x
100 x
0.5 x
1x
2x
4x
10 x
20 x
40 x
50 x (ulei)
100 x (ulei)
40 x
100 x
4x
10 x
20 x
40 x
40 x (ulei)
60 x
100 x
100 x (ulei)
2x
4x
10 x
20 x
0.10
0.25
0.40
0.65
0.80
1.25
0.02
0.04
0.06
0.10
0.25
0.40
0.65
0.90
1.25
0.65
0.90
0.13
0.30
0.50
0.75
1.30
0.85
0.90
1.30
0.10
0.20
0.45
0.75
30.00
6.10
2.10
0.65
0.30
0.18
7.00
3.20
7.50
30.00
10.50
1.30
0.57
0.40
0.17
0.48
0.26
17.10
16.00
2.10
0.72
0.20
0.30
0.30
0.20
8.50
15.70
4.00
1.00
Rosu
Galben
Verde
Albastru deschis
Albastru cobalt
Alb
Negru
Maron
Rosu
Galben
Verde
Albastru deschis
Albastru deschis
Alb
Albastru deschis
Alb
Rosu
Galben
Verde
Albastru deschis
Albastru deschis
Albastru cobalt
Alb
Alb
Maron
Rosu
Galben
Verde
Codul de
culoare
suplimentar
(imersie)
Negru
Negru
Negru
Negru
-
-8-
40 x
40 x (ulei)
60 x
60 x (ulei)
60 x (apa)
100 x (ulei)
0.95
1.00
0.95
1.40
1.20
1.40
0.14
0.16
0.15
0.21
0.22
0.13
Albastru deschis
Albastru deschis
Albastru cobalt
Albastru cobalt
Albastru cobalt
Alb
Negru
Negru
Alb
Negru
identificarea
structurilor
componentelor
examinate
este
util
microscopul
de
acest
tip,
-9-
BHg 50 C- Hg 100
centrarea cu dispozitivul CF se
nclinaie n plan vertical. In acest scop se folosete n locul unuia dintre oculare o
lunet special cu care se poate vizualiza poziia inelului de faz. Reglarea se face
pn la fixarea acestui inel n centrul cmpului vizual.
4
- 10 -
microscopul polarizant
B) Fragment de sticl
- 11 -
1.2 Stereomicroscopul
1.3
Stereomicroscopul este compus, n principiu, din aceleai piese ca i
microscopul, cu deosebirea c examenul obiectului se face prin iluminare
reflectat. Practic, este o lup de examinare dar care are capacitatea de mrire
mult mai mare.
- 12 -
Plan acromat
Plan apocromat
Putere de mrire
(magnificaie)
0.5 x
0.75 x
1x
1.5 x
2x
0.5 x
1x
1.6 x
Apertura
numeric (NA)
0.045
0.68
0.09
0.14
0.18
0.066
0.13
0.21
Distana de lucru
(mm)
155
117
84
50
40
136
54
24
Codul de culoare al
obiectivului
Rou
Galben
Alb
Verde
Albastru
-
Exist stereomicroscoape la care se obin magnificaii n trepte prin rotirea unui cursor.
Exist i productori care nu folosesc sistemul de codificare al obiectivelor.
7
Sunt prezentate specificaii pentru obiective obinuite, folosite n laboratoarele biomedicale.
6
- 13 -
negre8. Iluminarea se face de preferin cu o surs de cel mult 30 W iar sursa poate
fi configurat lateral, frontal sau combinat. Rezultate optime se obin la iluminare
simultan lateral i frontal (fig. 10) :
Identificarea microscopic
Stereomicroscoapele sunt prevzute cu un disc opac cu dou suprafee (alb/negru) care acoper masa. portobiect
- 14 -
2.1.1 Sitarea
Pentru separarea diferitelor componente prin sitare se folosesc dou tehnici :
sitarea uscat i sitarea umed. In primul caz se face sitarea amestecurilor uscate,
alctuite din componente de dimensiuni
diferite sau a amestecurilor obinute prin
mcinare i uscare. In cazul sitrii umede
se folosesc site cu diametrul de cel puin
15-20 cm (cu ochiuri de 60, 100, 150
m)9. Sitarea se efectueaz sub curent de
ap cald (50-600 C) meninnd sita la
~300 nclinaie. In funcie de natura componentelor separate, este opional
adugarea de detergent10, caz n care splarea se efectueaz pn la ndeprtarea
complet a spumei rezultate. Reziduul rmas pe sit este uscat i apoi transferat
cantitativ cu o soluie alcoolic ntr-un pahar curat. Dup separarea i uscarea
reziduului obinut, acesta poate fi supus unei etape de hidroliz acid sau bazic.
2.1.2 Filtrarea
Filtrarea
este
utilizat
pentru
separarea
- 15 -
anumite cazuri, cnd sedimentul este foarte fin iar filtrarea dureaz prea mult, se
poate aplica filtrarea sub vid n plnie Hirsch sau n filtru ceramic. In situaiile
cnd coninutul de substane grase sau coloizi ngreuneaz filtrarea, se folosete
apa fierbinte pentru splarea filtrului11, iar n situaiile cnd amestecul conine
substane amidonoase se folosete soluie fierbinte de HCl 1-2%.
care
va
examinat
sistematic
pentru
identificarea
cu
ajutorul
sitelor
standard
cu
11
In funcie de metoda utilizat se pot folosi i solveni organici care dizolv grsimile i uureaz filtrarea.
- 16 -
12
13
- 17 -
- 18 -
este
construit
sub
forma
unei
plcue
metalice
(pentru
- 19 -
micrometrului ocular (fig. 14). Dac, spre exemplu, s-au numrat 3 gradaii de 0,1
mm de pe micrometrul de mas corespunztoare prin suprapunere la 1 gradaie pe
micrometrul ocular, rezult c pentru fiecare gradaie de pe micrometrul ocular
corespund 0,3 mm n cmpul vizual.
- 20 -
diametrul
cmpului
vizual
este
de
aproximativ 1600 m (fig. 16). n cazul n care vom trece la un alt obiectiv se
poate face un calcul rapid : spre exemplu la un obiectiv de 40 x (400 x) se va
calcula 100/400 x 1600 = 400 m. n acest caz diametrul cmpului vizual va fi de
~400 m.
- 21 -
(2)
ni
Fig. 16. Elementele de msurare pe orizontal i n adncime (la dou modele de microscop).
- 22 -
Fig. 17. A imagine corect ; B -imagine la care s-a utilizat puterea de mrire a
obiectivului camerei de luat vederi.
- 23 -
ALEGEREA OCULARULUI ( 7 x
10 x
16 x )
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
- 24 -
- 25 -
Orz
Porumb
Secara
Clasa de
Corpuri
Al t e
Corpuri
Alte
Corpuri
Alte
Corp uri
Alt e
puritate
inerte
seminte
inerte
seminte
inerte
seminte
inerte
seminte
II
1-3
24
24
2-5
12
2-3
1-2
23
III
Article I.
- 26 -
18
- 27 -
19
- 28 -
B. Examinare general
Proba omogenizat se ntinde n strat subire21 pe o tvi i se examineaz cu
ajutorul lupei. Seminele identificate sunt apoi examinate la stereomicroscop unde
se noteaz dimensiunile, culoarea, forma i aspectul capsulei. La foarte multe
specii ornamentaia capsulei permite identificarea. Este util secionarea seminei
longitudinal/transversal cu ajutorul unui bisturiu sau lame i separarea stratului
aleuronic ataat capsulei. Examinarea la microscop22 a capsulei poate da indicaii
asupra speciei in funcie de forma i dispunerea celulelor n straturi. Pentru
fragmentele de semine, o mic poriune de prob (sau fracia de pe sit) se
amestec cu puin ap i se examineaz la stereomicroscop in lumin normal.
20
21
- 29 -
- 30 -
- 31 -
(11)
i se nclzete
(13)
unei fracii de
Un test
Examenul n fluorescen
Pentru examenul n fluorescen se utilizeaz stereomicroscopul i
microscopul compus. Tehnica de iluminare a preparatului poart numele de epifluorescen i se rezum la observarea culorii fluorescente dup excitarea
preparatului cu o lumin ultraviolet incident. Utilizarea tehnicii de examinare in
fluorescen poate fi foarte util pentru stabilirea originii esuturilor examinate sau
identificarea tipurilor de semine. Foarte multe structuri ale esuturilor vegetale, n
special cele de depozitare, prezint fenomenul de autofluorescent la tratamentul
cu reactiv Schiff25. Este foarte important alegerea corecta a colorantilor utilizati
tinnd cont de structurile care vor fi evidentiate. Astfel, pentru colorarea
proteinelor sunt utilizate safranina, eozina, fucsina acida, acridin orange,
acriflavina, pentru colorarea lipidelor se utilizeaza Rosu si Albastrul de Nil, Sudan,
25
- 32 -
verde luminos, iar pentru colorarea amidonului Rosu de Congo, acidul periodic,
solutia Lugol, etc. Culorile obtinute la colorarea acestor structuri trebuie sa fie bine
cunoscute pentru a putea face caracterizarea corect a preparatului.
26
- 33 -
27
FL =examen in fluorescenta
- 34 -
- 35 -
28
- 36 -
mai multe informaii dect examinarea structurilor, de cele mai multe ori amorfe,
ale endospermului sau cotiledonului.
- 37 -
- 38 -
- 39 -
- 40 -
- 41 -
- 42 -
sau
de
3-5
rile
Directive 2002/32/EC of the European Parliament and of the Council of 7 May 2002 on undesirable substances in
animal feed (E.C.O.J. n L 140 of 30/5/2002,
- 43 -
este cultivat si in scop comercial pentru uleiul nevolatil (90% acid ricinoleic)
extras prin extractie cu solventi din seminte sau prin presare.
Producia de semine de ricin n scopuri industriale (1,05 Mt) este
preponderent
India i China i
mai
important
puin
in
Brazilia. Uleiul2 de
ricin este folosit de
foarte mult timp ca
purgativ dar are si multe alte utilizri comerciale, cum sunt fabricarea maselor
plastice, textile, vopsele sau cosmetice. Ricinul are toxicitate ridicata din cauza
continutului n ricin, o glicoprotein hidrosolubil foarte concentrat in
endospermul semintelor3 dar prezenta in cantitati mai mici si in celelalte portiuni
ale plantei. Este considerat unul dintre cele mai puternice toxice naturale 4. Exist o
mare variabilitate n privina sensibilittii la toxin.
Uleiul ca atare nu este foarte toxic, semintele macinate intregi contin toxina.
Insotita de un alcaloid (ricinina).
4
Actioneaza prin inactivarea ribozomilor .
3
- 44 -
- 45 -
asemanatoare
celei
asociate
iritatiei
- 46 -
- 47 -
trecut,
mai
multe
specii9
de
- 48 -
- 49 -
13
Contine acid linolenic 30-40%, acid eicosenic 15% si acid erucic <4% compozitie asemanatoare celui de in
Referitor la speciile alimentare.
15
In afara glucozinolatilor (care se gasesc in mai multe specii de Brassica) nu contine alte substante cu
potential toxic pentru animale.
14
- 50 -
6. Semintele de mustar16
Familia de plante cunoscute sub numele generic de mustar cuprinde mai multe
specii si subspecii17 ale acestora. In aceasta grupa sunt incluse rapita 18 (canola) si
mustarul dar acestea sunt denumiri comerciale si nu stiintifice. Familia
mustarului este de fapt Brassicaceae19 (Cruciferae) si este una dintre cele mai
bogate, cu peste 40 de genuri si peste 200 de specii salbatice si cultivate.
Taxonomia speciilor listate in anexa a fost revizuit, astfel c n prezent, nu exist
distinctie ntre diversele subspecii de Brassica juncea. In consecinta, subspeciile
denumite Indian, brun, chinezesc sunt considerate simple varietati de
Brassica juncea iar mustarul sareptian apare ca un termen a crui existent este
legat doar de contextul directivei.
6.1. Brassica juncea (L.) (mustar indian, chinezesc sau brun)
16
- 51 -
Continutul de substante toxice este reprezentat, ca important, de sinigrina (2propenil-glucozinolat) care dup hidroliza enzimatic (mirozinaza) se transform
n alil-izotiocianat22. Sinigrina se regseste n ntreaga plant cu variaii de continut
in timpul diferitelor faze de vegetatie si culminnd cu acumularea in seminte pe
timpul formrii si maturrii acestora.
Cu seminte galbene
Spre deosebire de B. nigra, aceasta putea fi recoltata mecanizat.
22
Lichid volatil cunoscut ca ulei de mustar
21
- 52 -
- 53 -
saponine27.
La
acest
nivel
de
25
- 54 -
28
- 55 -
cantitativ.
Amigdalina
are
prunasina32
iar
apoi
prin
31
- 56 -
Resturile rmase dup extragerea uleiului din ghind erau utilizate pentru
fabricarea de turte pentru furajarea animalelor. Semne de intoxicatie au fost
raportate atunci cnd s-au utilizat turte cu un continut ridicat de coji, administrate
la discretie.
37
In anexa directivei apare doar Fagus silvatica dar pentru ca se mentioneaza ghinda si jirul mpreun, am facut
referire si la Quercus robur (stejar).
38
In anexa sunt mentionate fructele ntregi (nedecorticate)
- 57 -
39
Se cunosc cazuri si la om
In 1985 a fost identificata temulina care s-a dovedit mai trziu un artefact de izolare.
41
Studiile de toxicitate individual asupra alcaloizilor au demonstrat o slab toxicitate iar efectele asupra SNC se
obtin prin efect cumulat al mai multor alcaloizi.
40
- 58 -
- 59 -
Cele mai multe cazuri de intoxicatie se produc prin administrarea de fn sau alte
furaje cultivate pentru masa verde, care contin D. stramonium.
- 60 -
Este larg
rspndit n lume, n special n zonele temperate unde sclerotii se pot dezvolta mai
bine55. Impactul economic asupra culturilor este de mai mic important. Dintre
toate speciile cel mai bine cunoscut este C. purpurea cu denumirea comun de
49
Se mai poate ntlni Datura ferox L. care are acelasi continut toxic.
Ergot este un termen general utilizat pentru toate speciile de Claviceps.
51
Claviceps purpurea, Claviceps africana, Claviceps sorghi, etc.
52
Ovarul se afla situat la partea inferioara a pistilului (pistilul are doua componente :stigmatul si ovarul)
53
Sclerotul este un tesut fungic dur si compact (dimensiunile sale sunt de cteva ori mai mari dect samnta
gazd (dimensiunea sclerotului este diferentiata in functie de dimensiunile semintelor)..
54
Inaintea obtinerii de culturi pure in scopuri industriale, ergotul a fost cultivat pe secar (Secale cereale)
55
Sclerotii nu se dezvolt bine in zone cu clima foarte cald (nu germineaza).
50
- 61 -
- 62 -
- 63 -
- 64 -
- 65 -
arvense, Sonchus oleraceus, Rumex sp., Salvia sp., Lepidium sp., Equisetum sp.,
ca si cele care provoac leziuni sau ulceratii, cum sunt Bromus tectorum, Setaria
verticillata, Holcus lanatus, Stipa pennata, Stipa capillata, etc.
Aceste genuri si specii trebuie identificate si cuantificate ca plante ntregi
sau portiuni ale acestora n furajele verzi sau uscate. Ocazional, se pot gsi si
semintele acestora n
59
- 66 -
ANEXA 1.1
Test
Agent de clarificare I i II
Reactie vizibila
Prin incalzire uoara este clarificat
structura matricei
Rezultat posibil
Difereniere
tesut
vegetal/osos
Testul cu iod/iodura(5)
Amidon
Celuloza
3. coloraie galben-portocaliu/maron
Proteine
1. Coloraie albastr
Celuloza
2. Coloraie galben
Substane de infiltrare
lignina, suberin
Lignina
(3,4)
Hidroliza cu clorat/acid
azotic(11) i testul cu iod(13)
Testul cu floroglucinol(20)
(10)
Coloraie rosie
1. Gelatinizarea substructurilor
Coloraie rosie
Hidroliza cu KOH
Observatii
Natura proteinelor nu
se poate preciza
Favorizeaz
examinarea altor
structuri
- 67 -
3.2
Domeniu de aplicare
Acest ghid se va utiliza acolo unde este necesara identificarea i diferenierea
componentelor minerale i animale (fragmente de oase, cristale de sare, fosfai,
carbonai, etc.) din amestecuri furajere, prin examen microscopic pe baza
caracterelor tipice sau testelor de confirmare.
Echipament i accesorii (Vezi Anexa 1) .
Reactivi (vezi Anexa 2)
A. Pregatirea probelor
Este necesara o buna omogenizare a probei globale inainte de examinare. Se
cantresc cca. 10 g ( 0.001 g) de furaj ntr-un pahar Berzelius de 100 ml i se
completeaza la 1/3 cu CHCl3(1). Se amesteca coninutul cu o bagheta i se las n
repaus 1 minut. Fracia flotabila (care poate conine fragmente de esuturi, fibre
musculare, pr, pene, etc.) se separ cu o spatul de pe suprafaa lichidului intr-o
placa Petri ( = 9 cm) i se evapora solventul pe o baie de apa. In funcie de
aspectul probei se poate filtra i apoi se concentreaza solventul. Dupa uscare se
siteaza reziduul pe site de dimensiuni adecvate dimensiunilor particulelor (0,4, 0,6,
0,8, 1,0). Dupa separarea fraciei flotabile, sedimentul concentrat (care contine
fragmente de oase, minerale sau fragmente vegetale lignificate) este reluat cu
CHCl3 i trecut cantitativ pe o hartie de filtru uscata i tarata n prealabil. Hartia de
filtru cu reziduul se usuc la aer i apoi la etuva la 103 20 C timp de - 1 or.
Dupa acest interval se rcete n exsicator i se cantrete (( 0.001 g). Prin
diferena fat de tara hartiei goale se determina masa reziduului.
B. Examinare
B.1. Particule organice
Fraciile individuale de pe site se examineaza la stereomicroscop (25 x -50 x)
cu iluminare frontal sau lateral la unghi de cca. 450 cu filtru albastru. Suportul
- 68 -
(3)
- 69 -
ele. Lnga fiecare fragment se aeaz o pictur de reactiv iar apoi se mpinge cu
penseta fragmentul n mijlocul picturii, urmrind modificrile (vezi anexa ) care
au loc la contactul cu reactivul. De preferina, sub placa se aeaza o foaie de
culoare neagra pentru o mai buna vizibilitate. Lumina este preferabil s fie natural
sau se utilizeaz filtrul albastru, n cazul iluminrii laterale. Testul preliminar
trebuie efectuat cu AgNO3
(6)
R x 100
(a)
Reziduu de . ( %) =
M
- 70 -
ANEXA 2.1
TESTE DE CONFIRMARE PENTRU MINERALE2
2. Particulele nu se dizolva (dar se dizolva n
HCl)
Test
Testul cu AgNO3
KOH/KClO3
(6)
cu
(10,11)
Oxalat de calciu
Reactie vizibila
Rezultat posibil
Observatii
1. Particule
la aciunea
Cristalelerezistente
devin albe
i au reactivilor
tendina de
Crbune
probabil sare sau
(clorura)cochilii
expansiune
calcinate
fosfat dicalcic
sulfai de Mn sau Mg
fragmente de oase
1. Efervescena puternic
CaCO3
se
efectueaza
testele
urmtoare
Testul cu molibdat
(7)
de particul
roca fosfatic 61
proteine
culoare roz-rosietica
2. Particulele dezintegrate floteaz i devin de
fosfai din os
inferioar
roc fosfatic
prezena calciului.
Testul
cu
CH COOH
61
CaCO3
(17)
- 71 -
ANEXA 2.2
MODELE CRISTALINE
CaCO3 (Calcit)
CaCO3 (Aragonit)
NaCl
Oxalat de calciu
Fosfat monocalcic
Fosfat tricalcic
MgSO4
CaSO4
- 72 -
3.3
Domeniu de aplicare
Aceast metod se va utiliza acolo unde detectarea constituenilor de origine
animal (definii ca produse de la procesarea carcaselor sau prilor acestora, de la
mamifere, pasri sau peti) din furaje, se efectueaza prin examen microscopic.
Constituenii de origine animal sunt identificai pe baza caracterelor microscopice
tipice ( ex. fibre musculare, pri de oase sau cartilaje, fire de pr, snge, coaja de
ou, oase de pete ,etc.). In cazul n care se cere i o apreciere cantitativ a acestor
constitueni, se vor urma instruciunile de la subcapitolul Calcul al acestui material.
Sensibilitate
In funcie de natura constituenilor (< 0.1 %)
Echipament i accesorii (Vezi Anexa 1) .
Reactivi (vezi Anexa 2)
A. Pregtirea probei
Este necesar o foarte bun omogenizare a probei globale. Aglomerarile sau
granulele se mojareaz usor sau se mrunesc n moar cu cuit la turaie mic
(1500-2000 r.p.m.) timp de ~10 sec. In funcie de natura materialului ( numai dac
este necesar se mruneste) se iau cel putin 10 g de prob care se impart n dou
fracii, una de cel puin 5 g pentru partea filtrat (pe site) i una de cel putin 5 g
pentru sedimentul concentrat. Colorarea
i clarificarea
cu
reactivi
este
- 73 -
animal la stereomicroscop cu diferite puteri de mrire (cel mult 50 x). In stratul(urile) cu <0.5 mm se caut componenii de origine animal la microscopul compus
cu obiective diferite . Preparatul se execut prin fragmentarea i clarificarea
particulei selectate iar examinarea se face intre lam i lamela. Clarificarea se face
iniial cu parafin lichid sau glicerin iar daca nu este suficient pentru
identificarea structurilor, clarificarea se efectueaza cu soluie de cloralhidrat (3-4).
Identificarea constituenilor din sediment concentrat
Se iau cel puin 2 g (cntarite cu precizie 0.001 g) din proba se introduc ntr-un
flacon sau intr-o plnie de separare i se adauga 15 ml de CHCl3. Dupa
omogenizare, se agit coninutul de mai multe ori i apoi se las n repaus (cel
puin 1 i nu mai mult de 2-3) pentru depunerea sedimentului.
Se decanteaz supernatantul i sedimentul este uscat la etuva i cntarit repetat
pna la masa constant (0.001g). Cntarirea este necesara numai n cazul n care
se face o apreciere cantitativ. Sedimentul se examineaza n intregime sau cota
parte pentru fragmente de oase, la stereomicroscop i la microscop .
C. Calcul i evaluare
n cazul n care estimarea cantitativ este necesar, se va proceda conform
acestui punct. Calculul poate fi fcut doar dac constituenii conin fragmente de
oase. Fragmentele de oase de la animale terestre homeoterme (mamifere i pasri)
pot fi deosebite de oasele de pete prin examen microscopic, pe baza vizualizrii
lacunelor tipice. Proporia de constitueni de origine animal se poate calcula
innd cont de :
-proporia estimat (masa %) de fragmente osoase din sediment, i
-proporia (masa %) de oase n constituenii de origine animal identificai.
Estimarea se face pe baz a cel putin trei (daca este posibil) pna la cinci cmpuri
pentru un strat. In nutreurile combinate, de regula, sedimentul nu conine numai
fragmente de oase, dar i alte componente cu greutate specifica mare, de exemplu
minerale, nisip, fragmente vegetale lignificate sau alte componente asemntoare.
Calculul procentual al fragmentelor de oase
- 74 -
Sx c
(b) Fragmente de oase % =
(animale terestre)
Sx d
(c) Fragmente de oase i solzi % =
(pete)
x 100
Wxf
x 100
- 75 -
(ii)
Wxf
64
- 76 -
Recomandri
Se recomand ca, n cazul constituenilor voluminoi i n cantitate mare,
sedimentul obinut la filtrare s fie mprit n doua fracii (de exemplu utilizarea
unei site cu ochiuri de 250 m [ 0.3]). Fraciunea cu constitueni voluminoi poate
fi examinat ca preparat cu ulei de parafin iar fraciunea cu particule fine trebuie
examinat la microscop.
Sedimentul concentrat, dac este necesar, poate fi divizat mai departe utiliznd un
agent de concentrare cu densitate mai mare sau poate fi examinat prin splari
succesive cu ap i cloroform (sau clorur de metilen).
n funcie de experienta analistului, identificarea originii poate fi fcut utiliznd
un preparat specific histologic, prin care se face compararea cu preparatul probei.
ANEXA 3.1
TESTE SUPLIMENTARE PENTRU TESUTURI ANIMALE65
Test
Agent de clarificare I i
II (3,4)
Reactie vizibila
Prin incalzire usoar
este
clarificata structura matricei
Rezultat posibil
Difereniere
esut
vegetal/osos
Structura osoasa
Testul Bradford(15)
Testul cu iod/iodura(5)
Amidon
Celuloza
3. coloraie galbenportocaliu/maron
Coloraie roz la inclzire usoar
Proteine
Coloraie neagra/maronie la
inclzire usoar
Constitueni cu cistina
pr, fanere
Testul Millon(8)
Testul pt. cistina(18)
65
Observatii
Componente osoase
- 77 -
ANEXA 1
APARATURA SI MATERIALE PENTRU MICROSCOPIE
Stereomicroscop cu iluminare ( 15-20 W) laterala/frontal i transmis cu filtre pentru
vizualizare albastru (pentru culoarea natural), verde (pentru fluorescen), alb mat
(antireflexie). Oculare necesare : 10 x (cu rigla de msurare), 16 x, 32 x. Obiective
stereo: 1 x i 1,6 x.
Microscop compus,
78
ANEXA 2
REACTIVI66 PENTRU MICROSCOPIE
1) CHCl3 67 p.a.
2) HCl diluat (1:1) : 1 parte HCl + 1 parte ap
3) Agent de clarificare (I) : amestec de 10 g cloralhidrat/ 10 ml apa/ 10 ml glicerina
4) Agent de clarificare (II) : amestec de 160 g cloralhidrat n 100 ml apa + 10 ml HCl
5) Iod solutie: 0,75 g KI + 0,1 g I2 n 30 ml ap la care se adaug 0,5 ml HCl (1:1)
6) AgNO3 soluie 10 % n ap
7) Molibdat de amoniu soluie : 10 g molibdat + 100 ml HNO3 se completeaz la 1000 ml.
8) Reactiv Millon (conine azotat mercuric)
9) H2SO4 diluat (1:1) : 1 parte H2SO4 + 1 parte apa
10) KOH soluie 5 %
11) KClO3 : se amestec 0,5 g KClO3 cu HNO3 (diluat 1:1)
12) Fe(CH3COO)3 sau FeCl3 soluie 1 % n ap (se prepar extempore)
13) Iod soluie : ZnCl2 100 g se amestec cu 60 ml ap n flacon cu dop la care se adaug 20 g
KI i 0.5 g I2. Se adaug cateva cristale de I2 n amestec pentru saturare i se las n repaus
14) Sudan IV soluie alcoolic aprox . 0.09 %
15) Reactiv Bradford (utilizat pentru detectarea proteinelor)
16) Parafina (ulei)
17) CH3COOH diluat (1:1) : 1 parte CH3COOH + 1 parte apa
18) Reactiv pentru cistin ( 2 g acetat de plumb + 10 g NaOH se dizolva n 100 ml apa)
19) Rodamina 6G soluie alcoolic 0,5 %
20) Floroglucinol soluie : se amestec 8 g floroglucinol cu 20 ml HCl concentrat i se
completeaz la 100 ml cu alcool etilic.
21) Medii utilizate pentru obiectivele de imersie (recomandate glicerina i uleiul de cedru)
Mediu lichid
Glicerina
Ulei de cedru
Anisol
Monobrom-naftalena
66
67
nd
1.47158
1.51525
1.5163
1.65820
Apertura
1.35
1.40
1.40
1.60
In funcie de natura componentelor identificate se pot folosi i ali reactivi care pot servi la identificarea matricei.
Se poate utiliza i tetracloretan (d= 1,62)
- 79 -
ANEXA 3
STANDARD
ISO
12.5 mm a 68
11.2 mm
8.5 mm
8.0 mm
6.7 mm
6.3 mm
5.6 mm
4.75 mm
4.00 mm
3.35 mm
2.80 mm
2.38 mm
2.00 mm
1.70 mm
1.40 mm
1.18 mm
1.00 mm
850 m
710 m
600 m
500 m
425 m
355m
300 m
250 m
212 m
180 m
150 m
125 m
106 m
90 m
75 m
63 m
53 m
68
STANDARD USA
in.a
7
/16 in
3
/8 in
3
/16 in
0.265 in.
in.a
Nr 3
Nr 4
Nr 5
Nr 6
Nr 7
Nr 8
Nr 10
Nr 12
Nr 14
Nr 16
Nr 18
Nr 20
Nr 25
Nr 30
Nr 35
Nr 40
Nr 45
Nr 50
Nr 60
Nr 70
Nr 80
Nr 100
Nr 120
Nr 140
Nr 170
Nr 200
Nr 230
Nr 270
DESCHIDERE
NOMINALA
(inch)
0.500
0.438
0.375
0.312
0.265
0.250
0.223
0.187
0.157
0.132
0.111
0.0937
0.0787
0.0661
0.0555
0.0469
0.0394
0.0331
0.0278
0.0234
0.0197
0.0165
0.0139
0.0117
0.0098
0.0083
0.0070
0.0059
0.0049
0.0041
0.0035
0.0029
0.0025
0.0021
DIAMETRU NOMINAL
AL FIRELOR SITEI
(mm)
2.67
2.45
2.27
2.07
1.87
1.82
1.68
1.54
1.37
1.23
1.10
1.00
0.900
0.810
0.725
0.650
0.580
0.510
0.450
0.390
0.340
0.290
0.247
0.215
0.180
0.152
0.131
0.110
0.091
0.076
0.064
0.053
0.044
0.037
Aceste dimensiuni nu sunt standardizate dar sunt incluse pentru c sunt utilizate frecvent
- 80 -
BIBLIOGRAFIE
- 81 -
11. El Dirdiri N.I., Wasfi I.A., Adam S.E.I.. Toxicity of Datura stramonium to
sheep and goats. Vet. Hum. Toxicol. 23, 242-246, (1981)
12. Fenwick, G., Heaney, R. and Mullin, W. 1983. Glucosinolates and their
breakdown products in food and food plants. CRC, Crit.Rev. Food Sci. Nutr. 18,
123-201.
13. Gao, Z.C., Jiang,Y.X., Li, J.F., Hou, S.S., Li, J. and Liu, X.M. 1989.
Performance of growing-fattening pigs fed with glandless cottonseed meal.
Chinese oeJ.Anim. Sci. 25 , 13-16.
14. Rangkadilok, N., Nicolas, M.E., Bennett, R.N., Premier, R.R., Eagling, D.R.
and Taylor, P.W.J. 2002. Developmental changes of sinigrin and glucoraphanin
in three Brassica species (Brassica nigra, Brassica juncea and Brassica oleracea
var. italica). Scientia Horticulturae, 96, 11-26.
15. Dini Luciana , Food microscopy/microstructure, Dipartimento di Scienze,
Universita de Lecce, 2000.
16. B. Herman and J. J. Lemasters (eds.), Optical Microscopy: Emerging Methods
and Applications. Academic Press, New York, 1993,
- 82 -