LUCRARE PRACTICĂ Nr.

MICROSCOPUL OPTIC CU LUMINĂ TRANSMISĂ

(MICROSCOP FOTONIC SIMPLU)

I. NOŢIUNI TEORETICE

Microscopul fotonic este un instrument optic care permite obţinere unor imagini
mărite ale obiectelor mai mult sau mai puţin transparente, utilizând ca sursă de energie fotonul
(particulă elementară a radiaţiei electromagnetice care posedă energie şi impuls, şi care nu
poate exista în stare de repaus). Este un aparat de mărit al cărui principiu se bazează pe
sumarea puterilor măritoare ale sistemelor obiectiv şi ocular, formând o imagine dreaptă,
mărită şi virtuală.
A. Componente
1. Partea mecanică
a) talpa sau piciorul microscopului este baza de susţinere a acestuia; la nivelul ei se găsesc:
- un bec de 6-9-12V,
- oglinzi de reflexie,
- diafragm cu filtru,
- vize de dirijare a luminii: 2 anterioare, 1 laterală, 1 posterioară.
b) coloana microscopului care susţine:
- sistemul optic (Fig.1-1),
- platina sau măsuţa (Fig.1-2) dispusă perpendicular pe coloana de susţinere, la nivelul căreia
se găsesc:
- cavalerii sau valeţii (Fig.1-3) care au rolul de a fixa preparatul pe platină,
- un car mobil (Fig.1- 4) care este acţionat de două vize coaxiale antero-posterioară şi
laterală (Fig.1-5), realizând deplasarea preparatului în plan orizontal pentru examinarea
acestuia pe toată suprafaţa,
- viza macrometrică (macroviza) (Fig.1-6) ajută la stabilirea distanţei focale; distanţa
focală este distanţa dintre lentila inferioară a obiectivului şi preparat la care se obţine
imaginea,

11
 - viza micrometrică (microviza) (Fig.1-7) este utilizată pentru clarificarea imaginii, prin
deplasări lente, fine,
- condensatorul (Fig.1-9) este un sistem de lentile convergente care are rolul de a
concentra razele de lumină într-un focar care coincide cu planul preparatului,
- viza condensatorului (Fig.1-8) permite ridicarea şi coborârea acestuia, reglând distanţa
dintre lentila condensatorului şi preparat,
- tubul microscopului prezintă în partea superioară ocularele şi în partea inferioară
obiectivele.
2. Sistemul optic este format din:
a) sursa de fotoni şi dispozitivul de transmisie cuprinde:
- sursa de lumină este situată în talpa microscopului şi este reprezentată de un bec de 6V-9V,
alimentat de un transformator;
- dispozitivul de transmisie este reprezentat de o oglindă plană situată în talpa microscopului,
având rolul de a orienta razele luminoase în axul optic al microscopului;
- potenţiometrul de reglaj al intensităţii luminii (Fig.1-12) ;
- un colector (Fig.1-10) prevăzut cu un diafragm ce permite reglarea diametrului fasciculului
de lumină care ajunge la preparat (Fig.1-11);
- condensator (Fig.1-9) - un sistem de lentile convergente, prevăzut cu diafragm, acţionat de o
viză proprie, situat pe coloană, sub platină. Are rolul de a focaliza lumina provenită de la
sistemul de iluminarea şi de a o orienta spre preparat.
b) sistemul obiectiv (Fig.1-13) este orientat spre preparat. Obiectivele (Fig.1-15) sunt formate
dintr-un ansamblu de lentile convergente dispuse într-o montură metalică. Singura lentilă care
formează imaginea este situată în partea inferioară a obiectivului şi se numeşte lentila
frontală, celelalte lentile corectează aberaţiile produse de lentila focală.
Lentilele sunt de două categorii:
- uscate – mediul interpus între lentila focală şi preparat este reprezentat de aer; au putere
de mărire de: 4x, 6x, 10x, 20x şi 40x.
- umede sau de imersie atunci când mediul interpus între lentila focală şi preparat este
reprezentat de un lichid (ulei de cedru sau de imersie, glicerină), astfel încât se va elimina
refracţia razelor de lumină în afara suprafeţei lentilei frontale (Fig.2), iar imaginea formată va
fi mai clară şi mai luminată; au putere de măire de: 90x, 100x.
Obiectivele sunt montate pe revolver (Fig.1-14). Caracteristicile obiectivelor (puterea
de mărire, apertura numerică, distanţa focală etc.) sunt notate pe tubul metalic. Distanţa dintre
lentila focală a obiectivului şi preparat este numită distanţă focală sau distanţa de lucru.

12
c) sistemul ocular (Fig.1-16). Ocularele (Fig.1-17) sunt ansambluri de lentile convergente în
montură metalică cu putere de mărire de 5x, 7x, 10x. Acestea preiau şi măresc imaginea
furnizată de obiective. Sistemul ocular mai cuprinde o scală gradată care reglează distanţă
interpupilară (Fig.1-18).

"La microscopie" de

Fig. 1. Componentele microscopului fotonic ( J-P Péré, Ed Nathan Université)

Fig. 2. Modificarea unghiului de refracţie în funcţie de puterea de mărire a obiectivelor

13
B. Principiul de funcţionare al microscopului fotonic.
Structurile cu densităţí diferite din preparat determină apariţia în fluxul luminos a unor
fenomene de refracţie şi difracţie. Elementele ce intervin în formarea imaginii sunt:
fluxul luminos (fotonic), preparatul, obiectivul, ocularul şi ochiul observatorului. Imaginea
dată de obiectiv este o imagine reală, răsturnată şi mărită; ocularul acţionează asupra imaginii
reale date de obiectiv, transformând-o într-o imagine mărită, virtuală şi răsturnată în raport cu
obiectul. Imaginea finală care ajunge la ochiul examinatorului este virtuală, răsturnată şi
mărită (fig.3).

Fig.3. Traiectul fasciculului

luminos şi formarea imaginii. La
nivelul obiectivului imaginea este
reală, mărită şi răsturnată.
La nivelul ocularului imaginea
este virtuală, mărită şi răsturnată
în raport cu specimenul
(după Alberts, 2002)

C. Caracteristicile microscopului optic:

a) Puterea de mărire (PM) a microscopului (grosissment) se calculează prin înmulţirea puterii
de mărire a obiectivului cu cea a ocularului.
PM variază între 20-1000 x
P.M. = PMoc x PMob

b) Capacitatea de rezoluţie a microscopului este distanţa minimă dintre două puncte alăturate
care se văd distinct. Rezoluţia oricărui instrument optic sau a ochiului uman se determină
utilizând formula lui Abbe:

14
 R = 0,61 λ/A.N.

unde: R = rezoluţia
λ = lungimea de undă a radiaţiei utilizate (în microscopia fotonică este limitată
la domeniul de 400-700 nm)
A.N. = apertura numerică indică unghiul maxim sub care razele luminoase ieşite din
preparat pătrund în obiectiv.

A.N. = n sin α

în care: n = indicele de refracţie al mediului între preparat şi lentila obiectivului;

α = unghiul de apertură, adică ½ din unghiul dintre diamentrul lentilei şi preparat.
Valoarea indicelui de refracţie pentru diferite medii:

 aer = 1,00
 apă distilată = 1,334
 glicerină = 1,450
 ulei de cedru = 1,515
 sticlă = 1,52

Rezoluţia ochiului uman este de aproximativ 100 µm, adică ochiul uman nu poate distinge
separat două puncte aflate la o distanţă mai mică de 100 µm. Rezoluţia microscoapelor optice
este de 0,3  la obiectivele uscate, de 0,2  la cele umede şi de 0,1m în cazul fotografierii cu
raze ultraviolete. Deci, pentru îmbunătăţirea rezoluţiei (distanţa cât mai mică) putem diminua
valoarea lungimii de undă (înlocuind fasciculul luminos cu fasciculul de electroni –
microscopia electronică sau cu raze ultraviolete cu lungimi de undă inferioare – microscopia
cu fluorescenţă) sau putem creşte indicele de refracţie al mediului, ţinând cont că sin α nu
poate depăşi 1.

D. Utilizarea microscopului optic (punerea la punct a imaginii)

1. Conectaţi microscopul la sursa de lumină

şi acţionaţi întrerupătorul care se află
în spatele microscopului.

15
 2. Reglaţi distanţa interpupilară astfel încât cei doi
ochi să se suprapună perfect peste oculare şi să se
observe o singură pată de lumină. Se modifică
poziţia condensatorului pentru a obţine o iluminare
uniformă de intensitate potrivită.

3. Privind din lateral, cu ajutorul macrovizei se

îndepărtează platina de obiectiv astfel încât să
obţinem un spaţiu optim de lucru.

4. Poziţionaţi preparatul pe platină, fixaţi cu

ajutorul cavalerilor şi centraţi secţiunea sau
frotiul.

5. Poziţionaţi în axul optic obiectivul cu

cea mai mică putere de mărire (4x, 6x),
rotind cu atenţie revolverul, până când
acesta întâmpină rezistenţă.

6. Privind din lateral, cu ajutorul macrovizei se

reduce distanţa dintre obiectiv şi preparat până
la o distanţă mai mică decât distanţa focală a
obiectivului.
!!! Atenţie utilizaţi obiectivul cu cea mai
mică putere de mărire.

7. Privind în oculare şi prin manevrarea

macrovizei se îndepărtează încet platina de
obiectiv până când apare imaginea în câmpul
microscopului.

16
 8. Dacă punerea la punct a imaginii a fost reuşită, se
clarifică cu microviza. Apoi se studiază întreg preparatul
microscopic, utilizând vizele carului mobil.
După punerea la punct a imaginii cu obiectivele mici, se
examinează preparatul cu obiective cu putere de mărire
mai mare (10x, 20x, 40x) prin aducerea acestora în axul
optic cu ajutorul revolverului, fără a acţiona macroviza.

!!! Situaţii în care nu obţinem imaginea: fie obiectivul nu este poziţionat corect în
axul optic, fie preparatul nu a fost poziţionat corespunzător pe platină, fie s-a îndepărtat prea
repede platina de obiectiv. În acet caz se reia punerea la punct a imaginii, de la etapa a 3-a.
!!! Nu se va încerca punerea la punct a imaginii prin apropiere bruscă a
preparatului de obiectiv, deoarece există riscul de a deteriora preparatul sau obiectivul.
!!! Cu cât puterea obiectivelor este mai mare, cu atât distanţa focală (exprimată în mm)
va fi mai mică (tab.1).
!!! În timpul examinării la microscop viza micrometrică va fi manevrată continuu în
ambele sensuri ceea ce va creşte capacitatea de acomodare a ochiului examinatorului.

La sfârşitul examinării microscopul se lasă în repaus cu obiectivul de 10x, se

deconectează de la sursa de energie, se acoperă cu husă pentru a fi protejat de praf.

Pentru observarea preparatelor cu obiectivele umede (de imersie - 90x, 100x), se

realizează primele trei etape, apoi se depune o picătura de ulei de cedru pe preparat (privind
din lateral). Următoarele etape constau în :
- se aduce în axul optic obiectivul de imersie ;
- privind din exterior, se coboară obiectivul până atinge picătura de ulei,
- se ridică condensatorul în poziţia maximă pentru a mări luminozitatea ;
- cu ajutorul macrovizei se încearcă găsirea imaginii,
- se clarifică cu microviza.

Puterea de mărire Distanţa focală (mm)

5x 10.0
10x 7.0
20x 3.10
40x 0.54
100x 0.39
Tabelul I. Relaţia dintre puterea de mărire a microscopului şi distanţa focală.

17
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

1) Se vor studia componentele microscopului fotonic şi se vor efectua exerciţii de punere la

punct imaginii utilizând preparatele primite.

2) Notaţi puterea de mărire a ocularelor…………………………………………..................

3) Notaţi în tabelul de mai jos pentru fiecare obiectiv puterea de mărire, apertura numerică şi
distanţa focală corespunzătoare.

Puterea de Apertura Distanţa focală Puterea de Rezoluţia

mărire a numerică mărire a
obiectivelor microscopului

4) Folosind formulele prezentate anterior, calculaţi puterea de mărire a microscopului

corespunzătoare fiecărui obiectiv şi capacitatea de rezoluţie, notându-le în tabelul de mai sus.
Se consideră  = 400 nm.

Efectuaţi calculele.

18
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1. Pe coloana de susţinere a microscopului optic se găsesc:

a) platina
b) macroviza
c) microviza
d) oglinzi de reflexie
e) transformatorul

2. Sistemul de iluminare cuprinde :

a) bec de 100V
b) condensator
c) colector
d) obiective uscate
e) oglindă plană

3. Puterea de mărire a obiectivelor uscate poate fi :

a) 10x
b) 20x
c) 6x
d) 100x
e) 40x

4. În formarea imaginii la MO intervin următoarele elemente :

a) fluxul de fotoni
b) fluxul de electroni
c) ochiul observatorului
d) obiectiv
e) preparat

19
 5. Care dintre următoarele afirmaţii sunt adevărate:
a) imaginea realizată de obiectiv este reală, răsturnată şi mărită
b) imaginea realizată de ocular este reală, dreaptă şi mărită
c) imaginea finală este virtuală, răsturnată şi mărită
d) puterea de mărire a MO este dată de raportul dintre PMoc şi PMob
e) Capacitatea de rezoluţie a microscopului este superioară celei a ochiului
uman.

6. Care dintre următoarele afirmaţii sunt false :

a) capacitatea de rezoluţie a MO poate fi îmbunătăţită prin diminuarea 
b) capacitatea de rezoluţie a MO poate fi îmbunătăţită prin creşterea 
c) capacitatea de rezoluţie a MO poate fi îmbunătăţită prin creşterea AN
d) capacitatea de rezoluţie a MO poate fi îmbunătăţită prin scăderea
indicelui de refracţie al mediului
e) capacitatea de rezoluţie a MO poate fi influenţată de Pmoc

7. Punerea la punct a imaginii presupune :

a) poziţionarea preparatului pe platină cu ajutorul cavalerilor
b) stabilirea distanţei focale prin apropierea bruscă a preparatului de
obiectiv
c) clarificarea imaginii cu macroviza
d) utilizarea de start a obiectivului de 10x
e) manevrarea condensatorului pentru modificarea intensităţii luminii

8. Care dintre afirmaţiile de mai jos sunt adevărate ?

a) PMob este invers proporţională cu distanţa focală
b) Pentru imersie sunt utilizate obiective uscate
c) Obiectivele de imersie au PM 90x şi PM 100x
d) Examinarea în imersie presupune utilizarea uleiului de cedru
e) Distanţa focală pentru obiectivul 100x este de 10mm.
Data
.........................................
Semnătura cadrului didactic
Calificativ……………… ...................................................

20
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 2
TEHNICI SPECIALE DE MICROSCOPIE OPTICĂ

I. NOŢIUNI TEORETICE

Preparatele biologice native sunt transparente şi necesită tehnici de colorare pentru a le

putea distinge constituenţii. Numeroase tehnici de microscopie permit creşterea calităţii
imaginii, fără a interveni asupra structurii preparatului, permiţând astfel observarea celulelor
vii, necolorate. În acest scop, pornind de la principiul general de funcţionare al microscopului
fotonic, au fost realizate diferite tipuri de microscoape, fiecare special adaptat unei game
particulare de observaţie celulară.

1. MICROSCOPUL CU FOND ÎNTUNECAT (MFI)

Principiul de funcţionare al microscopului cu fond întunecat se bazează pe fenomenul
Tyndall care constă în dispersia luminii de către particole foarte mici aflate în suspensie care
vor deveni astfel vizibile, analog particolelor de praf plasate într-o rază puternică de lumină
(Benga şi colab, 1997).
Microscopul cu fond întunecat este prevăzut cu un condensator modificat numit
condensator paraboloid sau cardioid. Razele luminoase care provin de la condensator
pătrund în preparat oblic sub un unghi foarte mic, determinând iluminarea specimenului din
lateral, ceea ce va conduce la o mai bună evidenţiere a periferiei celulare. În acest fel,
obiectivul va capta doar razele luminoase care sunt dispersate de particulele aflate în
suspensie şi care vor participa la formarea imaginii; fondul preparatului nu difuzează lumina
şi în consecinţă va rămâne negru (fig.1). Celulele apar galben translucide, pe fondul întunecat
al preparatului, imaginea putând fi comparată cu “cerul înstelat de vară” (fig.2).
Microscopul este utilizat pentru studiul:
 celulelor umane vii care prezintă la periferie diferenţieri ectocitoplasmatice de tip
pseudopode, lamelipode, filopode, cili, flageli;
 bacteriilor, şi protozoarelor ale căror particularităţi morfologice se evidenţiază mai clar pe

21
fond întunecat – exemplu: Spirochettele, printre care agentul etiologic al sifilisului,
Treponema Pallidum (fig.3).

Fig.1. Traseul razelor de lumină

în microscopia cu fond întunecat.

Fig. 2. Câmp microscopic MFÎ.

Raclat de celule bucale. PM 10x

Fig. 3. Imagini MFÎ : Spiroplasma (stg) (după Alberts, 2005), Treponema Pallidum (dr)

2. MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ (MCF)

Majoritatea structurilor celulare nu absorb lumina vizibilă, sunt transparente, dar fiind
diferit hidratate ele au indici de refracţie diferiţi şi vor devia mai mult sau mai puţin lumina
care le traversează, producându-se astfel o diferenţă de fază (diferenţă de drum optic) care nu

22
poate fi observată cu ochiul liber. Pornind de la această proprietate, MCF permite observarea
structurilor biologice vii, nefixate şi necolorate, prin amplificarea diferenţelor de drum optic
pe care le transformă în diferenţe de intensitate luminoasă. Imaginea rezultată apare puternic
contrastată în nuanţe de alb-negru (fig.4).

Fig. 4. Celulă animală în cultură:

A. Microscopul fotonic
B. Microscopul cu contrast de fază
(B. Alberts, 2005)

MCF este echipat cu obiective speciale cu inele de fază notate Ph, diafragm cu fantă
inelară, filtru pentru lumina monocromă. Razele de lumină venite din talpa microscopului
ajung în preparat, apoi la obiectiv şi la placa de fază prevăzută cu un şanţ inelar. Raza
nerefractată va fi defazată de inelul plăcii de fază cu ¼ faţă de raza refractată care nu trece
prin acest inel. Imaginea se va forma prin interferenţa celor două raze (fig.5).

Fig.5. Traseul razelor de lumină în MCF

(după J.P. Pere, 1994)

Microscopul cu contrast de fază este utilizat pentru studiul celulelor vii, permiţând
observarea sructurii nucleului şi distribuţia organitelor intracitoplasmatice. Prin ataşarea unui
dispozitiv de microcinematografiere se pot evidenţia aspectele dinamice intracelulare de
tipul : diviziune, endo- şi exocitoză, cicloză, mişcări proprii ale organitelor celulare.

23
3. MICROSCOPUL INVERSAT
Microscopul inversat clasic face parte din categoria microscoapelor optice cu diferenţa
că preparatul este iluminat prin partea superioară a microscopului, iar obiectivele sunt situate
sub preparat (fig.6). În acest fel, eşantioanele pot fi plasate pe platină, iluminate de sus şi
vizualizate dinspre bază. Distanţa dintre eşantion şi sursa de lumină permite plasarea în câmp
optic a plăcilor de culturi celulare, cu grosimi de 1-2 cm, permiţând totodată manipularea lor
cu uşurinţă (fig.7).

Fig.6. Microscopul inversat

Microscopul inversat permite observaţia:
- preparatelor fixate sau proaspete
- studiul culturilor celulare în dinamică (fig.8)
- filmarea evenimentelor de dinamică celulară: diviziune, apoptoză, supravegherea
primelor diviziuni ale zigotului în cursul fertilizării in vitro etc.

Fig.7. Placa de cultură aşezată pe platină Fig.8. Cultură de celule umane observată
la microscopul inversat

24
4. MICROSCOPUL CU LUMINĂ POLARIZATĂ (MLP)
Formarea imaginii în acest tip de microscop se bazează pe proprietatea structurilor
biologice cu aranjament molecular ordonat de a roti planul luminii polarizate. Lungimea de
undă a radiaţiei luminoase este dată de oscilaţii perpendiculare pe direcţia de propagare în
toate planurile (vectori de oscilaţie). În acest fel, pe secţiune, vectorii de oscilaţie ocupă toate
diametrele posibile ale unui cerc. Lumina polarizată se caracterizează prin oscilaţia undelor
luminoase într-un singur plan. Astfel, lumina nepolarizată ar putea fi asemănată cu un
cilindru, iar cea polarizată cu o lamă (fig.9). Ochiul uman nu are capacitatea de a distinge
lumina polarizată, pentru aceasta fiind necesară utilizarea unor filtre speciale. Filtrele sunt
confecţionate din spath de Islanda şi poartă denumirea de nicoli. Sunt utilizaţi doi nicoli :
analizor situat între specimen şi ocular şi polarizor situat între condensator şi sursa de lumină.
În cazul în care se doreşte aprecierea cantitativă a structurilor birefringente, este necesară
intercalarea unui compensator (fig.10).

Fig.9. Diferenţa dintre lumina

polarizată şi cea nepolarizată

Fig.10. Schema formării imaginii în MLP

Formarea imaginii în oculare depinde de poziţia celor doi nicoli: când planurile celor
doi nicoli sunt paralele, raza de lumină luminează cîmpul, iar dacă planurile celor doi nicoli
devin perpendiculare, raza dată de nicolul polarizor se anulează, imaginea dispare, iar câmpul
microscopului devine întunecat. Birefringenţa se studiază în poziţie de nicoli încrucişaţi. Dacă

25
câmpul de examinat rămâne întunecat, atunci obiectul examinat este monorefringent, izotrop;
dacă în câmpul aparatului apar structuri intens luminate, obiectul examinat este anizotrop sau
birefringent.
MLP este folosit în studiul structurilor cu organizare moleculară ordonată de tip:
 liniar lamelar – fibra musculară striată, fibrele de colagen,
 plan liniar – membrane celulare,
 concentric – osteon (fig. 11),
 cu simetrie radiară – colesterol, lipide.

Fig.11. Imagine MLP.

tă
Secţiune os compact.

5. MICROSCOPUL CU FLUORESCENŢĂ
Luminiscenţa este proprietatea generală a unui substrat de a emite cuante luminoase
determinate de modificările intraatomice.
Fotoluminiscenţa este emisia de lumină determinată de excitarea atomilor ca urmare a
expunerii la radiaţii electromagnetice. După durată, fotoluminiscenţa se subîmparte în
fluorescenţă în care emisia de lumină durează un timp foarte scurt (miliardimi de secundă)
după încetarea acţiunii radiaţiilor şi fosforescenţă la care emisia de lumină persistă secunde,
minute,ore.
Microscopia de fluorescenţă se bazează pe proprietatea substraturilor de a emite
radiaţii cu lungime de undă vizibilă atunci când sunt iluminate de radiaţii ultraviolete, cu
lungime de undă scurtă (300nm). Substanţele care prezintă această proprietate poartă numele
de fluorocromi. În microscopia cu fluorescenţă se produce excitarea fluorocromilor cu
ajutorul radiaţiei ultraviolete. Acest tip de microscop utilizează ca şi sursă de iluminare un
fascicul de raze ultraviolete emise de o lampă cu vapori de mercur sub presiune înaltă. De
asemenea, utilizează o gamă largă de filtre de lumină: de excitaţie (elimină razele emise din
spectrul vizibil) şi de protecţie (pentru a proteja retina). Radiaţia luminoasă trece prin
condensator, preparatul microscopic, obiectiv, apoi este filtrată prin filrele de baraj care
permit numai pasajul luminii emise de fluorocrom. Prin ocular va trece numai lumina

26
fluorescentă, iar imaginea va cuprinde zonele de fluorescenţă iluminate pe un fond întunecat.
(Benga, 1997)(fig.12).

Fig. 12. Imagine de microscopie cu fluorescenţă (Alberts, 2005)

Evidenţierea mitocondriilor prin utilizarea unui fluorocrom - rhodamină 123 (stg.)
Evidenţierea microtubulilor prin utilizarea unui anticorp pentru tubulină (dr.)

Astfel, se pot examina substraturi care prezintă:

a. fluorescenţă primară (naturală, autofluorescenţă):
- dintele natural
- aminoacizi: fenilalanina, tirozina, triptofan - fluorescenţă albastră
- unele virusuri şi bacilul tuberculos – fluorescenţă verde strălucitoare
- pigmenţii: clorofila şi porfirinele – fluorescenţă verde, lipofuscina – roşie-brună
- aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina – fluorescenţă verde strălucitoare
- margarina (acizi graşi), laptele praf (lumiflavină), extract de creier (catecholamine,
serotonină) – fluorescenţă albastră
- extract de morcovi (β caroten), extract de ficat (vitamine din grupul B) – galbenă
b. fluorescenţă secundară este indusă cu ajutorul fluorocromilor de tip: acridin orange,
fluoresceină, sulfatul de berberină, tioflavina, primulina, auranina, mercurocromul,
tinctură de clorofilă etc.
Cea mai importantă aplicaţie a utilizării fluorocromilor îl reprezintă imunofluorescenţa.
Studiul se bazează pe cuplarea unui anticorp cu un fluorocrom (anticorpi marcaţi fluorescent).
Introducerea lor în ţesuturi, permite identificarea localizării antigenelor la nivel celular şi
tisular.

6. MICROSCOPUL CU UV PENTRU CITOSPECTROFOTOMETRIE

Aparatul este dotat cu o sursă de lumină UV, filtre de absorbţie şi de excitaţie, optică de
quartz, aparat fotografic. Datorită opticii de quartz şi utilizării radiaţiei UV, la acest aparat

27
observarea nu se face direct, cu ochiul liber, imaginea se reglează automat şi se înregistrează
pe film; diagnosticul rezultă din interpretarea fotografiei. Metoda este utilizată în scop de
studiu cantitativ al nucleoproteinelor asociate ARN şi ADN. Acest lucru permite stabilirea
gradului de ploidie al celulelor provenite din tumori.

7. MICROSCOPUL CONFOCAL
Reprezintă una din achiziţiile notabile în microscopia optică deoarece lumina utilizată
este unda laser. Aparatul cuprinde elemente optice, dispozitive de scanare rapidă, calculator şi
un software adecvat. (fig.13).

Fig. 13. Schema componentelor microscopului confocal

(după Chasserot-Golaz)

Microscopul confocal a evoluat din microscopul de fluorescenţă. În microscopia de

fluorescenţă clasică, eşantionul este iluminat uniform, astfel că toate elementele (de deasupra
şi dedesubtul planului focal) contribuie la formarea imaginii; acest lucru scade rezoluţia şi
contrastul. În microscopia confocală preparatul este baleiat de un spot luminos, iar imaginea
elementelor dinafara planului focal este oprită de diafragmul detectorului; în acest fel,
contrastul şi rezoluţia devin mai performante (fig.14). Mai mult, baleiajul fasciculului permite
„decuparea” imaginii în plan orizontal şi vertical. Secţiunile optice obţinute în acest fel pot fi
combinate de un software adecvat pentru a reconstrui imaginea 3D a eşantionului. În
consecinţă, microscopul confocal permite vizualizarea tridimensională sau 4D (3D în relaţie
cu timpul) a structurilor celulare, cu aplicaţii atât pe celule fixate, dar şi pe celule vii.
Principiul de funcţionare al microscopiei confocale scaning laser este acelaşi cu cel al
microscopiei de fluorescenţă cu excepţia sursei luminoase care în acest caz este sursa laser, iar
imaginile obţinute sunt înregistrate pe calculator, redând astfel imaginea de ansamblu a
celulei. Razele laser excitatoare penetrează eşantionul marcat cu fluorocromi şi emit un
fascicul cu diametru foarte mic care scanează specimenul biologic pe toată grosimea şi
întinderea sa. Microscopia confocală conferă unele avantaje în raport cu microscopia

28
convenţională prin : posibilitatea de a localizarea in situ o sondă fluorescentă, creşterea
rezoluţiei laterale (0,2 µ) şi axiale (0,4 µ), reglaje electronice ale contrastului, luminozităţii şi
a puterii de mărire, posibilitatea de observarea simultană a mai multor sonde fluorescente,
obţinerea de secţiuni optice seriate care permit reconstrucţia 3D. Imaginea multifluorescentă
permite furnizarea unor informaţii rapide cantitative şi calitative, vizualizarea şi analizarea
distribuţiei spaţiale a structurilor celulare la scară submicrometrică.(fig.15).

Fig.14. Componentele
microscopului confocal

tructurale

Fig. 15. Imagine de microscopie confocală. Secţiune

prin nucleul celulei de glandă salivară de
Drosophila – evidenţierea cromozomilor prin
marcare cu anticorpi specifici (Whrite, 1987)

Pentru performanţele sale, microscopul confocal este utilizat în :

- observarea culturilor de celule in vitro
- urmărirea unei culturi de celule în timpul dezvoltării embrionare (stadiul de 8 celule)
- studiul liniilor de celule STEM embrionare: linia neuronală, musculară, vasculo-
endotelială, hematopoetică etc.
- studiul epitopilor (epitop sau determinant antigenic = un aminoacid sau un zahar care este
recunoscut de un anticorp ca fiind un antigen). Deoarece proteinele, glucidele, lipidele
conţin epitopi, prin studii de imunihistochimie se poate vizualiza distribuţia, funcţia şi

29
 modificările acestor componente celulare.
- diagnosticul anomaliilor cromozomiale structurale prin tehnica FISH (Fluorescence in situ
Hzbridization)
- studierea localizării şi funcţiilor proteinelor care emit fluorescenţă verde (Green
Fluorescent Protein-GFP) şi a altor variante spectrale: YFP (yellow), CFP (cyan), BFP
(blue) şi RFP (red).
- studiul proteinelor „cameleon”. Aceste proteine emit fluorescenţă diferită în funcţie de
concentraţia ionilor de calciu pe care îi cuplează. Fenomenul este numit „cameleonism”
(de la reptila cameleon) şi este un indicator al concentraţiei Ca++ în celula vie. Au fost
studiate astfel calmodulinele-proteine funcţionale ale citoscheletului membranar (CaM) şi
lanţurile uşoare ale miozinei, kinaze-dependente, care leagă calmodulinele (M13).

8. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ (MFA)

În 1981, G.Binnig, C.F.Quate şi C.Gerber au pus la punct microscopul cu efect de
tunel care permite vizualizarea şi manipularea atomilor. Ulterior s-a dezvoltat o nouă familie
de microscoape – microscoapele în câmp apropiat sau cu sondă locală, utilizate pentru studiul
proprietăţilor de suprafaţă a eşantioanelor. Acestea, nu prezintă sisteme optice sau
electromagnetice. Unul dintre primle microscoape din această gamă a fost microscopul de
forţă atomică (MFA) (fig.16).

Fig.16. Microscopul
de forţă atomică

Pentru a înţelege principiul de funcţionare trebuie să ne reamintim faptul că forţele

Van Der Wals au un caracter universal deoarece se stabilesc în timpul tuturor fenomenelor de
interacţie atomică sau moleculară, chiar şi în cazul moleculelor nepolare. De fapt, fluctuaţia
densităţii electronilor determină crearea unor dipoli care conduc la formarea acestor forţe.

30
MFA detectează şi măsoară cu precizie forţele inter-atomice prin baleierea („măturarea”)
suprafeţei obiectului de cercetat. Astfel, MFA permite studiul proprietăţilor de suprafaţă a
eşantioanelor cristaline sau a eşantioanelor plasate în mediu lichid (ser fiziologic), în vid sau
în aer.
Principiul de funcţionare constă în poziţionarea unei sonde de nitrură de siliciu (Si3N4)
la o distanţă de 7-10 Å sau chiar la contactul cu eşantionul, care va explora linie cu linie
topografia suprafeţei. Sonda este susţinută de o pârghie flexibilă numită microlevier care
permite o deplasare în plan de 100 . Deflecţiunea microlevierului (cantileverului) provocată
de prezenţa unei asperităţi antrenează formarea unei bucle de recontrol care va menţine
constanţa distanţei între sondă şi eşantion. Timpul de achiziţie al imaginii este de 1-10 minute,
în funcţie de amploarea baleiajului şi natura eşantionului (fig.17).

Fig.17. Componentele şi modul de funcţionare al MFA

MFA a fost optimizat iniţial pentru studiul fizico-chimic al suprafeţelor rugoase:

materiale polimerice, biomateriale, coloizi, surfactanţi. Ulterior (1995), datorită posibilităţilor
de utilizare asupra materialelor moi aflate în mediu lichid, MFA a fost utilizat şi în biologie.
Prin capacităţile sale, MFA se impune astăzi la intersecţia între biologie, chimie şi fizică, ca
un instrument indispensabil dezvoltării nanoştiinţelor. În biologie, în ultimii 10 ani au fost
optimizate tehnici de studiu care permit: vizualizare celulară 3D, măsurarea forţelor de
interacţiune intra şi intermoleculare (spectroscopie de forţă), tehnici de manipulare şi
chirurgie moleculară.

31
 MFA permite filmarea, secundă de secundă, a fenomenelor lente care se produc la
nivelul suprafeţei examinate:
- penetrarea unui virus într-o celulă;
- obţinerea de imagini 3D a suprafeţelor celulare;
- evidenţierea structurilor în formă de „puţ” de la nivelul membanei celulare. Aceste
structuri au fost denumite porozomi şi sunt implicate în fenomenul de exocitoză al produşilor
de secreţie;
MFA permite observarea suprafeţei eşantioanelor biologice cu rezoluţii laterale de 5 Å
şi verticale de 1-2 Å. Aceste performanţe fac ca MFA să contribuie alături de ME, difracţia în
raze X şi RMN la înţelegerea relaţiilor de structură şi funcţie a sistemelor biologice (fig.18).

Molecula de ADN Dendrite ale unui neuron în retinoblastom

Virusuri SARS la suprafaţa unei celule Pori nucleari

Fig.18. Imagini realizate în microscopia de forţă atomică

32
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

1. Examinarea preparatelor în MFI

- efectuaţi un preparat extemporaneu din raclat de celule bucale suspendate în ser
fiziologic, acoperite cu o lamelă;
- vizualizaţi preparatul în microscopia optică la putere de mărire 4x sau 10x (funcţie de
microscopul pe care îl utilizati) şi îl desenaţi;
- coborâţi condensatorul în poziţie minimă şi îl înlocuiţi cu un condensaor cardioid
- pentru realizarea unui mediu cu acelaşi indice de refracţie, între condensatorul
cardioid şi preparat interpuneţi o picătură de glicerină, apoi ridicaţi condensatorul până
când picătura vine în contact cu lama de examinat;
- examinaţi preparatul la puteri de mărire progresive ale obiectivelor uscate, în ordine
crescătoare (4x, 10x, 40x);
- desenaţi imaginea de „cer înstelat” fiind atenţi la puterea de mărire.

Preparat extemporaneu Preparat extemporaneu

Raclat de celule bucale (MO) Raclat de celule bucale (MFI)
PM.............. PM...............

2. Examinarea preparatelor în MCF

- efectuaţi un preparat extemporaneu din raclat de celule bucale suspendate în ser
fiziologic, acoperite cu o lamelă;
- vizualizaţi preparatul în microscopia optică la putere de mărire 40x şi îl desenaţi;

33
 - rotiţi revolverul şi aduceţi în axul microscopului obiectivul de fază cu PM 40x;
- înlocuiţi condensatorul cu condensatorul de fază şi îl fixaţi la 40x;
- clarificaţi imaginea şi desenaţi;
- comparaţi vizual aceeaşi imagine obţinută în MO şi MCF

Preparat extemporaneu Preparat extemporaneu

Raclat de celule bucale (MO) Raclat de celule bucale (MCF)
PM.............. PM...............
2. Examinarea preparatelor în MLP
- examinaţi cu ajutorul MLP preparatul fixat executat din os compact în poziţie de nicoli
paraleli şi încrucişaţi
- indicaţi prin săgeţi structurile mono şi birefringente

Preparat necolorat Preparat necolorat

Secţiune os compact Secţiune os compact
Imagine MLP nicoli paraleli Imagine MLP nicoli încrucişaţi
PM.................. PM.....................

34
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR:

1. Care din afirmaţiile de mai jos sunt adevărate:

a. Microscopul cu fond întunecat este utilizat în diagnosticul etiologic al sifilisului
b. Microscopul confocal utilizează lumina polarizată
c. Microscopul cu fluorescenţă utilizează ca sursă de energie un fascicul de elctroni
d. Fuorescenţa poate fi indusă cu ajutorul anticorpilor specifici
e. Microscopul confocal permite obţinerea unor imagini 4D

2. Care din afirmaţiile de mai jos sunt false:

a. Microscopul cu fond întunecat se bazează pe fenomenul de dispersie a luminii
b. Microscopul cu lumină polarizată studiază structurile cu aranjamente moleculare
ordonate
c. Microscopia de fluorescenţă utilizează radiaţiile vizibile ultraviolete
d. Microscopul cu contrast de fază studiază celulele fixate şi colorate
e. Microscopia de forţă atomică permite studiul de suprafaţă al eşantionului

3. Care din afirmaţiile de mai jos sunt adevărate:

a. Flurescenţa poate fi primară sau indusă
b. Microscopul cu contrast de fază permite microcinematografierea
c. Microscopul confocal dă numai imagini alb-negru
d. În microscopia cu fond întunecat se colorează numai nucleii
e. Microscopul de forţă atomică are o rezoluţie verticală de câţiva Å

4. Care dintre urmatoarele tipuri de microscoape permit studiul celulei vii:

a. Microscopul cu fond întunecat
b. Microscopul cu lumină polarizată
c. Microscopul cu contrast de fază
d. Microscopul confocal
e. Microscopul inversat

35
5. Care din afirmaţiile de mai jos sunt false:
a. Microscopul de forţă atomică utilizeză radiaţia UV
b. Microscopul confocal utilizează razele laser
c. Microscopul cu lumină polarizată are în componenţă nicoli
d. Microscopul cu fond întunecat studiază fenomenul de birefringenţă
e. Microscopul de fluorescenţă este utilizat în diagnosticul imunologic

6. Microscopul cu fond întunecat:

a. Utilizează radiaţia UV
b. Este dotat cu condensator cardioid
c. Foloseşte optică de quartz
d. Este utilizat în studiul celulelor procariote
e. Câmpul microscopic este luminos

7. Microscopul cu contrast de fază:

a. Utilizează obiective obişnuite
b. Transformă diferenţa de drum optic în diferenţe de intensitate luminoasă
c. Permite cinematografierea imaginilor pentru studiul dinamismului celular
d. Este utilizat pentru studiul preparatelor fixate
e. Imaginea obţinută este colorată

8. Microscopul inversat:
a. Permite studiul culturilor celulare în dinamică
b. Sistemul de iluminare porneşte din talpa microscopului
c. Permite filmarea diviziunilor celulare
d. Este dotat cu sistem optic (oculare, obiective) obişnuit
e. Permite plasarea în câmp optic a plăcilor de culturi celulare

9. Microscopul cu lumină polarizată:

a. Utilizează filtre din spath de Islanda numite nicoli
b. Câmpul microscopic se întunecă când nicolii au o orientare paralelă
c. Este utilizat pentru studiul structurilor cu organizare moleculară ordonată mono- şi
birefringentă
d. Este utilizat în studiul anomaliilor osoase şi musculare

36
 e. Un substrat birefringent determină apariţia unei imagini intens luminate

10. Microscopul de fluorescenţă:

a. fluorescenţa este proprietatea substraturilor de a emite cuante luminoase timp de
minute, ore după încetarea excitării cu radiaţii electromagnetice
b. microscopul cu fluorescenţă utilizează ca sursă de lumină, radiaţia UV
c. fluorocromii permit inducerea unei fluorescenţe secundare
d. studierea dintelui natural necesită tratarea cu fluorocromi deoarece nu prezintă
fluorescenţă primară
e. imunofluorescenţa utilizează anticorpi marcaţi cu un fluorocrom

11. Microscopul confocal:

a. Este derivat din microscopia fotonică
b. lumina utilizată este unda laser
c. permite vizualizarea 3D şi 4D a structurilor celulare
d. permite studiul epitopilor
e. este utilizat numai în studiul calulelor fixate

12. Microscopul de forţă atomică:

a. a permis vizualizarea porozomilor şi explicarea fenomenului de exocitoză
b. este utilizat în studiul de suprafaţă a eşantioanelor
c. este dotat cu lentile electromagnetice
d. nu permite studiul eşantioanelor plasate în mediu lichid sau în vid
e. are rezoluţii laterale şi verticale de câţiva Å

Data
.....................................
Semnătura
Calificativ......................... cadrului didactic
......................................................

37
38
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 3

MICROSCOPIA ELECTRONICĂ

I. NOŢIUNI TEORETICE

Microscopul electronic foloseşte ca sursă luminoasă lungimea de undă a electronilor.

Puterea maximă de mărire pe ecranul microscopului poate ajunge la 1.000.000 x, ceea ce
reprezintă de aproximativ 1.000 de ori mai mult decât puterea de mărire a microscopului
fotonic. Capacitatea teoretică de rezoluţie a ME este de 1-2 Å, faţă de capacitatea maximă de
rezoluţie de 0,2  a microscopului fotonic (fig.1).

Fig.1. Comparaţie între performanţele microscopiei electronice şi optice din punct de

vedere al vizualizării formelor celulare şi acelulare de viaţă

Tipuri principale de ME:

În funcţie de modul de captare al electronilor, tipul de imagine (2D sau 3D) şi puterea de
mărire, există mai multe tipuri de microscoape electronice:
1. Microscopul electronic de transmisie (TEM), oferă imagini 2D,
2. Microscopul electronic scanning sau cu baleiaj (SEM), oferă imagini 3D,
3. Microscopul electronic de transmisie şi baleiaj (STEM) este o combinaţie TEM-SEM,
4. Microscopul electronic de înalt voltaj, care datorită coloanei cu o înălţime de 10m permite
o mai mare accelerarea a electronilor şi obţinerea unor imagini de mare fidelitate la puteri
maxime de mărire.

39
 Componentele TEM (fig.2)
1. Coloana microscopului cuprinde:
- sistemul de vid
- sursa de electroni reprezentată de un filament de tungsten sau wolfram,
- anodul care creează diferenţa de potenţial,
- sistemul de lentile electromagnetice,
- camera preparatului
2. Ecranul fluorescent pentru examinarea imaginii
3. Aparatul de fotografiat şi cutia cu plăci fotografice
4. Pupitrul de comandă
5. Computer pentru stocarea şi analiza imaginilor.

Fig.2. Foto TEM Fig.3. Transmiterea fluxului

de electroni în ME

Principiul de funcţionare
Sursa de electroni este catodul care emite fluxul de electroni. Aceştia sunt acceleraţi prin
aplicarea unei diferenţe de potenţial între catod şi anod. Cu cât vidul creat este mai înalt, cu
atât acceleraţia electronilor este mai mare şi imaginea obţinută este mai performantă. Fluxul
de electroni este concentrat pe specimen printr-o lentilă electromagnetică care serveşte drept
condensator; apoi, o a doua lentilă electromagnetică cu rol de obiectiv formează o imagine
mărită a preparatului. O fracţiune din această imagine este captată de o a treia lentilă
electromagnetică şi mărită încă o dată. Imaginea finală este proiectată pe un ecran fluorescent

40
şi poate fi studiată direct pe ecran sau fotografiată (fig.3).
Fasciculul incident de electroni atinge secţiunea ultrafină a preparatului. Din acest impact
rezultă următoarele fenomene (fig.4):
- electronii care traversează preparatul se numesc elecroni transmişi şi sunt captaţi de
detectorul de electroni aflat sub preparat;
- electronii care ating direct nucleii atomilor preparatului sunt reflectaţi;
- o parte dintre electroni sunt reţinuţi de preparat, dar în acelaşi timp dislocă alţi electroni
care din acest motiv poartă denumirea de electroni secundari;
- la bombardarea cu electroni, preparatul în sine emite luminiscenţă (electroni
catodoluminiscenţi sau electroni rX).

Fig.4. Tipuri de semnale obţinute de microscopia electronică în urma interacţiunii

fasciculului de electroni cu preparatul

Pregătirea materialului de examinat în ME cuprinde următoarele etape principale:

1. Recoltarea din organismul viu à 1mm3 ţesut
2. Fixarea în glutaraldehidă 2,5 % şi tetraoxid de osmiu 1% timp de ½ oră→12 ore, funcţie
de tipul de ţesut
3. Spălarea în soluţie tampon
4. Deshidratarea cu etanol, acetonă sau propilen oxid
5. Includerea în răşini epoxidice (Epon 812, Vestopal, Araldită). Includerea conduce la
obţinerea unui bloc de formă ovoidală de aproximativ 4/10 mm (de forma unei capsule de

41
 antibiotic), de consistenţă extrem de dură (ca a sticlei). Blocurile sunt montate în
portobiectul microtomului (fig.5).
6. Secţionarea la ultramicrotom se realizează automat (spre deosebire de microscopia optică
unde se acţionează manual manivela microtomului) şi sub lupă (fig.6); secţiunile poartă
denumirea de „ultrafine” şi au grosimi de aproximativ 50Å.
7. Etalarea pe grilă. Ultramicrotomul este prevăzut cu un dispozitiv de preluare a secţiunilor
şi etalarea lor pe grile. Dispozitivul este acţionat automat pentru a prelua 6-8 secţiuni
seriate şi a le ataşa pe o grilă rotundă cu diametru de 3 mm (fig.7). În microscopia
electronică, grila înlocuieşte lama de sticlă din microscopia optică.
8. Contrastarea. Faţă de microscopia optică unde preparatele sunt colorate cu coloranţi acizi,
bazici, neutri sau liposolubili, evidenţierea imaginilor pe secţiuni ultrafine este realizată
prin tratarea preparatului cu derivaţi de metale grele de tipul: acid fosfotungstic, acetat de
uranil, citrat de plumb, acid fosfowolframic etc. Alegerea şi aplicarea tipului de
contrastare depinde de tipul de preparat, de elementele ultrastructurale urmărite, de
metoda de fixare utilizată şi de mediul în care este incluzionat preparatul.
Imaginile furnizate de MET sunt alb-negru şi mai multe nuanţe de gri. În coloraţia
pozitivă, structurile biologice apar mai mult sau mai puţin dense pe un fond clar, de
exemplu proteinele sunt elecronodense, iar lipidele apar electronoclare.
Unele preparate necesită metode speciale de contrastare cum sunt:
 Coloraţia negativă. Constă în depozitarea unui material electronodens în jurul
suprafeţelor şi în interiorul cavităţilor expuse examinării (asemănător negativului unei
fotografii). Este utilizată pentru studiul organitelor delimitate de endomembrane. În
acest scop sunt utilizaţi acidul fosfotungstic, molibdatul de amoniu, acetatul de uranil,
nitratul de uranil şi iodatul de cadmiu. Coloraţia negativă sau inversă permite
observarea particulelor izolate (de exemplu microtubuli, ribozomi, virusuri); acestea
apar clare pe un fond întunecat.
 Metalizarea preparatului are drep scop accentuarea contrastului şi creşterea rezistenţei
preparatului la bombardamentul electronic. Practic, tehnica constă în proiectarea
asupra suprafeţei ultrasecţiunii de cercetat a unui fascicul de atomi de uraniu, platină,
crom, aur, paladiu.
9. Examinarea pe ecranul fluorescent, alegerea imaginii de interes, fotografierea ei şi
interpretarea fotografiei.

42
 Fig.5. Portobiectul
ultramicrotomului şi
modul de introducere a
capsulei de incluzionare

Fig.6. Ultramicrotomul

A B

Fig.7. Efectuarea şi etalarea secţiunilor la ultramicrotom

A. vizualizarea efecteruării secţiunilor sub lupă;
B. Prelevarea secţiunilor seriate; C. Dispozitivul automat aşează secţiunile seriate pe grilă.

Metoda de îngheţare-fracturare (criofracturarea)

Este o metodă specială de studiu în microscopia electronică, utilizată pentru prelucrarea
ţesutului viu, deci care nu utilizează etapele de fixare şi includere. Metoda constă în
îngheţarea rapidă a ţesutului. Piesa este secţionată cu crioultramicrotomul. Gheaţa de pe
suprafaţa fracturată este sublimată în vid (toate etapele sunt realizate sub clopot de sticlă), iar

43
pe suprafaţa ţesutului se realizează o replică de platină-carbon. De regulă, prin această metodă
sunt studiate membranele cu scopul studiului 3D al acestor structuri (fig.8).

Fig.8. Imagine SEM -

criofracturarea membranei
celulei absorbante intestinale
la nivelul polului apical

Microscopul electronic scanning sau cu baleiaj (SEM)

SEM este prevăzut cu detectoare de electroni poziţionate deasupra preparatului. Acestea
realizează captarea electronilor reflectaţi, secundari, catodoluminiscenţi şi rX de la suprafaţa
preparatului. În plus, două bobine deflectoare asigură devierea periodică a fasciculului de
electroni incidenţi în direcţii perpendiculare pentru ca spotul de electroni să baleieze (fr.
balayer = a mătura) porţiunea de interes a preparatului. În acest fel, dacă TEM realizează o
imagine de ansamblu a câmpului microscopic în plan, SEM oferă imagini tridimensionale ale
obiectului de cercetat.

Microscopul electronic de înalt voltaj (MEIV)

Este o variantă a TEM cu o coloană cu lungime totală de 10m. Deoarece tubul de
accelerare este de dimensiuni mari, accelerarea electronilor este de aproximativ 10x mai mare
decât în cazul TEM, iar diferenţa de potenţial este de aproximativ 1.000.000 V. Acest voltaj
conferă electronilor suficientă energie cinetică pentru a penetra prin preparate cu grosime de
microni sau chiar prin întreaga celulă. Îmaginea rezultată este o „radioscopie celulară” care
evidenţiază ultrastructura întregii celule, fără a fi nevoie de secţiuni ultrafine.
Principalul avantaj al MEIV este acela că permite observarea în profunzime şi dă o
imagine tridimensională asupra celulei. Rezoluţia şi adâncimea câmpului sunt extrem de
performante pe toată grosimea preparatului.

44
 Informaţii oferite de microscopia electronică:
1. ultrastructura diferitelor tipuri celulare normale şi patologice
2. ultrastructura organitelor citoplasmatice
3. structura şi configuraţia macromoleculelor
4. studiul fenomenelor de transcripţie, translaţie, biosinteză proteică
5. ultrastructura virusurilor şi studiul mecanismelor de infecţie
6. modul de acţiune al unor substanţe asupra structurilor celulare (chimioterapice, pesticide)
7. localizarea reacţiilor imunologice
8. transportul ionic prin membrane
9. vizualizarea genelor şi aspecte de inginerie genetică etc.

Polimorfonuclear neutrofil Mitocondrii

Cromozom uman Plasmidă

Fig.9. Imagini de microscopie electronică de transmisie (TEM)

45
 Fig.10. Imagine SEM a
joncţiunii neuro-
musculare

Fig.11. Imagine SEM –

pseudopod pe care se
formează lamelipode şi
filopodii

Fig.12. Imagine SEM – Macrofag care Fig.13. Imagine SEM – Spermatozoizi

înglobează două globule roşii la suprafaţa unui ovocit

46
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

1. Vizualizaţi componentele microscopului electronic de transmisie din dotarea UMF

2. Observaţi pe ecranul fluorescent imaginile oferite de ME
3. Asistaţi la principalele etape de pregătire ale preparatelor de ME

III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1. Microscopul electronic de transmisie:

a. utilizează ca sursă de energie acceleraţia electronilor
b. permite studiul celulelor vii, colorate
c. utilizează ca sursă de energie fotonul
d. furnizează imagini alb-ngru şi gri
e. prezintă o rezoluţie superioară comparativ cu microscopia optică

2. Componentele microscopului electronic sunt:

a. lentile electromagnetice
b. lentile optice obişnuite
c. sursa de electroni
d. ecranul fluorescent
e. sistemul de vid

3. Care dintre afirmaţiile următoare sunt false?

a. SEM oferă imagini 2D
b. la SEM detectoarele de electroni sunt plasate deasupra preparatului
c. la SEM detectoarele de electroni sunt plasate sub preparat
d. SEM captează electronii transmişi
e. SEM captează electronii reflectaţi

4. Care dintre următoarele afirmaţii sunt adevărate?

a. TEM captează electronii catodoluminiscenţi

47
 b. TEM captează electronii rX
c. TEM captează electronii transmişi
d. electronii care ating direct nucleii atomilor sunt reflectaţi
e. electronii care traversează preparatul se numesc elecroni transmişi

5. Pregătirea materialului de examinat în ME presupune:

a. fixarea în glutaraldehidă 2,5 % şi tetraoxid de osmiu 1%
b. spălarea cu apă distilată
c. deshidratarea cu etanol, acetonă sau propilen oxid
d. includerea la parafină
e. efectuarea de secţiuni cu grosimi de 50Å

6. Secţiunile de microscopie electronică:

a. se obţin cu ajutorul ultramicrotomului
b. au grosimi de microni
c. se etalează pe grile
d. sunt colorate cu diferiţi coloranţi
e. sunt contrastate cu acetat de uranil

7. Imaginile oferite de ME:

a. sunt colorate
b. apar în nuanţe alb-negru
c. pot fi examinate pe ecranul fluorescent
d. pot fi fotografiate
e. mărirea este realizată de lentile electromagnetice

Data
.....................................
Semnătura
Calificativ......................... cadrului didactic
......................................................

48
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 4

TEHNICI DE MICROSCOPIE OPTICĂ

EFECTUAREA PREPARATELOR MICROSCOPICE

I. NOŢIUNI TEORETICE

Cu excepţia ouălor (de exemplu oul de struţ, de găină etc.) celulele sunt prea mici
pentru a putea fi observate cu ochiul liber. Cele mai utilizate metode pentru studiul celulelor
sunt tehnicile de observaţie pe preparate microscopice. Metoda observaţiei se poate realiza în
două moduri:
A ) “in vivo” şi “in situ” permite observarea celulelor vii la locul lor de origine. Astfel se pot
urmări:
 mişcări ale celulelor care sunt antrenate de curenţi: sanguin şi limfatic;
 mişcări proprii celulare realizate de diferenţierile ectocitoplasmatice (cili, flageli,
pseudopode, văluri de membrană);
 mişcări intracelulare: curenţi citoplasmatici, mişcări specifice ale componentelor
celulare (mitocondrii, centrioli, cromozomi etc.).
Dezavantajele metodei: este limitată, necesită aparatură complexă.
B ) “in vitro” permite observarea celulelor vii sau moarte în afara organismului.
Observaţia se realizează pe preparate microscopice care se clasifică în:
a) Preparatele microscopice proaspete, temporare;
b) Preparatele microscopice fixate, durabile sau permanente.

PREPARATUL MICROSCOPIC PROASPĂT

În practica medicală, preparatul proaspăt poartă numele de „extemporaneu”, deoarece

permite medicului să stabilească în câteva minute diagnosticul. Pe lângă avantajul că permite

49
diagnosticul imediat, metoda este necostisitoare, nelaborioasă şi nu necesită un laborator cu
dotare complexă. Preparatul proaspăt are dezavantajul că se degradează rapid în timp (minute,
ore).

Materialele necesare (fig.1) pentru realizarea acestui tip de preparat sunt reprezentate de:
 lame,
 lamele,
 lichid conservant,
 material biologic,
 ± colorant vital.

Fig. 1. Componentele unui preparat proaspăt

Lamele şi lamelele
Lamele sunt confecţionate din sticlă neutră, de formă dreptunghiulară, au laturi paralele şi
dimensiuni de 76/26 mm şi o grosime de 1,5-2 mm. Lamelele sunt de formă pătrată sau
dreptunghiulară cu grosime de 0,15-0,18 mm şi dimensiuni de 18/18, 22/22 sau 22/32 mm.
Lichidul conservant
Celulele vii sunt plasate între lamă şi lamelă într-un lichid a cărui compoziţie este identică
sau apropiată cu cea în care se găsesc în organism. Acest lichid poartă numele de lichid
conservant şi are rolul de a menţine viabilitatea celulară. După provenienţă se clasifică în:
- natural: plasma pentru celulele sanguine, lichidul aminiotic pentru celulele fetale sau
lichidul cefalorahidian (L.C.R.) pentru celulele nervoase; umoarea apoasă; lichid
ascitic etc.;
- artificial: ser fiziologic (NaCl 9%o), soluţii îmbogăţite cu glucoză etc.
Coloranţii vitali
Deoarece structurile celulare sunt translucide în microscopia optică, pentru o mai bună
evidenţiere este necesară utilizarea coloranţilor vitali. Aceştia sunt substanţe coloidale
netoxice sau foarte puţin toxice, utilizate în diluţii mari (1/5000, 1/30.000) care evidenţiază
structurile celulare fără a influenţa metabolismul celular.

50
 Coloraţiile vitale sunt utilizate pentru evidenţierea aspectelor morfologice, dar şi
pentru studiul mecanismelor celulare de permeabilitate membranară, transport, acumulare
intracitoplasmatică, excreţie etc.
Coloranţii vitali se clasifică în:
 Electronegativi sau acizi:
- carmin litinat utilizaţi pentru studiul fibroblaştilor, monocitelor sanguine etc.;
- roşu Congo
- albastrul de trypan: utilizat în testul de viabilitate celulară (vezi Cap. „Culturi celulare”);
- tuşul de China: utilizat în studiul morfologiei şi viabilităţii spermatozoizilor.
 Electropozitivi sau bazici:
- roşu neutru: utilizat pentru evidenţierea vacuolelor de secreţie provenite din aparatul Golgi şi
în studiul granulocitelor;
- verde Janus: utilizat pentru evidenţierea mitocondriilor;
- albastrul de Nil sulfat: utilizat pentru studiul lizozomilor;
- albastrul de metilen: utilizat pentru studiul terminaţiilor nervoase;
- albastru crezil briliant: pentru reticulocite.
 Indiferenţi: substanţe din grupa Sudan-ului utilizaţi pentru evidenţierea anumitor tipuri de
incluziuni lipidice.
Coloranţii vitali se pot administra:
A. intravital – se injectează colorantul la animalul de laborator pe cale intravenoasă (de
exemplu în vena cozii la şoarece) sau subcutanată, apoi se practică sacrificarea
animalului, recoltarea şi efectuarea preparatului microscopic.
B. postvital – se sacrifică animalul de laborator, se practică recoltarea şi efectuarea
preparatului microscopic care se va colora cu colorantul vital.
Materialul biologic poate fi reprezentat de:
- organe mici întregi,
- fragmente de ţesuturi,
- celule disociate,
- culturi celulare,
- raclate de pe mucoase,
- biopuncţii din organe parenchimatoase sau biopuncţii cavitare,
- aspirate lichidiene.

51
 tică

II. ACTIVITATE PRACTICĂ

Confecţionarea preparatului vital din raclat de mucoasă bucală şi observarea

caracterelor celulare la microscopul fotonic

Interiorul cavităţii bucale este tapetat de celule aparţinând ţesutului epitelial pluri-
stratificat care se găsesc într-o permanentă reînnoire; dinspre membrana bazală spre suprafaţa
epiteliului aceste celule se dispun pe mai multe straturi, de la celulele tinere aşezate pe
membrana bazală, la celulele îmbătrânite şi moarte la nivelul suprafeţei mucoasei bucale.
Celulele moarte situate superficial se exfoliază, în timp ce alte celule din straturile subjacente
le vor înlocui. Prin raclare blândă celulele îmbătrânite şi moarte sunt uşor de prelevat şi de
examinat la microscop.
Caracterele morfologice ale celulelor bucale vor fi interpretate la microscopul fotonic,
utilizându-se obiective cu diferite puteri de mărire (fig.2 şi fig.3).

www.cepeg-rimouski.qc.ca
Fig.2. Celule bucale grupate, P.M = 400x Fig.3. Celulă bucală izolată, P.M = 1000x

Pregătirea materialelor necesare pentru efectuarea raclatului bucal:

1. lamă se şterg cu tifon, se degresează cu alcool sanitar şi se usucă;
2. lamelă
3. pipete pentru ser fiziologic şi colorant;

52
 4. material biologic – celule bucale obţinute prin raclajul mucoasei jugale;
5. lichid conservant – ser fiziologic;
6. colorant vital – albastru de metilen;
7. hârtie de filtru;
8. microscop optic.

Etapele de efectuare
1. se clăteşte cavitatea bucală cu apă de la robinet de 2-3 ori;
2. pe o lamă curată şi degresată se pune o picătură de ser fiziologic (fig.5a);
3. cu ajutorul unei lamele (sau spatulă) se recoltează celulele bucale prin raclajul uşor al faţei
interne a mucoasei jugale (fig.4);
4. celulele astfel prelevate se depun pe lamă peste lichidul conservant şi se emulsionează prin
mişcări de du-te-vino ale lamelei (fig.5a şi b);
5. lamela este lăsată să cadă peste materialul biologic (fig.5b);
6. se elimină excesul de lichid conservant cu ajutorul hârtiei de filtru. Un colţ al hârtiei de
filtru se apropie de marginea lamelei şi se aşteaptă absorbţia excesului de lichid (fig.5c);
7. se depune o picătură de albastru de metilen la marginea lamelei, înclinând uşor lama pentru
dispersia colorantului (fig.5d);
8. se elimină excesul de colorant cu ajutorul hârtiei de filtru;
9. se examinează la microscop.
De urmărit în observaţia celulelor mucoasei bucale:
a) pe preparatele necolorate:
- făcând parte din ţesutul epitelial, celulele apar de formă geometrică, poligonală;
- nucleul este mic, aşezat central, de formă rotund-ovalară;
- raportul nucleo/citoplasmatic este în favoarea citoplasmei;
- celulele apar delimitate de o membrană celulară refringentă.
b) pe preparatele colorate. Coloraţia oferă date suplimentare:
- celulele apar delimitate de o membrană plasmatică bine evidenţiată;
- nucleul este intens bazofil, colorat în albastru, limitat de o anvelopă nucleară şi conţinând
unul sau mai mulţi nucleoli rotunzi-ovalari;
- citoplasma apare colorată în bleu şi conţine numeroase granulaţii localizate cu predilecţie
în zona perinucleară; aceste granulaţii corespund organitelor citoplasmatice. La puterea de
mărire de 400x, 1000x şi în lipsa unor coloraţii specifice nu putem aprecia şi diferenţia
tipurile de organite pe care le vizualizăm.

53
 Fig.4. Prelevarea materialului biologic

Fig.

Fig.5. Etapele realizarii raclatului de mucoasă bucală

!!! Examinaţi la diferite puteri de mărire preparatele necolorate şi colorate de raclat bucal.

!!! Desenaţi celulele bucale, descriind elementele celulare observate.

!!! La fiecare desen notaţi tipul preparatului, puterea de mărire şi coloraţia utilizată.
Exemplu: Raclat bucal. Preparat proaspăt necolorat. PM 100x
Sau: Raclat bucal. Coloraţie albastru de metilen. PM 400x

54
a) Preparatul 1
.....................................................................................................................................

b) Preparatul 2
.........................................................................................................................................

c) Preparatul 3
...........................................................................................................................................

d) Preparatul 4
..........................................................................................................................................

55
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR:

1. Care dintre următoarele afirmaţii este adevărată:

a) metoda de bază utilizată în biologia celulară este metoda observaţiei
b) prin tehnici de microscopie pot fi vizualizate mişcările organitelor citoplasmatice
c) observaţia „in vitro” studiază celulele la locul lor de origine
d) observaţia celulelor „in situ” necesită aparatură complexă
e) nici o variantă

2. Coloranţii vitali sunt:

a) sunt substanţe toxice
b) au dezavantajul de a distruge structurile vii
c) sunt substanţe netoxice sau puţin toxice
d) pot fi electrononegativi şi electronopozitivi
e) toate variantele corecte

3. Care dintre următoarele afirmaţii este adevărată:

a) examenul extemporaneu permite diagnosticul imediat
b) examenul extemporaneu este utilizat în practica medicală
c) examenul extemporaneu este utilizat numai în cercetare
d) efectuarea preparatului proaspăt este costisitoare
e) nici o variantă

4. Pentru realizarea preparatului proaspăt sunt necesare:

a) lame
b) lamele
c) persoane specializate şi laborator complet utilat
d) lichid conservant
e) material biologic

56
5. Caracterele morfologice ale celulei bucale sunt:
a) au formă geometrică, poligonală
b) prezintă prelungiri
c) sunt delimitate de o membrană celulară refringentă
d) prezintă 2 sau mai mulţi nuclei
e) fac parte din ţesuturile epiteliale

6. Colorarea oferă următoarele date suplimentare:

a) nucleii intens bazofili
b) citoplasma este omogenă
c) se pot observa 1 sau mai mulţi nucleoli
d) granulaţiile din citoplasmă corespund organitelor citoplasmatice
e) membrana celulară apare refringentă

7. Observaţia in situ permite :

a) studiul mişcărilor celulelor care sunt antrenate de curenţi: sanguin şi limfatic;
b) studiul mişcărilor proprii celulare realizate de diferenţierile ectocitoplasmatice
(cili, flageli, pseudopode, văluri de membrană);
c) observarea mişcărilor intracelulare: curenţi citoplasmatici, mişcări specifice ale
componentelor celulare (mitocondrii, centrioli, cromozomi etc.).
d) studierea celulelor fixate (moarte)
e) studiul culturilor celulare

8. Materialul biologic poate fi reprezentat de:

a) culturi celulare,
b) raclate de pe mucoase,
c) biopuncţii din organe parenchimatoase
d) biopuncţii din organe cavitare
e) aspirate lichidiene.

9. Coloranţii vitali electronegativi:

a) sunt utilizaţi în studiul monocitelor
b) sunt reprezentaţi de carminul litinat şi roşu de Congo
c) tuşul de China este utilizat în studiul aparatului Golgi

57
 d) albastrul de trypan este utilizat în studiul lipidelor

10. Coloranţii vitali electropozitivi

a) sunt bazici
b) sunt reprezentaţi de roşu neutru, verde Janus, albastru de metilen
c) roşu neutru se utilizează pentru colorarea mitocondriilor
d) albastru de Nil sulfat este utilizat în studiul lizozomilor
e) permit evidenţierea reticulocitelor

Data

..........................................

Calificativ......................... Semnătura cadrului didactic

...................................................

58
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 5

PREPARATUL MICROSCOPIC FIXAT (DURABIL)

I. NOŢIUNI TEORETICE

Preparatul microscopic fixat (durabil sau permanent) permite studierea detaliată a

structurilor celulare pe secţiuni fine şi colorate care au avantajul de a se păstra timp îndelungat
(zeci de ani). Au însă dezavantajul de a fi costisitoare şi laborioase deoarece realizarea lor
necesită laborator şi personal specializat, competenţă şi rigurozitate; de asemenea, nu dau un
diagnostic imediat, efectuarea lor durează zile, uneori săptămâni.
Preparatele microscopice fixate se pot realiza prin următoarele metode:
 metoda etalării materialului biologic în monostrat folosită pentru realizarea frotiurilor şi a
amprentelor de organe:
- frotiul este utilizat pentru studiul celulelor aflate în suspensie, de exemplu frotiurile sanguine
şi de măduvă osoasă care permit stabilirea diagnosticului de leucemie sau frotiurile vaginale
utilizate pentru diagnosticul infecţiilor sau cancerelor din sfera genitală.
- amprenta se realizează prin aplicarea repetată (seriată) pe lamă a feţei unei secţiuni dintr-un
fragment de organ; metoda este utilizată pentru studiul celulelor uşor disociabile: de exemplu
din timus, ganglioni, ficat, pancreas etc.
 metoda efectuării secţiunilor citologice
Realizarea unui preparat microscopic fixat prin metoda secţiunilor fine se derulează pe
parcursul mai multor etape succesive: recoltarea, fixarea, spălarea, incluzionarea, secţionarea,
colorarea, montarea şi etichetarea. Unele dintre aceste etape pot fi modificate sau omise în
funcţie de tehnica aleasă şi de scopul urmărit.
La realizarea preparatului microscopic fixat se pot produce artefacte (imagini artificiale
datorate defectelor de tehnică): strivire la recoltare, întârzierea fixării, fixator prea mult sau
prea puţin concentrat, striaţii datorate cuţitului la secţionare, formare de depozite de colorant,
bule de aer între lamă şi lamelă rezultate dintr-o montare defectuoasă etc.

59
 I. Recoltarea este etapa prin care se obţine materialul biologic. Se poate efectua prin:
 biopsie care constă în prelevarea unui fragment de ţesut sau organ; de exemplu biopsie
ganglionară, cutanată;
 puncţie-biopsie presupune obţinera materialului biologic cu ajutorul unui tub ascuţit
(trocar); de exemplu puncţia hepatică, renală, de sân, sternală pentru măduva hematogenă;
 aspiraţii endoscopice pentru recoltarea produselor biologice din organele cavitare;
 raclate de pe mucoase: de exemplu raclat de mucoasă bucală, vaginală etc;
 piese citologice obţinute intraoperator;
 recoltarea materialului biologic de la cadavre în urma necropsiei;
 prelevarea materialului biologic de la animalele de laborator după sacrificarea lor (fig.1);
Materiale necesare: masă de disecţie, plăci de plută sau P.V.C., aparat de contenţie în
cazul recoltării de la animale sub anestezie, trusă chirurgicală sterilă (fig.2).
Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească piesa citologică:
- se recoltează rapid, steril, direct în fixator pentru a preveni putrefacţia;
- piesa să fie orientată pe secţiune, să aibă feţele plane şi paralele;
- să se evite strivirea;
- dimensiunile fragmentului: 5/5/5 mm.

Fig.1. Recoltarea materialului

biologic de la animalul de laborator Fig.2. Trusa chirurgicală

II. Fixarea este etapa care urmăreşte omorârea bruscă a celulelor, cu păstrarea intactă a
structurii piesei citologice. Are drept scop întreruperea bruscă a proceselor vitale, prevenirea
putrefacţiei, întărirea consistenţei şi electivităţii ţesuturilor pentru diferiţi coloranţi. Se
realizează cu ajutorul fixatorilor care se clasifică în:
a) Fixatori fizici: căldura uscată, uscarea în vid, congelarea

60
 b) Fixatori chimici:
 după compoziţie fixatorii chimici pot fi:
- simpli: formol, alcool etilic, alcool metilic, acid acetic, acid tricloracetic, acid picric;
- compuşi: amestecuri de fixatori simpli;
 după utilizare fixatorii se clasifică în:
- universali: formol, Bouin;
- specifici: Regaud şi Maximov – utilizaţi pentru studiul mitocondriilor, Carnoy – utilizat
pentru studiul acizilor nucleici, Da Fano – permite impregnarea argentică pentru studiul
aparatului Golgi;
Un bun fixator trebuie să aibă penetrabilitate mare, să nu modifice structura celulară, să nu
producă coagulări sau precipitări.
Condiţii de fixare:
- să se facă imediat după recoltare,
- fixatorul să fie ales conform scopului urmărit,
- volumul fixatorului să fie de 50 de ori mai mare decât volumul piesei citologice,
- temperatura de fixare adecvată tipului de fixator (ex. Carnoy la 4C, în sticle brune),
- durata fixării variază în funcţie de ţesut şi scopul urmărit (1 oră - 4 zile).
Există unele situaţii speciale de fixare, de exemplu:
- pentru organele cavitare se practică o dublă fixare, atât în exterior, cât şi în interior,
- ţesuturile dure (oase) se decalcifică cu acizi tari, se neutralizează, apoi se fixează cu
Bouin.

III. Spălarea este etapa care urmăreşte oprirea acţiunii fixatorului şi înlăturarea
acestuia din piesa citologică. Se realizează cu apă de robinet, apă distilată, alcool diluat (60-
70%), utilizându-se recipiente speciale, cu baza perforată. Durata spălării este egală cu durata
fixării.

IV. Incluzionarea este etapa care conferă piesei citologice elasticitate şi rezistenţă în
vederea secţionării la microtom. Incluzionarea se poate realiza la parafină (uzual), în
celoidină (organe mici întregi – de exemplu globul ocular), în gheaţă (pentru tehnicile de
citochimie sau citoenzimologie).
Parafina este un amestec de hidrocarburi alifatice care nu este miscibilă cu apa sau
alcoolurile, dar este miscibilă cu hidrocarburile benzenice. Deoarece materialul biologic

61
conţine apă în urma etapei de spălare, tehnica includerii în parafină presupune efectuarea unor
timpi operatori succesivi care urmăresc înlocuirea apei din piesa citologică cu unul din
solvenţii parafinei (benzen, toluen sau xilen):
a) Deshidratarea se realizeză în 4-6 băi succesive de alcool de concentraţii crescânde 50-
100%, în truse de pahare Borel la temperatura camerei (fig.3);
b) Clarificarea se realizează în 3 băi succesive cu un solvent al parafinei (de exemplu
benzen), în truse de pahare Borel la temperatura camerei ;
c) Parafinarea se realizează în 3 băi succesive de parafină în termostat de includere la
56C (fig. 4);
d) Turnarea blocului de parafină se face cu ajutorul lamelelor Leukard (fig.5), urmărind
orientarea piesei în funcţie de planul de secţiune; urmează etichetarea şi solidificarea
blocului de parafină la temperatura camerei (fig.6);
e) Modelarea blocului şi montarea lui în port-obiectul microtomului.

Fig.3. Trusa de pahare Borel

Fig.4. Termostat includere la parafină

Fig.5. Lamele Leukard Fig.6. Bloc de parafină

V. Secţionarea este etapa care urmăreşte obţinerea unor secţiuni fine cu grosime de 5-7-
10m. Se realizează cu ajutorul unui aparat numit microtom. Acesta este alcătuit din: port-
obiect, port-brici, viza micrometrică, manivelă (fig.7).

62
 După secţionare urmează lipirea secţiunii pe lamă (fig.8):
- pe lama curată, degresată, unsă cu albumină Mayer se adaugă o picătură apă distilată, se
aşează secţiunea pe lamă, se încălzeşte uşor la lampa de spirt pentru a mări adezivitatea, apoi
se aşează pe stativ, la termostat la 37C, 12 ore (fig.9).

Fig.7. Microtomul

Fig.8. Secţionarea şi lipirea pe lamă

Fig.9. Aşezarea preparatelor

parafinate pe stativ şi
introducerea la termostat, la 37ºC

VI. Colorarea este operaţiunea care permite diferenţierea structurilor celulare pe baza
afinităţii lor faţă de diferiţi coloranţi.
1. Clasificarea metodelor de colorare:
a) după timpul de menţinere în colorant:
 progresive: piesa citologică este supusă unor timpi succesivi de colorare, spălare şi
control microscopic până în momentul în care se obţine nuanţa de culoare dorită;
 regresive: se realizează o supracolorare a preparatului care va colora şi alte structuri
decât cele dorite, apoi cu ajutorul substanţelor decolorante dau diferenţiatori, se
îndepărtează excesul de colorant.

63
 b) după numărul coloranţilor utilizaţi se clasifică în coloraţii:
 monocrome: se utilizează un singur colorant – de exemplu colorarea raclatului de
celule bucale cu albastru de toluidină,
 bicrome: atunci când se utilizează doi coloranţi – de exemplu coloraţia hematoxilină-
eozină (HE),
 policrome: atunci când se utilizează mai mulţi coloranţi – exemplu coloraţia May-
Grunwald-Giemsa (MGG).
c) după utilizare, metodele de colorare pot fi:
 generale - utilizate pentru studierea structurilor celulare în ansamblu (exemplu HE);
 specifice- utilizate pentru evidenţierea anumitor structuri celulare (de exemplu
coloraţia Heidenhein pentru evidenţierea mitocondriilor sau cromozomilor).
d) după laboriozitate:
 simple (exemplu: coloraţia cu albastru de toluidină)
 complexe (exemplu: coloraţia Sudan III, IV pentru lipide).

2. Metode complexe de colorare:

 Metoda impregnării cu săruri ale metalelor grele (Au, Ag, Cr)
Principiul metodei. Această metodă este bazată pe proprietatea sărurilor metalelor grele
de a se reduce la suprafaţa substratului, generând o pulbere fină de culoare închisă (brun,
negru). Metoda este utilizată specific pentru evidenţierea morfologiei celulelor nervoase, a
structurilor celulare precum neurofibrile, aparat Golgi şi a fibrelor de reticulină din matricea
extracelulară.

Exemplu. Impregnarea argentică Ramon Y Cajal, Metoda Golgi

 Metacromazia
Principiul metodei. Metacromazia se bazează pe fenomenul de schimb al culorii în
funcţie de pH-ul substratului. De exemplu, albastrul de toluidină poate colora în albastru-
verzui sau în roşu granulele metacromatice din mastocit.
 Mordansarea
Principiul coloraţiei. Substratul nu acceptă colorantul, decât după o prealabilă tratare cu o
substanţă numită mordant. Exemplu. Coloraţia Heidenhein cu hematoxilină ferică (mordant).
Acestă metodă de colorare este utilizată pentru evidenţierea mitocondriilor, cromozomilor şi
are afinitate pentru hematii.

64
3. Colorantul este o substanţă chimică, capabilă să cedeze propria culoare substratului.
Clasificarea coloranţilor:
a) după provenienţă: - naturali:  de origine animală: carminul,
 de origine vegetală: hematoxilina, orceina, safranina
- sintetici: pe bază de anilină
b) după afinitatea faţă de substrat: acizi, bazici, neutri, indiferenţi.
 coloranţii bazici sau cationici
- prezintă doi radicali: un radical bazic colorat şi un radical acid incolor;
- au afinitate pentru substraturi celulare încărcate negativ: de exemplu nuclei, citoplasma
celulelor tinere, granulaţiile bazofile din polimorfonucleare;
- substraturile care se colorează cu coloranţi bazici se numesc substraturi bazofile, iar
proprietatea poartă numele de bazofilie;
- exemplu de coloranţi bazici: hematoxilina (colorează substraturile în albastru-mov),
tionina, triada de albastru: de metilen, trypan, toluidină (colorează substraturile în albastru).
 coloranţii acizi sau anionici
- au doi radicali: un radical acid colorat şi un radical bazic incolor;
- au afinitate pentru substraturile încărcate pozitiv: citoplasma celulelor adulte şi
îmbătrânite, fibrele de colagen, granulaţiile acidofile din polimorfonucleare;
- substraturile care se colorează cu coloranţi acizi se numesc substraturi acidofile, iar
proprietatea poartă numele de acidofilie;
- exemplu de coloranţi acizi: eozina (colorează substratul în roz-roşu), fuxina acidă
(colorează în roşu), verde de lumină (colorează în verde), orange G (colorează în portocaliu).
 coloranţii neutri
- au ambii radicali coloraţi, conţin grupări cationice şi anionice şi sunt alcătuiţi din soluţii
apoase de coloranţi acizi şi coloranţi bazici.
- prezintă afinitate pentru substraturile neutre (granulaţiile neutrofile din
polimorfonucleare), proprietate care poartă numele de neutrofilie.
- exemplu de coloranţi neutri: eozinatul de albastru de metilen şi eozinatul de azur de
metilen care colorează substraturile în violet.
 coloranţii indiferenţi (liposolubili)
- sunt utilizaţi pentru evidenţierea grăsimilor, colorează prin dizolvare în substrat;

65
 - exemplu de coloranţi liposolubili: Sudan III, Sudan IV – colorează lipidele simple în
galben-portocaliu, Sudan negru B şi tetraoxid de osmiu care colorează lipidele complexe în
negru.

Coloraţia hematoxilină-eozină (H.E.)

Este o metodă de colorare bicromă, progresivă şi generală, utilizată pentru
evidenţierea tuturor tipurilor celulare. Se execută în truse de pahare Borel, în mai mulţi timpi:
1. Deparafinarea – 3 băi succesive cu unul din solvenţii parafinei (benzen, xilen, toluen)
2. Hidratarea – 4 băi de alcool etilic de concentraţii descrescânde, până la apă distilată;
3. Colorarea cu hematoxilină – 3-5 minute;
4. Spălarea şi diferenţierea – cu apă de robinet, care înlătură excesul de colorant şi
întăreşte colorarea, controlul nuanţei de culoare la microscop;
5. Colorarea cu eozină – 2-5 minute;
6. Spălarea şi diferenţierea – cu apă distilată, control la microscop.
!!! Principiul metodei:
 hematoxilina (colorant bazic) colorează nucleii în violet;
 eozina (colorant acid) colorează citoplasmele în roz-roşu.

VII. Montarea este etapa prin care secţiunea colorată este acoperită cu o substanţă
conservantă, transparentă (mediu de montare), în vederea menţinerii timp îndelungat. Se
realizează în mai mulţi timpi:
1. deshidratarea – 3 băi de alcool etilic de concentraţii crescânde;
2. clarificarea – 3 băi succesive de benzen;
3. acoperirea cu mediul de montare - balsam de Canada;
4. acoperirea cu lamelă şi etichetarea – se notează tipul de ţesut, metoda de colorare,
data, numele bolnavului.

66
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

!!! De efectuat recoltarea şi fixarea materialului biologic.

!!! De studiat la microscopul fotonic preparate fixate colorate.
Fiecare student va examina preparatele microscopice, va desena structurile observate
în microscop şi va nota tipul celular, metoda de coloraţie, puterea de mărire utilizată; de
asemeni va urmări principiile metodelor de colorare.

1. Preparatul
.....................................................................................................................................

2. Preparatul
.......................................................................................................................................

67
3.Preparatul
.................................................................................................................................................

4. Preparatul
.............................................................................................................................................

68
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR:

1. Care dintre afirmaţiile de mai jos sunt adevărate:

a) preparatul microscopic fixat se realizează uşor
b) preparatul microscopic fixat se menţine zeci de ani
c) preparatul microscopic fixat permite un diagnostic rapid
d) preparatul microscopic fixat presupune dotare complexă şi personal specializat
e) Preparatul fixat se realizează sub formă de secţiune

2. Care dintre afirmaţiile de mai jos sunt adevărate:

a) recoltarea urmăreşte obţinerea materialului biologic
b) materialul biologic poate fi obţinut numai la autopsie
c) recotarea este urmată de fixare
d) durata fixării este în funcţie de scopul urmărit
e) fixarea este urmată de etapa de spălare

3. Care dintre afirmaţiile de mai jos sunt adevărate:

a) Etapa de includere la parafină ofera piesei citologice rezistenţă şi elasticitate
b) Etapa de includere la parafină se efectuează în truse de pahare Borel
c) Deshidratarea urmăreşte înlocuirea apei din piesă cu benzen
d) Secţionarea se efectuează la microtom
e) Spălarea se realizează cu detergenţi

4. Coloraţia hematoxilină-eozină:
a) este o metodă de colorare generală
b) este utilizată pentru studiul structurilor celulare în ansamblu
c) este utilizată pentru studiul tuturor tipurilor celulare
d) permite evidenţierea neurofibrilelor
e) este o metodă de colorare policromă

69
 5. Care dintre metodele de colorare sunt considerate complexe
a) Metacromazia
b) Impregnarea argentică Golgi
c) Coloraţia hematoxilină-eozină
d) Coloraţia albastru de toluidină
e) Metoda Heidenhein

6. Care dintre următoarele afirmaţii este adevărată ?

a) coloranţii acizi au afinitate spre substraturile bazice
b) substraturile acidofile sunt încărcate negativ
c) nucleii celulari sunt substraturi bazofile
d) granulaţiile acidofile din polimorfonucleare se colorează cu coloranţi acizi
e) granulaţiile bazofile din polimorfonucleare se colorează cu coloranţi acizi

7. Care dintre următoarele afirmaţii este adevărată ?

a) montarea urmăreşte acoperirea piesei citologice cu un mediu de montare în
vederea menţinerii acestuia timp îndelungat
b) substanţa utilizată este balsamul de Canada
c) prima etapă a montării presupune utilizarea soluţiilor de alcool de concentraţii
descrescânde
d) clarificarea presupune utilizarea soluţiilor de alcool etilic
e) etichetarea presupune notarea tipului de ţesut, metodei de colorare, datei şi
numelui bolnavului.

Data
.....................................
Calificativ................... Semnătura
cadrului didactic
......................................................

70
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 6

CONFECŢIONAREA, COLORAREA ŞI INTERPRETAREA

FROTIULUI DIN SÂNGE PERIFERIC

I. NOŢIUNI TEORETICE

Coloraţia May-Grunwald-Giemsa (M.G.G.)

Este utilizată pentru studiul elementelor sanguine din sângele periferic, măduva
hematopoetică şi L.C.R. Ambele soluţii (May Grunwald şi Giemsa) sunt amestecuri de
coloranţi acizi, bazici şi neutri.
1. Confecţionarea frotiului de sânge
- locul de recoltare este laterala pulpei degetului inelar la adult, lobul urechii la
copil, laterala halucelui sau călcâi la nou născut şi sugar;
- locul de recoltare se dezinfectează cu alcool sanitar şi se degresează cu eter;
- se face o înţepătură de 2-3 mm adâncime, cu ac steril;
- se îndepărtează prima picătură deoarece conţine mult lichid interstiţial şi un
număr redus de celule sanguine;
- se prelevează următoarea picătură cu ajutorul lamei efector;
- se aşează lama efector sub un unghi de 45 peste lama port-obiect;
- se întinde frotiul cu o mişcare unică, în monostrat, neondulat (fig.1);
- se usucă la temperatura camerei.

Fig.1. Aşezarea lamei efector peste lama port-obiect (stg); întinderea frotiului (dr.)

71
2. Timpii coloraţiei rapide M.G.G.:
Colorarea se efectuează în trusa Borel şi utilizează 3 soluţii:
 fixarea se realizează prin introducerea repetată (de 15 ori) a lamei port-obiect în soluţia
Nr.1;
 colorarea cu soluţie May Grunwald prin introducerea repetată (de 15 ori) a lamei
port-obiect în soluţia Nr.2;
 colorarea cu soluţia Giemsa introducerea repetată (de 15 ori) a lamei port-obiect în
soluţia Nr.3;
 spălarea cu jet blând de apă distilată sau apă de robinet;
 uscarea la temperatura camerei şi examinarea la microscop.

3. Caracterele morfologice ale celulelor sanguine (fig.2)

1. Hematiile (eritrocitele adulte, circulante) sunt de formă rotundă, biconcave pe profil, cu
diametre cuprinse între 7,2-7,5 m. Sunt celule anucleate, iar în coloraţia MGG apar roşii-
cărămizii.
2. Leucocitele
a) Granulocitele (polimorfonucleare) au dimensiuni cuprinse între 12-15 m şi se recunosc
după următoarele caractere morfologice:
 Granulocitele segmentate :
- neutrofile – nucleu polilobat de culoare violet, citoplasma cu granulaţii fine
colorată violet deschis;
- acidofile (eozinofile) – nucleu bilobat de culoare violet, citoplasma prezintă
granulaţii grosiere colorate în roşu;
- bazofile – nucleu bilobat de culoare violet, citoplasma prezintă granulaţii grosiere
colorate în albastru-violet intens;
 Granulocitele nesegmentate sunt forme tinere de PMN neutrofile. Se recunosc
după forma de „S” a nucleului.
b) Agranulocitele prezintă următoarele caractere morfologice:
 Monocitele sunt cele mai mari celule din sânge, au diametre cuprinse între 23-
25m; nucleul se colorează violet şi are formă de potcoavă sau rinichi (nucleu
reniform); citoplasma se colorează slab bazofil în bleu.

72
  Limfocitele au diametre cuprinse între 8-12 m, nuclei mari bazofili (coloraţi în
violet intens), cu raportul nucleo/ citoplasmatic în favoarea nucleului; citoplasma
în cantitate redusă, împinsă la periferie, de formă semilunară, colorată slab bazofil
în bleu.
!!! Deşi in vivo leucocitele sunt celule cu formă variabilă datorită emiterii de pseudopode, pe
frotiu ele apar rotunde deoarece fixarea realizează omorârea bruscă a celulelor; ori, moartea
celulară presupune şi retragerea pseudopodelor.
3. Trombocitele (plachetele sanguine) au forme neregulate, diametre care nu depăşesc 1-2m,
se colorează în violet deschis şi sunt dispuse în grupuri.

Fig.2. Caracterele morfologice de recunoaştere a celulelor din sângele periferic

Formula hemo-leucocitară normală
1) hematii: 4.000.000-5.000.000/mm3
2) leucocite: 6.000-9.000/mm3 :
 granulocite PMN neutrofile nesegmentate: 1-4%,
 granulocite PMN neutrofile segmentate: 55-65%,
 PMN acidofile (eozinofile): 2-4%,
 PMN bazofile: 0,5-1%
 limfocite: 25-28%,
 monocite: 2-8%,
3) trombocite : 200.000-300.000/mm3.
!!! Procentele leucocitelor trebuie să sumeze 100%. Creşterea procentuală a unui tip de
leucocit se face pe seama scăderii corespunzătoare a unuia sau mai multe alte tipuri.

73
Variaţii ale cifrelor absolute sau procentuale şi patologia aferentă
Valorile în cifre absolute pentru numărul de hematii, leucocite şi trombocite necesită
utilizarea unor tehnici speciale de numărare, dar diagnosticul maladiilor hematologice se
stabileşte numai prin interpretarea frotiului de sânge periferic şi frotiului de măduvă
hematopoetică.
Modificările patologice ale eritrocitelor:
a) Anomalii numerice ale hematiilor:
 diminuarea volumului globular total caracterizează sindromul anemic, compensat parţial
prin creşterea volumului plasmatic; sângele este mai diluat şi mai sărac în hemoglobină.
 creşterea volumului globular total caracterizează sindromul poliglobulic, compensat
parţial prin scăderea volumului plasmatic; sângele este mai concentrat şi mai bogat în
hemoglobină.
b) Anomalii de formă ale hematiilor:
 sferocitele – eritrocite rotunde, care nu prezintă concavitate, luând forma unei sfere. Pe
frotiu sunt mai mici şi mai bine colorate decât hematiile normale. Sunt prezente în anemii
hemolitice dobândite sau în icterul hemolitic congenital.
 echinocitele – prezintă pe suprafaţa lor prelungiri egale localizate echidistant şi a căror
apariţie reversibilă este determinată de diminuarea ATP-ului intra- şi extracelular. Apariţia lor
ireversibilă caracterizează celulele îmbătrânite.
 acantocitele – hematii de formă rotundă cu prelungiri inegale, situate la distanţe variabile;
se întâlnesc în maladii precum ciroza.
 ovalocite – eritrocite de formă ovală; se întâlnesc în ovalocitoza constituţională.
 drepanocitele – eritrocite în formă de seceră sau virgulă se întâlnesc în hemoglobinopatii,
talasemii, deficit de fier.
 celulele în ţintă – sunt hematii care se caracterizează prin margine şi centru bine colorate
în roz, între margine şi centrul celulei se află o zonă inelară clară; se întâlnesc la persoanele
splenectomizate şi în anemiile hipocrome.
 poikilocitoza – reprezintă deformarea pronunţată a hematiilor ce apar sub formă de pară,
rachetă de tenis, dantelate, cu contur neregulat, foarte diferite ca talie; se întâlnesc în anemii
grave.
c) Anomalii de colorabilitate:
 eritrocite hipocrome sunt mai palide, mai slab încărcate cu hemoglobină decât cele
normale;

74
 eritrocite hipercrome sunt mai intens colorate pe frotiu, dar aceasta nu se datorează
creşterii concentraţiei de hemoglobină;
 anizocromia – caracterizează frotiul care conţine eritrocite hipocrome şi normocrome;
 eritrocite bazofile apar în coloraţia panoptică într-o nuanţă albăstruie sau eritrocite
policromatofile apar în coloraţia panoptică roz-cenuşiu şi albastru-violet; coloraţia vitală cu
albastru de crezil arată că acestea sunt de fapt reticulocite.
d) Anomalii de dimensiune:
 anizocitoza reprezintă variaţia mare de talie între eritrocitele de pe un frotiu.
 macrocitele – reprezintă creşterea dimensiunilor hematiilor între 8-10µ (apar în
insuficienţa hepatică); când diametrul hematiei depăşeşte 10µ vorbim despre megalocite (apar
în anemii megaloblastice).
 microcitele – sunt eritrocitele cu diametrul mai mic de 5-6µ; este elementul caracteristic în
anemiile hipocrome feriprive.
 schizocitele – eritrocitele cu diametru mai mic de 2-4µ, rotunde sau deformate, de obicei
hipocrome; se întâlnesc în anemii grave.

Modificările patologice ale leucocitelor:

Anomalii numerice ale granulocitelor:
 granulocitoza se caracterizează prin creşterea numărului de granulocite peste 9.000/mm3;
 granulopenia se caracterizează prin scăderea numărului de granulocite sub 3.000/mm3.
a) anomalii numerice ale neutrofilelor:
 neutrofilia reprezintă creşterea numărului de neutrofile; se întâlneşte în infecţii acute,
acidoză diabetică, uremie, intoxicaţii exogene cu digitală, săruri de mercur, după hemoragie
acută, în neoplasme cu evoluţie rapidă, leucemia mieloidă cronică.
 neutropenia reprezintă scăderea numărului de neutrofile; se întâlneşte în unele boli
infecţioase precum febra tifoidă, paratifoidă, bruceloză; în boli virale precum gripa, rujeolă,
rubeolă etc.
b) anomalii numerice ale eozinofilelor:
 eozinofilia reprezintă creşterea numărului de eozinofile peste 300 elemente/mm3; se
întâlneşte în stări alergice, dermatoze, boli parazitare, boala Hodgkin, leucemia cu eozinofile,
leucemia mieloidă cronică.
 eozinopenia reprezintă scăderea numărului de eozinofile; apare în faza de debut din bolile
infecţioase, intoxicaţii, după administrare de hormoni corticoizi sau ACTH.

75
 c) anomalii numerice ale bazofilelor:
 bazofilia reprezintă creşterea numărului de bazofile; apare în leucemiile mieloide cronice,
în unele ciroze hepatice şi ictere hemolitice.
Anomalii de talie ale granulocitelor:
 granulocitele gigante sunt granulocite de talie mare, cu diametre cu 4-5µ mai mari decât
cele normale. Dacă este segmentat şi prezintă mai mulţi lobi acest tip de granulocit poartă
numele de macropolicit, iar dacă este imatur, nesegmentat se numeşte metamielocit gigant.
Se întâlnesc în anemiile megaloblastice.
 pleiocariocitele sunt granulocite adulte cu mai mult de 5 lobi nucleari; se întâlnesc în
anemiile megaloblastice.
Anomalii ale limfocitelor:
 limfocitoza reprezintă creşterea numărului de limfocite; apare în cazuri fiziologice la copii,
în afecţiuni precum tusea convulsivă, monucleoza infecţioasă, toxoplasmoză, agranulocitoză
etc.
 limfopenie reprezintă scăderea numărului de limfocite; se întâlneşte în maladii
caracterizate prin scăderea capacităţii de apărare a organismului – SIDA.
Anomalii ale monocitelor:
 monocitoza – creşterea numărului de monocite peste 800 elemente/mm3; se întâlneşte în
afecţiuni precum: tifos exantematic, endocardita lentă, reumatismul articular acut, malaria,
mononucleoza infecţioasă etc.
 macromonocitele sunt monocite cu talie mare, apar în maladia Osler.
 modificări de culoare – au fost semnalate monocite vacuolizate în maladia Niemann-Pick.
 modificări de formă – au fost semnalate în maladii toxiinfecţioase grave, unde apar cu
nucleu polilobat, în formă de treflă.

Modificările patologice ale trombocitelor:

Anomalii numerice ale trombocitelor:
 trombocitopenia reprezintă scăderea numărului de trombocite; se întâlneşte în atingere
medulară prin factori exogeni (raze X, izotopi radioactivi, antibiotice, sedative, citostatice),
hipersplenism, metastaze medulare, deficit de vit. B12, de acid folic, boli imunologice,
coagulare intravasculară diseminată.
 trombocitoza – reprezintă creşterea tranzitorie a trombocitelor; apare după splenectomie,
după hemoragie, după intervenţii chirurgicale, în cancere viscerale.

76
 trombocitemiile reprezintă creşterea marcată şi permanentă a numărului de trombocite
însoţită de o hiperplazie megacariocitară medulară; se întâlneşte în poliglobulia esenţială, în
leucemia mieloidă cronică.

II. ACTIVITATE PRACTICĂ

1. Se va efectua frotiul de sânge

2. Se va realiza coloraţia MGG.
3. Se vor examina caracterele morfologice ale celulelor sanguine începând cu
obiectivul de 10x până la imersie (pentru utilizarea imersiei vezi etapele
enumerate în lucrarea practică nr.1) .
4. Se vor desena celulele vizualizate în microscop. La fiecare tip celular se vor
face trimiteri referitoare la forma celulei şi a nucleului, colorabilitatea
citoplasmei şi a nucleului.
5. Pentru întocmirea formulei leucocitare se va examina frotiul pe margine,
deplasând lama într-o singură direcţie. Se vor număra 100 de leucocite notându-se în tabel
fiecare tip de leucocit numărat.

NS S E B L Mo
NUMĂR

77
Desenaţi celulele sanguine şi notaţi caracterele morfologice de recunoaştere

78
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR:

1. Coloraţia M.G.G. este:

a) utilizată pentru studiul celulelor nervoase
b) utilizată pentru studiul celulelor sanguine
c) utilizată pentru studiul celulelor din măduva hematopoetică
d) compusă din trei soluţii
e) utilizează numai coloranţi acizi

2. Valorile normale ale liniei albe sunt:

a) acidofile 1,2-8%
b) monocite 2.900/mm3
c) leucocite 3,2-4%
d) limfocite 45-65%
e) neutrofile segmentate 25-28%

3. Care din următoarele afirmaţii este adevărată:

a) numărul normal al trombocitelor este cuprins între 200.000-300.000/mm3
b) numărul normal al hematiilor este cuprins între 4.000.000-5.000.000/mm3
c) creşterea numărului de trombocite poartă numele de trombocitopenie
d) scăderea numărului de hematii poartă numele de poliglobulie
e) creştera numărului neutrofilelor poartă demunirea de neutrofilie

4. Care din următoarele afirmaţii este falsă:

a) creşterea numărului de neutrofile se întâlneşte în infecţii acute
b) apariţia eritrocitelor hipercrome se datorează creşterii concentraţiei de hemoglobină
c) dimensiunile trombocitelor sunt de 7,2-7,5µ
d) eozinofilele intervin în coagularea sângelui
e) creşterea numărului de eozinofile se întâlneşte în boli alergice

79
 5. În coloraţia M.G.G.:
a) nucleul hematiilor se colorează în roz-roşu
b) nucleul leucocitelor se colorează în violet închis
c) trombocitele se dispun grupat şi se colorează în violet închis
d) eozinofilele prezintă granulaţii fine roşu intens
e) bazofilele prezintă granulaţii grosiere de culoare violet închis

6. Care din următoarele afirmaţii este falsă:

a) nucleul neutrofilelor segmentate are forma literei „S”
b) nucleul monocitelor este reniform sau „bob de mazăre”
c) citoplasma neutrofilelor prezintă granulaţii fine violet deschis
d) monocitele au dimensiuni de aproximativ 25µm
e) nucleul eozinofilelor este bilobat

7. Care din următoarele afirmaţii este adevărată:

a) anizocitoza reprezintă variaţia de talie între eritrocitele de pe un frotiu
b) sferocitele nu prezintă concavitate, având forma unei sfere
c) in vivo leucocitele sunt celule cu formă fixă
d) citoplasma bazofilelor se colorează slab bazofil în bleu
e) trombocitele apar grupate pe frotiul de sânge

Data
.....................................
Calificativ................... Semnătura
cadrului didactic
......................................................

80
 LUCRARE PRACTICĂ NR. 7

METODE DE APRECIERE A DIMENSIUNILOR CELULARE :

MORFOMETRIA ŞI STEREOLOGIA

I. NOŢIUNI TEORETICE

Dimensiunile celulelor din lumea vie acoperă o scară largă. Dacă se compară diametrul
oului de struţ (considerată astăzi cea mai mare celulă din lumea vie) cu diametrul celei mai
mici bacterii, raportul este de 75.000/1. În regnul animal, celulele de acelaşi tip au dimensiuni
aproximativ egale; de exemplu un hepatocit de şoarece, uman sau de elefant are aceleaşi
dimensiuni (“legea constanţei volumului”). Volumul oraganului este dat de numărul celulelor,
nu de dimensiunile 2D sau 3D ale celulelor. Rezultă că dimensiunile celulelor de acelaşi tip
sunt constante indiferent de talia individului.
Există însă şi mici variaţii dimensionale determinate nu de individ ci de vârsta celulară
şi implicit de activitatea lor metabolică: o celulă tânără, cu activitate metabolică intensă are
dimensiuni mai mari decât o celulă îmbătrânită. Explicaţia constă în faptul că celula tânără
conţine o cantitate mai mare de apă care să-i catalizeze reacţiile moleculare, are o citoplasmă
mai abundentă cu un număr mai mare de organite, are un nucleu mai mare (eucromatic) cu
activitate de supraveghere metabolică mai accentuată, faţă de celula îmbătrânită care are o
activitate metabolică diminuată şi deci un număr redus de organite, o cantitate redusă de apă
şi un nucleu redus ca dimensiuni (picnotic).
Organismul uman este alcătuit din aproximativ 200 de tipuri de celule de forme şi
dimensiuni diferite. Diametrele celulare variază între 3 (capul spermatozoidului) şi 200
(ovocitul de ordinul II). După diametre, celulele se clasifică în izodiametrice (cu diametre
aproximativ egale) şi anizodiametrice (cu diametre inegale).
După dimensiuni, celulele izodiametrice se clasifică în trei categorii:
 Celule de talie mică, cu diametre sub 10.. Exemple: neuronii din stratul molecular
al scoarţei cerebrale (3-5), capul spermatozoidului (4-5), limfocitele mici (5-7),
hematiile adulte circulante (7,2-7,5), limfocitele mijlocii (7-9).

81
  Celule de talie mijlocie, cu diametre cuprinse între 10-30. Această categorie
cuprinde majoritatea celulelor din corpul uman. Exemple: granulocite (12-18),
monocite (25), condrocite (30), hepatocite, nefrocite, splenocite, enterocite,
histiocite, fibrocite etc.
 Celule de talie mare, cu diametre are depăşesc 30. Exemple: neuronii
pseudounipolari din ganglionii spinali (40-60), neuronii Purkinje (30-50),
neuronii piramidali (80-120), megacariocitul (50), ovocitul de ordinul II (200).
Cea mai mare celulă din corpul omului este celula musculară striată scheletală (o
celulă anizodiametrică) care are un diametru longitudinal de 10-12 cm (dintr-o
inserţie în alta) şi un diametru transversal de 50-100 .
În mod normal, fiecare tip celular îşi menţine dimensiunile în limitele unor parametri
stabili, menţinuţi ereditar. Cunoaşterea morfologiei normale (formă şi dimensiuni) a tipurilor
celulare este extrem de importantă; numai cunoscând morfologia celulară normală putem
aprecia gradul de alterare al celulelor examinate, ceea ce ne va conduce la un diagnostic.
Dacă simpla examinare în microscopia optică (şi a derivatelor acesteia) permite
identificarea tipului celular şi o oarecare apreciere a vâstei şi activităţii metabolice a celulei,
metodele morfometrice aduc un plus de informaţie în ceea ce priveşte gradul de alterare al
parametrilor morfologici normali şi prin aceasta argumentează diagnosticul; altfel spus,
examinarea în microscopia optică este subiectivă (depinde de experienţa examinatorului), pe
când morfometria aduce în plus date obiective prin dimensionarea celulelor şi componentelor
acestora.

1. MICROMETRIA

Micrometria permite aprecierea dimensiunilor celulei sau a unei structuri celulare în

plan (2D). Metoda necesită utilizarea a două scale gradate numite micrometru obiectiv şi
micrometru ocular.
 Micrometrul obiectiv (fig.1) este alcătuit dintr-o lamă metalică prevăzută cu o scală
gradată. Gradaţia este echidistantă: 1 mm =100 diviziuni, iar o diviziune =10 μ.
 Micrometrul ocular (fig.2) este o rondelă de sticlă pe care este gravată o scală în
dimensiuni egale şi care se introduce în tubul ocularului pe diafragmul de câmp.
Valoarea unei diviziuni nu este prestabilită, ea depinde de fiecare combinaţie

82
 obiectiv-ocular utilizată şi în consecinţă trebuie calculată (de exemplu pentru ob. 10x
şi oc. 10x, ob. 10x şi oc.20x etc.).

Fig.1. Micrometrul obiectiv

Fig. 2. Micrometrul ocular

rondela de sticlă cu scala gradată (stg); tubul ocularului în care se introduce (dr.)

Micrometria se realizează în două etape:

1. Calcularea indicelui micrometric (IM).
Primul pas în efectuarea micrometriei este etalonarea micrometrului ocular, respectiv
determinarea valorii (în ) a unei diviziuni din scala micrometrului ocular pentru combinaţia
obiectiv-ocular pe care dorim să o utilizăm. Valoarea acestei diviziuni poartă numele de
indice micrometric. Pentru a afla IM, avem nevoie de o lupă micrometrică (fig.3).

Fig.3. Lupa micrometrică

83
 Micrometrul obiectiv se plasează pe platina lupei, iar micrometrul ocular se introduce
într-unul din suporturile sistemului ocular. Privind în lupă, se suprapun cele două scale cu
începere de la gradaţia 0 (fig.4). Se observă faptul că gradaţiile diferă ca dimensiune şi nu vin
în corespondenţă pe cele două scale. Cu atenţie, se urmăreşte locul în care gradaţiile celor
două scale coincid. Se noteză numărul diviziunilor citite pe micrometrul ocular şi numărul
diviziunilor citite pe micrometrul obiectiv de la gradaţia 0 până la primele gradaţii care
coincid, după care se utilizează formula:
nD.oc. x P.M.oc.
IM = ———————————————————————
nD.ob. x valoarea unei diviziuni a micrometrului obiectiv

unde, nD oc = nr. diviziunilor citite pe micrometrul ocular

nD oc = nr. diviziunilor citite pe micrometrul obiectiv
PM oc = puterea de mărire a ocularului

Fig.4. Suprapunerea scalelor

celor două micrometre
în vederea stabilirii indicelui
micrometric

2. Micrometria propriu – zisă :

Odată aflată valoarea diviziunii scalei micrometrului ocular, se suprapune scala peste
celulele de cercetat şi se numără subdiviziunile acoperite de celulă.
Diametrul celular se stabileşte efectuând produsul dintre numărul subdiviziunilor acoperite de
celulă şi valoarea indicelui micrometric (fig.5).
Atenţie!!! Prin rotirea fină a ocularului putem măsura diferite diametre în cazul în care
studiem celule anizodiametrice.

Fig.5.Câmp microscopic. Preparat

frotiu de sânge.
Măsurarea diametrului hematiei
adulte circulante.
Între diviziunile 3-4 ale scalei se
observă o hematie care acoperă 8
subdiviziuni.

84
 2. STEREOLOGIA

Metoda stereologică permite aflarea dimensiunilor spaţiale (3D). Prin această metodă
se pot calcula dimensiunile colective ale unor entităţi tisulare: grup de celule, acini, foliculi
sau zone întregi de ţesut (celule cu spaţiile intercelulare), precum şi dimensiunile individuale
ale unei celule sau ale unui organit citoplasmatic. Conform parametrilor stabiliţi de S.I.S.
(Societatea Internaţională de Stereologie) se poate afla: volumul, suprafaţa şi aria pe
transsecţiune a diferitelor tipuri de organite celulare, celule sau grupuri de celule.
Materialul necesar pentru stereologie este reprezentat de:
- microfotografii realizate în ME, la care se cunoaşte puterea de mărire şi grosimea secţiunii;
- grile stereologice (Weibel sau Gunderson).

Determinarea ariei
Se realizează cu ajutorul grilelor. Aria (A) poate fi estimată fără eroare prin
suprapunerea întâmplătoare a unei grile peste fotografia în ME a celulei sau organitului de
cercetat. Spaţiul dintre două puncte de pe grilă în ambele direcţii x şi y este cunoscut ca fiind
aria asociată fiecărui punct de pe grilă (a/p). Numărul punctelor care ating proba este
determinat (P), iar aria se calculează după formula:
A=P x a/p unde a/p=aria asociată fiecărui punct de pe grilă
Fig.6 ilustrează un exemplu simplu. Numărul punctelor care ating proba este 20, deci
A=20 x a/p.

Determinarea fracţiei volumului

Determinarea fracţiei volumului fără a cunoaşte un volum de referinţă poate fi
realizată corect prin suprapunerea întâmplătoare a unei grile peste imaginea secţiunii în
ambele direcţii x şi y. Numărul punctelor care ating spaţiul de referinţă şi numărul punctelor
care ating suprafaţa de interes Y sunt determinate, iar fracţia volumului se calculează după
formula:
Vυ (Y,ref) = PY / Pref unde Pref = numărul punctelor care ating spaţiul de referinţă
PY =numărul punctelor care ating suprafaţa de interes

Fig. 7 ilustrează un exemplu simplu. Numărul punctelor care ating spaţiul de referinţă
este 15, iar cel al punctelor care ating Y este 7, deci fracţia Y din volumul de referinţă este de
7/15 = 0,47

85
 Fig.6. Grilă Gunderson. Determinarea ariei 2D

Fig. 7. Grilă Gunderson. Determinarea fracţiei volumului

Determinarea volumului
Principiul lui Cavalieri reprezintă o alternativă practică a principiului lui Arhimede de
estimare a volumului prin înlocuirea apei. Metoda lui Cavalieri indică faptul că volumul mai
multor obiecte poate fi stabilit cu ajutorul suprafeţelor secţiunilor. Principiul lui Cavalieri
permite determinarea volumului pe baza integrării suprafeţelor unui spaţiu de referinţă.
Numărarea punctelor pentru calcularea ariei în stabilirea volumului prin metoda lui
Cavalieri: volumul total al unui spaţiu arbitrar de referinţă poate fi determinat exact cu
ajutorul suprafeţelor secţiunilor sistematice (fig. 8).

Fig.8. Determinarea volumului

prin metoda lui Cavalieri

86
 Stereologia computerizată
Stereologerul este un sistem de stereologie computerizată de mare acurateţe care
permite o stereologie cu aplicabilitate crescută, dar care este în acelaşi timp realizată simplu
din punct de vedere tehnic datorită unor softwaruri accesibile (Fig.9).

Fig.9. Stereologerul

II. ACTIVITATEA PRACTICĂ

1. Determinaţi indicele micrometric pentru Oc. 10x şi Ob. 10x

Efectuaţi calculul:

87
2. Suprapuneţi micrometrul ocular 10x la M.O. şi dimensionaţi celulele din sângele periferic

Hematii

Polimorfonucleare

Monocite

Limfocite

3. Studiaţi morfologia tipurilor celulare de pe prepatele existente în sala de lucrări practice.

Pentru fiecare tip celular desenat şi analizat notaţi forma, dimensiunile, coloraţia utilizată,
puterea de mărire.
Preparat nr.1. Celule epiteliale (celulă din raclat bucal)
...................................................................................................................................................

Preparat nr.2. Celule conjunctive (fibrocit)

..................................................................................................................................................

88
Preparat nr.3. Celulă musculară striată scheletală
...................................................................................................................................................

Preparat nr.4. Secţiune scoarţă cerebrală. Neuron piramidal

......................................................................................................................................................

Preparat nr.5. Celule epiteliale. Hepatocit.

.....................................................................................................................................................

89
 III. TESTE DE VERIFICARE

1. Celulele tinere:
a. prezintă o formă rotund-ovalară;
b. sunt denumite blaşti;
c. trăiesc în medii puţin dense;
d. au o formă adaptată funcţiei pe care o îndeplinesc;
e. prezintă un nucleu mic;

2. Celulele epiteliale:
a. prezintă forme neregulate cu prelungiri;
b. prezintă forme geometrice;
c. sunt celule de talie mică;
d. sunt celule de talie intermediară;
e. au diametrul cuprins intre 10-30µm.

3. Fibra musculară striată scheletală:

a. are formă de coloană scurtă polinucleată;
b. are formă de coloană lungă polinucleată;
c. prezintă striaţii transversale;
d. este o celulă de talie intermediară;
e. este o celulă de talie mare.

4. Neuronii prezintă următoarele forme:

a. formă rotund-ovalară;
b. formă de pară;
c. formă stelată;
d. formă piramidală;
e. toate răspunsurile sunt corecte;

90
5. Celulele ţesutului conjunctiv:
a. au forme variabile;
b. prezintă prelungiri;
c. au forme geometrice;
d. spaţiul intercelular este mic;
e. prezintă joncţiuni de adezivitate puternice.

6. Celulele de talie mică:

a. au diametrul mai mic de 5µm;
b. au diametrul mai mic de 10µm;
c. eritrocitul aparţine acestei categorii de celule;
d. neuronii piramidali aparţin acestei categorii de celule;
e. reprezintă marea majoritate a celulelor din organism.

7. Celulele de talie mijlocie:

a. au diametrul cuprins între 10-20µm;
b. au diametrul cuprins între 10-30µm;
c. sunt cele mai numeroase din organism;
d. sunt cele mai puţin numeroase din organism;
e. enterocitele, granulocitele, nefrocitele aparţin acestei categorii de celule.

8. Celule de talie mare:

a. au diametrul peste 50µm;
b. au diametrul peste 30µm;
c. sunt reprezentate de ovul, fibra musculară striată scheletală;
d. sunt cele mai numeroase din organism;
e. toate răspunsurile sunt corecte.

9. Metoda morfometrică:
a. permite stabilirea dimeniunilor celulare;
b. utilizează un micrometru obiectiv şi un micrometru ocular;
c. utilizează grile Weibel;
d. implică calcularea indicelui micrometric;
e. permite stabilirea dimensiunilor celulare în spaţiu.

91
10. Micrometrul ocular:
a. este o lamelă metalică gradată;
b. este o rondelă de sticlă gradată;
c. valoarea unei diviziuni nu se cunoaşte;
d. valoarea unei diviziuni se cunoaşte;
e. toate răspunsurile sunt corecte;

11. Stereologia permite:

a. stabilirea volumului celular
b. determinarea suprafeţei nucleare
c. determinarea ariei pe transsecţiune a diferitelor organite citoplasmatice
d. se realizează cu ajutorul grilelor
e. se poate realiza computerizat

Data
.....................................
Calificativ................... Semnătura
cadrului didactic
......................................................

92
 LUCRAREA PRACTICĂ NR. 8
CULTIVAREA CELULELOR IN VITRO

I. NOŢIUNI TEORETICE

Cultivarea celulelor in vitro este metoda de menţinere în viaţă şi multiplicare a unui

anumit tip celular în afara organismului. Aceasta tehnică a pus bazele biologiei celulare.
Metoda a fost pusă la punct în 1912 de Carrel, Harison şi Levaditi, iar la noi în ţară de
Crăciun.
Cu ajutorul acestei metode se poate studia comportamentul celulelor în condiţii strict
definite prin adăugarea sau extragerea de molecule specifice (hormoni, factori de creştere) sau
pentru studiul interacţiunilor între diferite tipuri celulare. Rezultatele obţinute pe această cale
se verifică în comparaţie cu comportamentul celulelor in vivo. În acest fel devine posibil
studiul caracterelor morfologice şi al proprietăţilor biologice ale celulelor din diferite ţesuturi,
separate de organism şi sustrase influenţei sistemului nervos şi curentului sanguin.
Dintre aplicaţiile practice ale cultivării celulelor in vitro amintim:
- prepararea vaccinurilor,
- studierea efectelor medicamentelor asupra comportamentului celulelor normale şi
patologice,
- studiul citotoxicităţii microbiene şi virale,
- studiul specificităţii receptorilor,
- studiul structurii şi al ultrastructurii tipurilor de celule animale, umane, vegetale,
microbiene, studiul celulei canceroase şi a gradului de responsivitate la acţiunea
medicamentelor,
- manipularea materialului genetic (inginerie genică),
- studierea factorilor genetici ai dezvoltării,
- studiul procesului de diferenţiere celulară,
- manipularea celulelor stem,

93
 - transformarea celulelor slab diferenţiate în celule diferenţiate şi utilizarea lor în scop
terapeutic etc.

Materiale necesare
1. Laboratorul necesită mai multe încăperi dotate după necesităţi cu mobilier dedicat,
instalaţii de curent electric trifazic, aer condiţionat, gaz metan, nişe de lucru cu posibilităţi
rapide de sterilizare.
2. Aparatura necesară (planşa1) pentru:
- asigurarea sterilizării etapelor de lucru: hotă cu flux laminar orizontal, etuvă, autoclav,
aparat de distilat şi/sau bidistilat apa, aparat purificare aer ;
- pregătirea materialelor: pompe aspiratoare chirurgicale, balanţă electronică, agitator
magnetic, baie marină reglabilă, centrifugi cu şi fără răcire ;
- menţinerea condiţiilor de cultivare: termostat autoreglabil la 37°C, incubator cu CO2 ;
- păstrarea materialelor: frigidere de la -20ºC→ 4°C;
- păstrarea probelor : aparatură crioprezervare pe bază de azot lichid (congelator la -186°C),
în cazul în care laboratorul este specializat pentru stocarea culturilor celulare (bancă de
celule),
- citire şi interpretare: microscop optic, microscop inversat, microscop electronic, numărător
celule somatice;
- stocarea datelor: computer cu softwar-uri adecvate.
3. Sticlăria trebuie să fie specială, neutră, cu suprafeţe mari de întindere pentru menţinerea
celulelor în monostrat dacă laboratorul este specializat pe culturi celulare în vederea
multiplicării virusurilor şi prepararea vaccinurilor. Pentru culturile celulare obişnuite se
utilizează recipiente de plastic de unică folosinţă cu suprafeţe extinse cum sunt cutiile Petri .
4. Instrumentar. Trusa chirurgicală cu instrumente sterile necesare pentru recoltarea şi
manipularea materialului biologic.
5. Reactivi. Este necesară o mare gamă de reactivi, substanţe din care se prepară mediile
nutritive de recoltare, de creştere şi de menţinere a celulelor in vitro (glucoză, hormoni de
creştere, aminoacizi, antibiotice, antimicotice, factori de creştere şi seruri speciale de la
diferite specii de animale). Ex: mediul Earle, Igle, IC69, TC 199.
6. Sursa de apă pentru clătire va fi pură, pentru acesta fiind necesar un deionizor, un aparat
din sticlă pentru distilat şi un al doilea pentru bidistilarea apei.

94
 Hotă cu flux laminar orizontal Incubator cu CO2

Centrifugă Baie marină reglabilă Agitator magnetic

Balanţă analitică Numărător de celule somatice

Planşa I. Aparatură din dotarea laboratorului de culturi celulare

95
Mediile de cultură celulară
Mediile de cultură celulară trebuie să asigure condiţii optime pentru dezvoltarea
celulelor. Acest lucru este posibil prin menţinerea în limite aproximativ constante a unei serii
de parametri :
 păstrarea constanta a presiunii osmotice prin menţinerea echilibrului ionic obţinut cu
soluţii izotone.
 păstrarea pH-ul optim de 7,2-7,4. Valoarea se menţine între aceste limite cu ajutorul
substanţelor tampon (tampon fosfat, tampon bicarbonat de sodiu etc). Verificarea se
face continuu cu un indicator de pH.
 menţinerea temperaturii optime.
 menţinerea conţinutului favorabil de oxigen şi bioxid de carbon.
 asigurarea elementelor nutritive indispensabile metabolismului celular: hidraţi de
carbon (glucoza), aminoacizi esenţiali din proteine animale (plasmă, ser sanguin,
lichid amniotic), grăsimi (colesterol), vitamine, hormoni, substanţe stimulatoare ale
creşterii (factori de creştere).
 evitarea contaminării cu germeni patogeni. Acest lucru este posibil prin adăugarea de
antibiotice (penicilină, streptomicină, etc.) şi antifungice (stamicin, micostatin etc.).
 stimularea creşterii şi multiplicării celulare. Se realizează prin adăugarea de extracte
embrionare.
Clasificarea mediilor de cultură se face după mai multe criterii:
a) După compoziţie pot fi:
 naturale: ser, plasmă;
 semisintetice: soluţii sintetice cum ar fi soluţii saline vitaminizate la care se
adaugă componenţi naturali – ser, plasmă, extract embrionar,
 sintetice, se achiziţionează sub diferite denumiri de la firmele de profil.
b) După scopul propus:
 medii de creştere; permit o proliferare accelerată a celulelor.
 medii de întreţinere; permit păstrare activităţii celulelor ajunse în faza maximă
de proliferare, fără a le favoriza multiplicarea.
c) După consistenţă sunt:
 lichide,
 semilichide : mediu nutritiv şi agar sau coagulat plasmatic sanguin.

96
Materialul biologic
Materialul biologic care stă la baza realizării unei culturi celulare poate fi:
 linii celulare continue sau stabilizate. Acestea se achiziţionează contra cost de la
laboratoare specializate, de profil. Se pot cultiva:
- celule normale din organismul adult care presupun medii complexe şi sunt
caracterizate printr-o creştere lentă precedată de un timp de latenţă de aproximativ
6-10 zile.
- celule provenite din ţesuturi tumorale.
 celule din fragmente de ţesut recoltate de la animalul de laborator (şoareci, şobolani,
cobai, iepuri, maimuţe). Animalele de laborator de la care se efectuează recoltarea
provin dintr-o aşa numită « biobază » unde sunt crescute şi întreţinute în condiţii
normale de viaţă, cu un regim alimentar raţional întocmit. Recoltarea trebuie să
respectate toate condiţiile: asepsie, temperatură, verificarea pH-ului mediului de
recoltare, asigurarea factorilor nutritivi necesari. Personalul care manipulează
materialul biologic necesită înaltă calificare şi îndemânare.
 embrioni umani obţinuţi în urma avortului (cu acordul pacientei), embrioni de de găină
etc. Ţesuturile embrionare se cultivă uşor şi se caracterizează printr-o creştere rapidă.
 celule tumorale umane provenite din biopsii sau din tumorile extirpate de la bolnavi
(manevra de cultivare se realizează numai cu acordul pacientului).
 celule stem embrionare. Pentru obţinerea unei astfel de culturi se recoltează masa
celulară internă a blastocistului prin diviziunea cărora, în mod normal se formează
embrionul propriu-zis (fig.1). Celulele stem cultivate pot fi tratate sau modificate
genetic şi reintroduse în blastocist. Astfel, celulele transformate experimental vor
deveni parte componentă a embrionului.
 celule stem din organismul adult. De exemplu mioblastele (celule musculare
precursoare) care au fost transformate pentru a fi capabile de multiplicare nedefinită,
pot fuziona în condiţii speciale de cultură şi formează celule musculare mature,
polinucleate. În ultimii ani au fost perfecţionate tehnici de transformare a celulei
musculare striate scheletale în celulă musculară slab diferenţiată şi apoi aceasta a fost
redirecţionată spre a deveni celulă musculară striată cardiacă. Acest lucru a deschis o
nouă eră de posibilităţi terapeutice.

97
 Fig.1. Recoltarea celulelor
stem din masa celulară
internă a blastocistului

Metoda de lucru
Realizarea unei culturi de celule presupune respectarea cu stricteţe a regulilor de asepsie
în toate etapele de lucru.
1. Recoltarea. Se efectuează din ţesuturi de provenienţă foarte diferită. Acestea pot fi: ţesuturi
epiteliale, ţesut limfopoietic sau hematopoietic, fragmente din embrioni umani, ouă
embrionate de 8-9 zile, ţesuturi de provenienţă umană sau animală recoltate în cursul actului
chirurgical. Respectarea regulilor de asepsie este obligatorie. Se adaugă apoi antibiotice şi
antimicotice pentru evitarea contaminării microbiologice.
Condiţii de recoltare:
- asepsia este prima şi una dintre cele mai importante condiţii ce trebuie respectate în cursul
recoltării,
- în timpul recoltării şi în cursul manevrelor ulterioare să se evite traumatizarea celulelor,
- de la recoltare şi până la prepararea culturii, ţesutul se păstrează la rece (la 4˚C), într-o
soluţie salină cu antibiotice, timp de 3-4 ore. Dacă culturile nu se pot face în acest timp,
ţesutul se spală şi se taie la 1-3 mm, se păstrează la 4˚C, în mediu nutritiv, în flacoane
ermetice cu dop de cauciuc.
2. Spălarea se efectuează în recipiente sterile (fig.2) cu soluţie salină PBS, Hanks, Hepes, la
care se adaugă antibiotice. Manevra se repetă de 2-3 ori. Rolul spălării este acela de a înlătura
cheagurile de sânge şi porţiunile de ţesut neutilizabile (cele strivite accidental în cursul
recoltării).

Fig.2. Spălarea ţesutului

98
3. Fragmentarea. După spălare ţesuturile sunt trecute într-o cupă de centrifugă sterilă sau în
alte cutii Petri unde se fragmentează fin cu o foarfecă bine ascuţită, de asemenea sterilă.
4.Disocierea. Fragmentele astfel obţinute se spală în 2-3 băi cu soluţie salină şi antibiotice,
după care se supun operaţiei de disociere. Disocierea presupune separarea celulelor din
ţesuturi. Aceasta se realizează prin mai multe metode:
- fizice - agitare,
- forfecare,
- cu ajutorul micromanipulatorului.
- chimice - prin digestie enzimatică cu: tripsină, colagenaze sau papaină.
Tripsinizarea - tehnica de lucru pentru obţinerea culturii de fibroblaşti din embrioni de găină
 Se folosesc ouă embrionate de 8-9 zile din care se extrage embrionul;
 Se spală în soluţie tampon, PBS şi se îndepărteză membrele;
 Se fragmentează cu foarfecele şi se spală de câteva ori în soluţie tampon pentru
înlăturarea sângelui;
 Fragmentele se cântăresc şi se trec în balonul de tripsinizare cu PBS unde pot fi lăsate
24 de ore;
 După 24 de ore se face o pretripsinizare la 37˚C timp de 30-40 de minute prin agitare
lentă;
 Se lasă un minut pentru sedimentare, după care supernatantul se decantează într-ul
balon steril;
 Peste sediment se adaugă din nou tripsină 0,25% şi se agită mai repede timp de 15
minute după care se colectează din nou supernatantul;
 Se adaugă din nou tripsină şi se agită 7-8 minute ;
 Colectarea supernatantului se repetă până când fragmentele de ţesut sunt disociate. Se
pot face aproximativ 12-15 şarje, numărul şarjelor depinde de cantitatea de ţesut pusă
la tripsinizare;
 Emulsia de celule se decantează în cupe de centrifugă şi se centrifughează 10 minute
la 1000 turaţii pe minut, după care supernatantul (tripsina) se indepărtează;
 Sedimentul ce conţine celulele se omogenizează prin agitare uşoară şi se face
numărarea pe lama Bürker (fig.3).
5. Controlul culturii şi determinarea indicelui de viabilitate
Controlul culturii este obligatoriu înaintea începerii oricărui experiment. Controlul cuprinde
două aspecte :

99
 a) controlul mediilor de cultură şi
b) controlul celulelor cultivate.

Fig.3. Camera de numărare Bürker Detaliu microscopic al camerei Bürker

a) Controlul mediilor cuprinde:

 controlul posibililor contaminanţi (bacterii, virusuri, fungi),
 controlul constantelor fizico-chimice (pH, temperatură, presiune osmotică, etc),
 controlul de eficienţă (aprecierea densităţii celulare pe suprafaţa suportului, evaluarea
eficienţei de formare a coloniilor celulare).
b) Controlul celulelor se referă la controlul aspectului morfologic şi se face prin:
 tehnici de microscopie fotonică care includ:
- examinarea celulelor în stare vie la microscopul cu contrast de fază. În acest fel
se apreciază forma celulelor, aspectul citoplasmei, conturul nucleului.
- examinarea aspectului celulelor pe preparate fixate şi colorate.
 tehnici de histoautoradiografie,
 tehnici de microscopie electronică.
Determinarea indicelui de viabilitate
Indicele de viabilitate se determină în urma tratării culturilor celulare cu diferiţi agenţi,
în anumite concentraţii, pentru stabilirea concentraţiei cu efect letal.
Metoda presupune următoarele operaţii:
 desprinderea celulelor tratate de pe substrat cu tripsină,
 adăugarea unei cantităţi mici de mediu de cultură pentru obţinerea unei suspensii
celulare dense,
 se coloreaza suspensia celulară cu albastru de tripan în concentraţie de 0,5%,

100
  se pun picături pe lame microscopice, se aplică o lamelă şi se examinează rapid, în
aproximativ 2 minute. Celulele colorate în albastru sunt cele moarte, iar cele colorate
în gălbui sunt vii. Indicele de viabilitate (I.V.) se poate determina cu ajutorul formulei:

I.V. = (n/N) x 100

unde, n = numărul de celule vii,

N = numărul total de celule numărate.
!!! Dacă mai mult de 10% sunt moarte, emulsia nu se foloseşte.
Numărarea celulelor. O picătură din suspensia celulară se amestecă cu o picătură de albastru
de tripan şi o picătură de ser fiziologic apoi se omogenizează uşor. Am obţinut o diluţie a
celulelor de 1/3. Se monteaza lama Bürker pentru citire şi se numără la microscop, valorile
fiind raportate la 1ml. Se numără celulele pe o suprafaţă de 1mm2. Inălţimea camerei de
numărare este de 0,1mm.
Exemplu: Dacă pe 1mm2 găsim 200 de celule vii, atunci, numărul de celule/ml este:
10x200x1000x3 = 6.000.000/ml,
Unde, 10 = aducerea la volumul de 1mm3 (datorată înălţimii camerei de 0,1mm),
200 celule …………..0,1mm
n celule ……...……….1 mm n = 200/0,1=200x10
1000 = transformarea a 1mm3 în 1cm3 (ml) şi
3 = factorul de diluţie.
S-a constatat că densitatea celulară optimă este de 300.000-400.000 de celule /ml. Pentru a
ajunge la aceasta valoare calculăm volumul de mediu de cultură (V) care trebuie adăugat
peste suspensia de celule.
V=Nv/n
unde,
N = numărul de celule vii numărate pe 1ml,
v = volumul de mediu în care sunt suspendate celulele (10 ml),
n = numărul de celule la care dorim să ajungem (densitatea celulara optima),
V=Nv/n= 6.000.000x10ml/300.000 = 200ml,
200ml = volumul final al mediului de cultură care urmează să fie adăugat peste
suspensie pentru obţinerea densităţii celulare optime.

6. Însămânţarea presupune de asemenea condiţii sterile precum şi medii de iniţiere (ex. IC65,
IC69, TC199, mediul Earle) unde celulele cresc şi se înmulţesc; se efectuează în recipiente de

101
plastic cu suprafaţă mare de extindere pentru ca celulele să se poată etala în monostrat.
Recipientele au forme diferite: rotundă (cutii Petri) sau paralelipipedică (Flask-uri) şi diferite
capacităţi (fig.4 şi 5). Mediile de creştere şi de întreţinere favorizează păstrarea caracterelor
structurale, ultrastructurale şi funcţionale ale celulelor.
7. Creşterea se face în termostat la o temperatură constantă de 37˚C.
8. Examinarea culturilor se realizează la microscopul inversat după 12-24 de ore de la
iniţiere determinându-se gradul de ataşare al celulelor pe substrat şi pH-ul mediului.
!!! Vasele de cultură în care celulele nu sunt ataşate, mediul are aspect tulbure şi
pH acid, se înlătură din termostat menţinându-se culturile cu celule ataşate de
substrat.

Fig.4. Cutii Petri Fig.5. Flask

Fig. 5. Etapele de iniţiere a culturii celulare „in vitro”

Fig.6. Etapele de iniţiere a unei culturi celulare in vitro

102
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

!!! Iniţiaţi o cultură de celule: efectuaţi recoltarea, spălarea, fragmentarea, disocierea prin
tripsinizare şi determinarea indicelui de viabilitate celulară.

Efectuaţi calculele

103
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1. Cultivarea celulelor in vitro presupune:

a. studiul la microscopul optic după colorarea preparatelor proaspete cu diferiţi
coloranţi,
b. evaluarea eficienţei de formare a coloniilor,
c. examinarea aspectului celulelor pe preparate fixate şi colorate,
d. menţinerea în viaţă a celulelor
e. multiplicarea celulelor în afara organismului,

2. Cultivarea celulelor permite:

a. studiul interacţiunii între diferite tipuri celulare,
b. studiul proprietăţilor biologice ale celulelor din diferite ţesuturi separate de
organism,
c. studiul comportamentului celulelor în condiţii strict definite prin adăugarea sau
extragerea de molecule specifice,
d. studiul caracterelor morfologice ale diferitelor celule separate de organism,
e. studiul capacităţii de diferenţiere celulară

3. Elementele nutritive indispensabile metabolismului celular în cultură sunt:

a. hidraţi de carbon (glucoză),
b. proteine animale (plasmă, ser sanguin, lichid amniotic),
c. vitamine,
d. tripsina,
e. indicator de pH.

4. Mediile de cultură trebuie să asigure anumite condiţii pentru dezvoltarea celulelor:

a. pH acid cu valoare de 4,2-4,4
b. presiune osmotică variabilă,
c. temperatură optimă,

104
 d. conţinut favorabil de oxigen şi bioxid de carbon
e. asigurarea sterilităţii.

5. Stimularea creşterii şi multiplicării celulare se face prin:

a. adăugarea de extracte embrionare,
b. digestie enzimatica cu colagenaze,
c. adaugarea de soluţie Hanks,
d. agitare mecanică,
e. adăugarea de aminoacizi.

6. Evitarea contaminării culturii celulare cu germeni patogeni se face prin:

a. adăugarea de antibiotice şi antifungice,
b. adăugarea de vitamine şi soluţii saline,
c. adăugarea de aminoacizi esenţiali,
d. tripsinizare,
e. expunere la radiaţia UV.

7. Recoltarea trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

a. să se respecte condiţiile de asepsie,
b. să se evite traumatizarea celulelor în timpul recoltării şi disocierii,
c. să se agite timp de 20 de minute,
d. fragmentul recoltat se păstrează în apă distilată,
e. fragmentele se păstrează la temperatura camerei.

8. Controlul mediilor de cultură presupune:

a. controlul posibililor contaminanţi (bacterii, virusuri, fungi),
b. controlul constantelor fizico-chimice (pH, temperatură, presiune osmotică),
c. aprecierea densităţii celulare pe suprafaţa suportului,
d. evaluarea eficienţei de formare a coloniilor,
e. numărarea celulelor.

9. Controlul celulelor din mediul de cultură se referă la aspectul morfologic şi se face prin:
a. examinarea celulelor la microscopul cu contrast de fază,
b. examinarea aspectului celulelor pe preparate fixate şi colorate,

105
 c. tehnici de microscopie electronică,
d. tehnici de histoautoradiografie
e. examinarea celulelor la microscopul inversat.

10. Metoda de determinare a indicelui de viabilitate presupune următoarele operaţii:

a. desprinderea celulelor de pe substrat cu tripsină,
b. adăugarea unei cantităţi mici de mediu de cultură pentru obţinerea unei suspensii
celulare dense,
c. colorarea suspensiei celulare cu albastru de tripan în concentraţie de 0,5%,
d. examinarea rapida, in aproximativ 2 minute, la microscop
e. celulele necolorate sunt moarte.

Data
……………………………..
Calificativ…………………. Semnătura cadrului didactic,
………………………………

106
 LUCRARE PRACTICĂ Nr. 9

FRACŢIONARE CELULARĂ
METODE DE STUDIU ALE NUCLEULUI IN INTERFAZA

I. NOŢIUNI TEORETICE

Majoritatea cunoştinţelor privind structura, compoziţia chimică şi funcţiile organitelor

celulare au fost obţinute după izolarea lor prin procedee de fracţionare celulară.
În prima etapă, ţesuturile sunt disociate pentru a se elibera componentele celulare apoi, în
a doua etapă, se face sortarea componentelor în fracţiuni. Fracţionarea celulară este tehnica
care implică în ordine :
 distrugerea legăturilor intercelulare,
 fragmentarea membranelor plasmatice,
 separarea fracţiunilor subcelulare în funcţie de densitate şi volum. Când sunt plasate în
câmp centrifugal la diferite viteze de rotaţie, organitele de diferite mărimi şi densităţi se
vor deplasa în sediment, în diferite zone ale tubului de centrifugă ; metoda poartă
numele de fracţionare celulară prin centrifugare diferenţială.
Distrugerea legăturilor intercelulare şi a membranelor plasmatice se poate realiza:
- mecanic prin folosirea unor cuţite antrenante într-o mişcare rapidă de rotaţie ;
- prin omogenizare : presarea ţesutului între pistil şi pereţii unui tub de sticlă, în
aparate numite omogenizatoare (fig.1). Fragmentele de ţesut sunt iniţial introduse
într-o soluţie izotonă, tamponată, răcită la gheaţă, apoi se acţionează
omogenizatorul. După omogenizare se practică centrifugarea ; în final sedimentul
va conţine fragmente de ţesut şi celule întregi, iar în supernatant se vor găsi
organite celulare în suspensie. Se obţine astfel un omogenat ( fig.2).
- prin ultrasonare : ruperea membranelor are loc prin expunerea celulelor într-un
câmp sonic de înaltă frecvenţă (fig.3);
- prin utilizarea detergenţilor (fig.4) care destabilizează bistratul molecular lipidic;

107
 - prin utilizarea enzimelor de digestie a proteinelor şi enzimelor membranare;
- prin şoc osmotic: plasarea celulelor într-o soluţie hipotonă.

Fig.1. Omogenizator Fig.2. Omogenat celular

Fig.3. Ruperea membranelor celulare Fig.4. Distrugerea membranei

prin ultrasonare plasmatice cu detergenţi

Separarea materialelor biologice prin centrifugarea diferenţială

Dacă o eprubetă conţine în suspensie materiale biologice ale căror particule se disting prin
masa lor (m), atunci ele vor sedimenta în timp sub acţiunea forţei de atracţie gravitaţională.
Fracţiunea cu particulele cele mai grele va sedimenta pe fundul eprubetei, iar în funcţie de
relaţia dintre masele particulelor m1  m2  m3  m4 ele se vor distribui pe verticală (fig.5).
Dacă forţa de atracţie gravitaţională nu este suficientă pentru a separa fracţiunile din amestec
în funcţie de masa particulelor, pentru a grăbi separarea, se recurge la centrifugare. Ca şi
omogenizarea, centrifugarea se face la temperaturi de 2 – 4ºC, pentru a preveni alterarea
organitelor. Forţa centrifugă pe care o realizează centrifuga prin mişcarea circulară a rotorului
se exprimă în număr de g, adică de câte ori forţa centrifugă (Fc) este mai mare decât forţa de
atracţie gravitaţională.

108
 Fig. 5. Separarea materialelor biologice prin centrifugare diferenţială
Fg – Forţa de atracţie gravitaţională, m – masa particulei,
g – acceleraţia gravitaţională

Viteza de sedimentare a unei particule este proporţională cu acceleraţia centrifugală, iar

constanta de proporţionalitate se numeşte coeficient de sedimentare(s). Unitatea coeficientului
de sedimentare este numită Svedberg (S) după numele savantului suedez, laureat al premiului
Nobel pentru realizarea primelor ultracentrifugi analitice (S = 10-13 secunde). Coeficientul de
sedimentare al unei particule este viteza de sedimentare a particulei la o acceleraţie
centrifugală egală cu unitatea. Coeficientul de sedimentare este proporţional cu densitatea
particulei şi depinde şi de dimensiunile şi forma ei. Cu cât o particulă este mai apropiată de
forma sferică şi are raza mai mare va sedimenta mai rapid.
Există două variante de ultracentrifugare:
 analitică, în care se urmăreşte caracterizarea coeficientului de sedimentare a unei
particule din care se pot calcula alţi parametri;
 preparativă, în care se separă diferite componente dintr-un amestec, în cazul de
faţă diferitele organite subcelulare dintr-un omogenat.
Centrifugarea preparativă este de două tipuri:
a. centrifugare în gradient de densitate: în tubul de centrifugă se crează un gradient de
densitate prin introducerea de soluţii cu densităţi diferite care se dispun în straturi. În
urma centrifugării, particulele cu densităţi diferite migrează în stratul cu densitate
identică cu a lor.
b. centrifugarea diferenţială: se efectuează într-un mediu cu o densitate uniformă. În
urma centrifugării, particulele se depun la baza tubului formând un sediment.
Fracţiunea care sedimentează poate fi separată de restul particulelor care rămân în
supernatant. Dacă supernatantul se centrifughează apoi la o turaţie mai mare, va
sedimenta o altă fracţiune. Procedeul se repetă până când sedimentează toate
organitele celulare, iar în supernatant rămâne faza solubilă a citoplasmei (citosolul).

109
 Etapele fracţionării diferenţiale
Separarea diferitelor fracţiuni subcelulare (nuclei, mitocondrii, microzomi, citosol) se
poate face prin centrifugări la turaţii din ce în ce mai mari ale omogenatului celular (fig.6).

Omogenat 10%
(centrifugare 10 min la 600 g)

Sediment: fracţiune nucleară

Supernatant I
(centrifugare 10 min. la 10.000 g)

Sediment : mitocondrii Supernatant II

lizozomi (centrifugare 60 min. la 10.000g
peroxizomi sau 10 min. la 10.000 g după tratare cu CaCl2)

Sediment: microzomi Supernatant III: Citosol

Fig. 6. Schema etapelor de fracţionare celulară

STUDIUL NUCLEULUI IN INTERFAZA

Apariţia nucleului este considerată a fi cel mai important pas evolutiv pe scara
filogenetică. El este caracteristic celulei eucariote (să ne amintim că celula procariotă nu
prezintă nucleu, ci nucleoid, reprezentat strict de materialul genetic, fără membrană, nucleol
sau matrice nucleară). În funcţie de etapa ciclului celular, nucleul prezintă structură şi funcţie
diferită, el este cosiderat ca fiind:

1. nucleu metabolic în interfază deoarece în această perioadă el coordonează procesele de

sinteză a factorilor vitali celulari (enzime care guvernează transcripţia, factori care intervin în

110
biosinteza proteinelor), dar şi a factorilor care pregătesc mitoza (enzimele care intervin în
autoreplicarea ADN, proteine structurale şi enzime necesare formării aparatului mitotic,
factori de spiralizare a cromozomilor, CDK cu rol în derularea ciclului celular etc.).

2. nucleu genetic în diviziune . În această etapă nucleul are rolul de a transmite informaţia
genetică la generaţiile celulare următoare.

Morfologia nucleului interfazic

Studiul microscopic al nucleului pe perioada interfazei urmăreşte stabilirea unor caractere

morfologice de normalitate sau patogenitate. Pentru a stabili starea de sănătate a unei celule
este necesară studierea următorilor parametri morfologici:
 forma nucleului urmează de regulă formei celulare:
- rotund sau ovalar în celulele izodiametrice
- alungit (bastonaş, fusiform) în celulele anizodiametrice
- lobat (bilobat, polilobat) în celulele cu formă variabilă (ex. PMN)
- neregulat în unele tipuri de celule canceroase.
 poziţia intracelulară a nucleului variază cu tipul celular:
- aşezare centrală la celulele izodiametrice
- medio-bazal la celulele absorbante care sunt polarizate funcţional (polul bazal, de
exocitoză, prezintă o activitate metabolică mai intensă)
- excentric la celulele cu rol de acumulare a substanţelor cu rol energetic (ex.
adipocitele).
 numărul nucleilor variază cu tipul celular. Funcţie de acest parametru morfologic,
celulele pot fi:
- anucleate – celulele înalt specializate care şi-au pierdut funcţia de reproducere
celulară – ex. hematia adultă circulantă
- mononucleate – majoritatea tipurilor celulare
- binucleate – 7% dintre hepatocite
- polinucleate (multinucleate) de tip plasmodiu – ex. celula musculară striată
scheletală, osteoclastul, sau de tip sinciţiu – sinciţiul trofoblastic de la suprafaţa
vilozităţilor placentare.
 dimensiunile nucleului variază cu tipul celular, vârsta celulei, gradul de ploidie,
gradul de diferenţiere celulară, activitatea metabolică şi în cazuri patologice. De
regulă, diametrele nucleului se situează între 4 la spermatozoid şi 20 la ovocitul II.

111
 raportul nucleo-citoplasmatic. În mod fiziologic, raportul nucleo-citoplasmatic este
un parametru constant pentru un anumit tip celular. Cu alte cuvinte, el trebuie să se
menţină în toate etapele de viaţă a celulei (stadiul de celulă tânără, adultă,
îmbătrânită); odată cu înaintarea în vârstă, celula îşi reduce dimensiunile datorită
reducerii progresive a activităţii metabolice, însoţită de pierderea corespunzătoare a
cantităţii de apă conţinută (să ne reamintim că apa este mediul în care se organizează
structurile celulare şi se desfăşoară toate reacţiile metabolice).
În mod normal, raportul nucleo-citoplasmatic este în favoarea nucleului la limfocite şi
monocite. La majoritatea tipurilor celulare, raportul nucleo-citoplasmatic este în
favoarea citoplasmei şi în general, se încadrează între valorile 13 - 120, cu atât mai
mare cu cât celula este mai tânără. Se calculează după formula:

unde, Vc – volumul citoplasmei

Vn – volumul nucleului

Studiul structurii nucleului interfazic ( MO). În practica de laborator se realizează pe:

1. Preparate proaspete necolorate, studiul se poate efectua în:
- MO – structură rotund-ovalară, vag delimitată de membrană, cu aspect heterogen
- MCF – structură net delimitată de restul citoplasmei, componente structurale mai
bine vizualizate, refringente
- MFI - structură translucidă, galben intens pe fondul întunecat al celulei
2. Preparate proaspete colorate. Coloranţii bazici vitali (albastru de metylen) oferă
informaţii suplimentare în ceea ce priveşte structura nucleului. Studiul permite
vizualizarea netă a membranei nucleare datorită ribozomilor ataşaţi, apreciarea
cantitativă şi localizarea eucromatinei şi heterocromatinei, numărul şi dispoziţia
intranucleară a nucleolilor, prezenţa incluziunilor nucleare.
3. Preparate fixate. Fiind o structură predominant acidă (datorită conţinutului în acizi
nucleici), nucleul se colorează cu coloranţi bazici:
- triada de albastru: albastru de toluidină, albastru de trypan, albastru de metzlen
- hematoxilină (coloraţie de elecţie în practica medicală, în scop diagnostic).
4. Metode citochimice:
- coloraţia Feulgen specifică acizilor nucleici. Evidenţiază elementele structurale ale
nucleului în nuanţe de violet.

112
 - coloraţia Brachet utilizează doi coloranţi: verde de metil cu afinitate pentru ADN
(colorează nucleul în verde-gri) şi pironina cu afinitate pentru ARN (colorează
nucleolii în roşu strălucitor)
5. Citospectrofotemetria permite evidenţierea cantitativă a acizilor nucleici şi prin
aceasta, permite aprecierea gradului de agresivitate al tumorilor (cancerului).

Ultrastructura nucleului interfazic (ME)

Microscopia electronică permite studiul detaliat al componentelor nucleului interfazic:

1. Membrana nucleară formată din două foiţe (internă şi externă) care descriu între ele
spaţiul perinuclear (fig.7). Membrana este prevăzută cu pori care permit comunicarea
între matricea nucleară şi citoplasmă. Fiind o formă particulară de RE, membrana
nucleară prezintă ribozomi ataşaţi pe faţa citoplasmatică.
2. Laminele nucleare formează o reţea proteică, situată imediat sub membrană, au rolul
de a susţine membrana nucleară şi de a menţine forma nucleului.
3. Matricea nucleară este mediul intern al nucleului în care înoată cromatina şi
nucleolii
4. Cromatina prezintă grade diferite de spiralizare, motiv pentru care în ME se prezintă
de manieră diferită:
- eucromatina (activă, transcriptibilă) are un grad scăzut de spiralizare ceea ce
permite transcripţia mesajului genetic pe ARNm. În ME se prezintă de aspect fin
granular şi ocupă partea centrală a matricei nucleare. Cu cât celula este mai tânără
şi mai activă metabolic, cu atât cantitatea de eucromatină va fi mai mare. În acest
caz, nucleul este eucromatic.
- heterocromatina (inactivă, nontranscriptibilă) prezintă un grad crescut de
spiralizare, ceea ce nu permite transcrierea mesajului genetic. În ME se prezintă
sub forma unor grunji neregulaţi, electronodenşi, cu dispoziţie periferică (ataşaţi
pe laminele nucleare) sau ataşaţi nucleolului. Cantitatea de heterocromatină este
mai mare în celulele îmbătrânite, cu activitate metabolică redusă.
5. Nucleolii sunt formaţiuni electronodense, lipsite de membrană, în număr de 1-2,
localizaţi central sau cu dispoziţie periferică. ME a permis stabilirea ultrastructurii
nucleolului (fig.8) care este format din 4 componente:
- partea cromozomială dispusă la periferie, formată din heterocromatină
- partea granulară cu dispoziţie centrală, formată din precursori ribozomali
- partea fibrilară, cu dispoziţie centrală, formată din ADN extracromozomial

113
 - partea amorfă sau mediul intern al nucleolului.

Fig.7. Imagine de microscopie electronică (TEM). Componentele ultrastructurale ale

nucleului în interfază (după Alberts, 2004)

Fig.8. Schema componentelor ultrastructurale ale nucleolului

EVIDENŢIEREA CROMATINEI SEXUALE BARR

În 1949, Barr şi Berthram au evidenţiat în nucleii neuronilor proveniţi de la femelele de

pisică un corpuscul cromatinian intens colorat. Acesta a fost denumit cromatină sexuală sau
corpuscul Barr, prezenţa lui a fost corelată cu sexul feminin, iar evidenţierea sa a reprezentat
mult timp unica metodă de diagnostic a sexului la om.
Cromatina Barr este o condensare (heterocromatinizare) interfazică a unuia dintre
cromozomii X, condensare care are loc în ziua 14-15 a vieţii intrauterine. La o persoană de

114
sex feminin se observă în majoritatea ţesuturilor. În practica medicală, observarea sa se
realizează pe frotiuri de mucoasă bucală sau sânge periferic deoarece sunt uşor realizabile în
orice condiţii de laborator.
În celulele epiteliului bucal, cromatina Barr se prezintă sub forma unui corpuscul cu
următoarele caracteristici:
- formă ovalară sau plan-convexă, uneori triunghiular, sferic sau disc turtit
- mărime medie 1
- situat la periferia nucleului,ataşat pe faţa internă a membranei nucleare; rar, se
găseşte liber în nucleoplasmă sau ataşat nucleolului
- se colorează intens bazofil
- corpusculul Barr se va regăsi în 40-50% din celulele epiteliale provenite de la
sexul feminin.
În PMN neutrofile, cromatina Barr se prezintă sub forma particulară de apendici nucleari
cu următoarele caracteristici:
- apendice în „băţ de tobă” (drum stick) format dintr-un cap oval sau rotund de
aproximativ 1,5, mai intens colorat ca restul nucleului şi ataşat de unul dintre
lobii nucleului printr-un filament subţire
- cromatina Barr se va regăsi în 20-30% din PMN neutrofile provenite de la sexul
feminin.
Numărul cromatinei Barr se calculează după formula nX-1, ceeace înseamnă că la sexul
feminin vom găsi un singur corpuscul, iar la sexul masculin în mod normal este absent.
Evidenţierea cromatinei Barr este utilizată pentru orientarea diagnosticului de sex. Astfel:
- absenţa corpusculului la o persoană cu fenotip feminin, orientează spre un cariotip
de tip 45,X0 (sindrom Turner)
- prezenţa a doi corpusculi la o persoană cu fenotip feminin orientează spre un
cariotip de tip 47,XXX (triplo X)
- prezenţa corpusculului la o persoană cu fenotip masculin orientează spre un
cariotip de tip 47,XXY (sindrom Kleinfelter)
La persoanele care prezintă anomalii numerice ale cromatinei Barr se realizează ulterior
cariotiparea pentru a da un diagnostic de certitudine de anomalie cromozomială numerică
gonozomală.

115
 II. ACTIVITATE PRACTICĂ

1. Realizaţi etapa de izolare a nucleilor prin centrifugare diferenţială.

Preluaţi sedimentul nuclear, etalaţi-l pe lamă şi coloraţi albastru de toluidină. Desenaţi
câmpul microscopic şi indicaţi elementele structurale ale nucleului interfazic.
Urmaţi protocolul de lucru:
 Se anesteziază şobolanul cu eter, se deschide abdomenul şi se prelevează rapid
ficatul,
 Se introduce ficatul într-o soluţie de zaharoză 0,25 M, tamponată cu Tris-HC1
10mM (pH 7,4), EDTA 2mM (ZTE), aflată într-o placă Petri pe gheaţă.
 Se mărunţeşte ţesutul cu foarfeca şi se spală de 2-3 ori cu aceeaşi soluţie pentru
îndepărtarea sângelui.
 La fragmentele de ţesut se adaugă 10 volume ZTE şi se introduc într-un
omogenizator. Se omogenizează pentru ruperea membranelor celulare şi trecerea
organitelor celulare în suspensie. Se obţine un omogenat 10%.
 Se introduce omogenatul înt-un tub de centrifugă şi se centrifughează 10 minute la
600 g. Sedimentul trebuie să conţină nuclei în proporţie de 80% (restul de 20% poate
fi reprezentat de celule întregi, resturi de ţesut conjunctiv, resturi de sânge).

Fractiune nucleara obtinuta prin centrifugare diferentiala.

Coloratia…………………
PM……………..

116
2. Examinaţi în imersie un frotiu de sânge periferic realizat de la o colegă de grupă.
Vizualizaţi PMN neutrofile şi desenaţi drum stick-ul.

Vizualizarea cromatinei Barr in PMN neutrofile.

Coloraţia………………………………, PM…………………….

3. Observaţi în MO şi reproduceţi în casete preparatele microscopice colorate specific

pentru acizii nucleici (Feulgen şi Brachet)

Preparatul
.............................................PM........
Coloraţia
....................................................

Preparatul
.............................................PM........
Coloraţia
....................................................

117
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1. Ruperea ţesuturilor şi a celulelor se poate realiza prin:

a. folosirea ultrasunetelor;
b. utilizarea enzimelor;
c. utilizarea detergenţilor;
d. supunerea ţesutului la o presiune mare;
e. folosirea de cuţite într-o mişcare de rotaţie.

2. Coeficientul de sedimentare al particulei este proporţional cu:

a. densitatea;
b. forma;
c. dimensiunile;
d. volumul,
e. toate răspunsurile sunt corecte.

3. Centrifugarea preparativă poate fi:

a. centrifugare în gradient de densitate;
b. centrifugare analatică;
c. centrifugare diferenţială;
d. centrifugare separativă
e. centrifugare fracţionată.

4. Microzomii reprezintă:
a. fracţiuni nucleare;
b. fragmente de mitocondrii;
c. ribozomi izolaţi;
d. fragmente de endomembrane ale RER, REN şi aparat Golgi;
e. membrane lizozomale.

5. Prin centrifugare în gradient de densitate se separă:

a. nucleii de mitocondrii;

118
b. lizozomii de peroxizomi;
c. mitocondriile de lizozomi şi peroxizomi;
d. nucleii de lizozomi;
e. nici un răspuns nu este corect.

6. Coeficientul de sedimentare:
a. este viteza de sedimentare a particulei;
b. este egal cu unitatea;
c. se măsoară în Svedberg;
d. reprezintă viteza de sedimentare a particulei la o acceleraţie centrifugală
egală cu unitatea;
e. nici un răspuns nu este corect.

7. Pe parcursul interfazei, nucleul :

a. este format din: membrană, matrice, cromatină, nucleoli
b. dimensiunile lui scad cu vârsta celulară
c. este component major al tuturor tipurilor celulare
d. coordonează toate reacţiile metabolice
e. poartă denumirea de nucleu genetic.

8. Raportul nucleo/citoplasmatic:
a. este în favoarea nucleului la majoritatea celulelor
b. este în favoarea nucleului la limfocite
c. este cu atât mai mare cu cât celula este mai tânără
d. scade odată cu înaintarea în vârstă a celulelor
e. la normal, se încadrează între 13 - 120

9. Morfologia nucleului interfazic se poate realiza:

a. în MCF pe preparate neculorate
b. pe preparate fixate colorate cu coloranţi acizi
c. pe preparate fixate colorate cu coloranţi bazici
d. prin tehnici citochimice
e. indirect, prin evidenţierea acizilor nucleici şi a nucleoproteinelor.

119
10. Nucleolul:
a. este localizat central intranuclear
b. toate celulele prezintă un singur nucleol
c. este o formaţiune delimitată de membrană
d. componenta granulară este formată din ADN
e. componenta granulară este formată din ARN.

11. Eucromatina :
a. este transcriptibilă
b. în MO se colorează intens bazofil
c. ocupă partea periferică a nucleului
d. predomină în celulele tinere
e. în ME este fin granulară

12. Heterocromatina:
a. este transcriptibilă
b. în MO se colorează intens bazofil
c. în ME apare sub formă de grunji electronodenşi
d. se localizează, de regulă, la periferia nucleului
e. prezintă un grad scăzut de spiralizare.

13. Cromatina Barr

a. este indicator de sex feminin
b. evidenţierea ei este utilă atunci când se suspectează o anomalie
cromozomială numerică
c. face parte din eucromatină
d. este prezentă numai pe durata interfazei
e. reprezintă o condensare interfazică a unuia dintre cromozomii X.

Data……………………………….
Semnătura
Calificativ………………………… cadrului didactic
………………………..

120
 LUCRARE PRACTICA Nr. 10

METODE DE STUDIU

A ORGANITELOR INTRACITOPLASMATICE

I. NOTIUNI TEORETICE

MITOCONDRIA
Mitocondriile sunt organite intracitoplasmatice delimitate de membrane, prezente în toate
celulele eucariote cu excepţia hematiilor adulte. Totalitatea mitocondriilor din celulă poartă
numele de condriom. Sunt organite cu rol în respiraţia celulară şi energogeneză.

1. Metode morfologice de studiu

1. Preparate proaspete necolorate. Mitocondriile pot fi studiate în microscopia cu contrast

de fază (MCF); apar sub formă de granule sau alungite cu structură densă, omogenă, de
culoare închisă. In celulele vii există mişcări de rotaţie, translaţie, cădere şi se lasă
antrenate de curenţii citoplasmatici ; se pot urmări modificări de formă, dimensiuni şi
dispoziţie intracelulară.

2. Preparate proaspete colorate. Mitocondriile pot fi observate în M.O. după colorarea

specifică cu coloranţi vitali: verde Yanus (condriomul se colorează în verde).

3. Preparate fixate colorate. Mitocondriile pot fi studiate prin:

a) Metode speciale

 metoda Altmann cu fuxină acidă: colorează condriomul în roşu sau roşu-violet

121
  metoda Heidenhein cu hematoxilină ferică după fixare cu fixator Regaud: condriomul
se colorează în albastru închis până la negru

b) Metode citochimice - permit evidenţierea lipoproteinelor din membrana externă

c)Metode citoenzimatice evidenţiază enzimele marker mitocondriale: citocromoxidaza

(CitO), succindehidrogenaza (SDH)

Studiul morfologic (MO) urmăreşte:

Forma. Studiul efectuat pe celule fixate a demonstrat că mitocondriile au formă granulară

sau alungită. După formă şi aşezarea intracitoplasmatică există trei forme „statice”, care
poartă denumiri diferite: forma granulară cu răspândire în întreaga citoplasmă poartă numele
de mitocondrii, granule dispuse în şiraguri – condriomite, iar forma alungită de bastonaş
poartă numele de condrioconte (fig.7). Studiul efectuat pe celule vii a demonstrat însă că
aparatul energogen al celulei suferă permanente modificări de formă, dimensiuni şi dispoziţie
intracelulară prin fuziune şi fisiune.

Fig.7. Formele „statice” ale mitocondriilor

Dimensiunile mitocondriilor sunt variabile; în medie, au un diametru longitudinal de 2-5µ

şi transversal de 0,1-0,5µ. Există însă şi mitocondrii care ating o lungime de 10-15.

Numărul mitocondriilor diferă cu vârsta celulei şi activitatea metabolică a acesteia. O

celulă tânără, cu activitate metabolică intensă are nevoie de o cantitate crescută de energie,
deci va avea un număr mai mare de mtocondrii. Numărul lor diferă şi cu tipul celular; de
exemplu: hepatocitul conţine în medie 1000 mitocondrii, nefrocitul – 300, iar spermatozoidul
are un condriom format din 24 de mitocondrii dispuse la nivelul piesei intermediare.

Dispoziţia intracelulară. Mitocondriile sunt răspândite uniform intracitoplasmatic sau

aglomerate acolo unde necesarul de energie al celulei este crescut. Astfel, ele sunt aşezate la
polul apical al celulelor ciliate unde produc ATP necesar pentru bătăile cililor. În celulele
secretorii sunt dispuse la polul de exocitoză. In ţesutul muscular striat, mitocondriile sunt

122
aşezate printre miofibrile şi asigură ATP necesar contracţiei musculare. Dispoziţia
intracelulară nu este însă fixă, ea se poate schimba funcţie de activitatea metabolică. Astfel, în
cursul biosintezei proteice mitocondriile se aglomerează în jurul reticulului endoplasmic, iar
în timpul autoreplicării semiconservative a ADN se dispun în jurul nucleului.

2. Ultracentrifugare fracţionată la 10.000g, 10 minute realizează izolarea mitocondriilor şi a

lizozomilor. Ulterior, prin utilizarea soluţiilor cu gradient de densitate (zaharoză, clorură de
cesiu), mitocondriile se separă de lizozomi.

3. Studiul ultrastructural (ME) evidenţiază componentele mitocondriale:

 membrană externă trilaminată, de natură lipoproteică;

 membrană internă prevăzută cu invaginări numite criste mitocondriale cu rol în creşterea

suprafeţei de reacţie. Numărul cristelor depinde de vârsta celulei şi angajarea metabolică.
Cristele au formă tubulară, lamelară, veziculoasă şi pot fi dispuse perpendicular pe axul
lung al mitocondriilor, radiar sau spiralat.

 spaţiul perimitocondrial cu rol activ in transportul substanţelor din citosol în matrice şi

invers. În ME apare de regulă electronoclar.

 matricea mitocondrială conţine ADN mitocondrial bicatenar, helicoidal, circular

asemănător cu cel de la procariote, ribozomi mitocondriali (mitoribozomi), ARN
mitocondrial (fig.8).

Fig.8. Elementele ultrastructurale ale mitocondriilor

123
 Fig.9. Mitocondria în M.E. (imagine TEM)

RETICULUL ENDOPLASMIC

Reticulul endoplasmic este un organit endocitoplasmatic prezent în toate celulele cu

excepţia hematiei adulte. Este un sistem complex de membrane organizat in canalicule şi
cisterne al căror lumen comunică cu spaţiul perinuclear. Membranele sunt de natură
lipoproteică. Suprafeţele membranare care conţin proteine translocator pot ataşa ribozomi şi
formează astfel zone de reticul endoplasmic rugos, restul suprafeţelor nu ataşează ribozomi şi
din acest motiv au fost denumite reticul endoplasmic neted.
Reticulul endoplasmic face parte din categoria organitelor implicate în sinteza şi secreţia
celulară. Zonele de RER sunt specializate în sinteza proteinelor de export, iar zonele de REN
în metabolismul lipidic şi detoxifierea medicamentelor. Se pare că inclavarea proteinei
translocator în planul membranelor (şi deci capacitatea de ataşare a ribozomilor) depinde de
nevoile metabolice celulare; s-a observat că RER poate fi convertit in REN prin injectarea de
fenobarbital.
Prezenţa ribozomilor ataşaţi pe suprafaţa externă a membranelor determină în M.O.
bazofilia citoplasmei ceea ce permite studierea morfologică a RER. REN nu se observă în
microscopia optică.
RER a fost studiat în MO în diferite tipuri celulare şi cu diferite metode de coloraţie.
Astfel:
 în neuroni, prin utilizarea coloraţiei albastru de toluidină, se prezintă se prezintă sub forma
unor mase neregulate, localizate în toată soma neuronală; au fost denumiţi corpi Nissl (după
numele cercetătorului care i-a descris).

124
  în hepatocite colorate cu albastru de toluidină poartă numele de corpi Berg.
 în celulele pancreatice a fost descris sub numele de ergastoplasmă
 în neuroni coloraţi prin impregnare argentică se numesc corpi tigroizi (fig.10).
.

Fig.10. Schema localizării RE în

soma neuronală.
Neuron (1), nucleu (2), corpi Nissl
sau tigroizi (3), dendrite (4), axon (5).

1. Metode morfologice de studiu (MO)

1. Preparate proaspete necolorate:
- studiul se efectuează în MCF. RE se prezintă de formă granulară cu structură densă, omogenă, de
culoare închisă.
2. Preparate proaspete colorate:
- studiul se efectuează în M.O. pe preparate colorate cu coloranţi vitali ca de exemplu
albastru de metilen
3. Preparate fixate
- studiul se realizează pe preparate colorate cu coloranţi bazici din gama de albastru: albastru
de trypan, albastru de toluidină, albastru de tionină care colorează în albastru zonele de RER.
4. Metode citochimice
 metoda Brachet utilizează pironina şi verdele de metil. Pironina are afinitate spre
structurile intens acide, mai exact structurile cu încărcătură de ARN. În consecinţă, zonele
citoplasmatice unde se găseşte RER şi nucleolul se vor colora în roşu strălucitor. Verdele de
metil colorează restul nucleului în gri-verde.
 metoda cu galocianină evidenţiază RER în gri-albăstrui.
2. citospectrofotometria. ARN-ul absoarbe radiaţia U.V. cu lungime de undă λ=280nm.
Tratarea preparatului cu un fluorocrom, acridin orange, determină colorarea în portocaliu a
zonelor de RER.
3. Ultracentrifugarea diferenţială la 100.000 g/min. permite separarea şi izolarea
microzomilor care sunt fragmente de endomembrane ale RER, REN şi ribozomi.

125
4. Studiul ultrastructural (M.E.) permite vizualizarea tuturor membranelor RE, deci inclusiv
a zonelor de REN (fig.11).

Fig.11. Imagini de microscopie electronică TEM,

RER(stg) şi REN (dr)

APARATUL RETICULAR GOLGI

Este un organit intracitoplasmatic nespecific delimitat de endomembrane prezent în toate
celulele eucariote cu excepţia hematiei. Reprezintă staţia finală a sintezei şi secreţiei celulare
prin procesele de condensare, maturare (sulfatare, glicozilare, deshidratare), ambalare şi
exocitare a produşilor de secreţie. Aparatul Golgi nu trebuie văzut ca un organit aparte, el
provine din RE şi reprezintă ultimele stadii de evoluţie a produsului de secreţie împreună cu
membranele care îl acoperă.

1. Studiul morfologic (MO)

În M.O. aparatul Golgi are aspect de reţea perinucleară, localizarea sa depinde de tipul
celular şi de momentul funcţional, de exemplu în neuroni este localizat perinuclear, în
celulele secretorii exocrine- supranuclear, în tireocite-juxtanuclear. Reţeaua perinucleară
apare ca un ansamblu de elemente alungite, filamentoase sau veziculare numite dictiozomi.
1. Preparate proaspete necolorate
- în MCF se prezintă de aspect granular, cu sructură densă, de culoare închisă.
2. Preparate proaspete colorate
- studiul se realizează în M.O. pe preparate colorate cu coloranţi vitali. Pentru aparatul
Golgi colorantul de elecţie este roşu neutru.
3. Preparate fixate colorate

126
 - metoda impregnării argentice Golgi sau Da-Fano face parte din metodele de
impregnare argentică. Complexul Golgi apare colorat în maro-negru sub forma unei
reţele de filamente neregulate situate în imediata vecinătate a nucleului.
- metoda PAS este o metodă citochimică care evidenţiază glicoproteinele din
membranele golgiene. Acestea se colorează în roşu.
- metoda Gőmőry este o metodă citoenzimatică prin care se evidenţiază localizarea
fosfatazei acide (FAC). Fosfataza acidă este una dintre enzimele marker golgiene.
2. Studiul ultrastructural (M.E.)
În ME, aparatul Golgi apare alcătuit din 3 zone: vezicule de tranziţie (microvezicule), saci
golgieni şi vacuole de secreţie (macrovezicule) (fig.12).

Fig.12. Imagine de microscopie electronică de transmisie (TEM)

Ultrastructura aparatului Golgi

II. ACTIVITATE PRACTICA

1. Observaţi în MO şi desenaţi preparatele microscopice colorate specific pentru studiul

condriomului, RE şi Aparatului Golgi.
La fiecare preparat notaţi tipul celular, coloraţia, puterea de mărire utilizată. Indicaţi pe desen
elementele morfologice ale organitului studiat.

2. Observaţi cu atenţie imaginile de ME din sala de lucrari practice. Schematizaţi

elementele ultrastructurale ale mitocondriei, RE şi aparatului Golgi.

127
Preparat nr.1.
................................................................................................................................................

Preparat nr.2
................................................................................................................................................

Preparat nr.3
................................................................................................................................................

128
Componentele ultrastructurale ale mitocondriei

Componentele ultrastructurale ale reticulului endoplasmic

Componentele ultrastructurale ale aparatului Golgi

129
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1. Studiul morfologic al condriomului urmăreşte :

a. forma mitocondriilor
b. elementele ultrastructurale
c. dispoziţia intracelulară
d. numărul mitocondriilor / celulă
e. studierea dictiozomilor

2. Coloraţiile specifice pentru studiul organitelor intracitoplasmatice sunt:

a. verde Yanus pentru mitocondrii
b. metoda Gömöri pentru Aparatul Golgi
c. impregnarea argentică pentru RE
d. albastru de toluidină pentru RE
e. roşu neutru pentru Aparatul Golgi

3. Morfologia mitocondriilor poate fi studiată prin următoarele metode :

a. coloraţia Altmann
b. coloraţia Gömöri
c. coloraţia Heidenhein
d. coloraţia verde Yanus
e. centrifugare diferenţială.

4.Care din următoarele tipuri celulare prezintă mai multe mitocondrii la polul apical al
celulei:
a. celula musculară netedă;
b.celula ciliată;
c.celula secretoare de hormoni steroizi;
d.hepatocite;
e.celule musculare striate.

130
5.În matricea mitocondrială se găsesc:
a. RER;
b.REN;
c.peroxizomi;
d.ribozomi;
e.lizozomi.

6.Mitocondriile se evidenţiază prin:

a. metoda Altman în negru;
b.metoda Altman în roşu strălucitor;
c.metoda Heidenhein cu hematoxilină-eozină;
d.metoda Heidenhein cu hematoxilină ferică;
e.nici un răspuns nu este corect.

7.Izolarea mitocondriilor se realizează prin ultracentrifugare:

a. la 5000t/min;
b.la 1000t/min;
c.la 10000t/min;
d.la 100000t/min;
e.la 15000t/min.

8.Numărul mitocondriilor din celulă este direct proporţional cu:

a. tipul celular;
b.vârsta celulei;
c.activitatea metabolică;
d.gradul de diferenţiere celulară;
e.funcţia celulară.

9. RER se evidenţiază:
a. cu coloranţi de tipul albastru de metilen, albastru de toluidină în albastru;
b. cu coloranţi de tipul albastru de metilen, albastru de toluidină în portocaliu;
c. cu acridin orange în portocaliu;
d. cu acridin orange în albastru;
e. cu galocianină.

131
10. RER prezintă continuitate cu:
a. spaţiul perinuclear;
b.reticulul endoplasmic neted;
c.spaţiul perimitocondrial;
d.plasmalema;
e.ribozomii.

11. RER mai este denumit:

a. ergastoplasmă;
b.corpusculii Nissl;
c.corpii Berg;
d.corpii tigroizi;
e.toate răspunsurile sunt corecte;

12. Aparatul Golgi se evidenţiază:

a. cu roşu neutru în verde;
b.cu roşu neutru în roşu;
c.prin impregnare argentică Golgi;
d.prin impregnare argentică Da- Fano;
e.prin impregnare argentică în negru.

13.Aparatul Golgi se prezintă în ME:

a. ca o reţea perinucleară ;
b. ca un sistem de canalicule, tubi şi vezicule;
c. ca un sistem de macrovezicule, microvezicule şi saci;
d. sub formă de granule uniform răspândite în citoplasmă;
e. sub formă de bastonaşe.

Data………………………………. Semnătura
Calificativ………………………… cadrului didactic

………………………………

132
 LUCRARE PRACTICĂ Nr.11

METODE CANTITATIVE DE STUDIU ALE

INCLUZIUNILOR INTRACITOPLASMATICE
INTRODUCERE ÎN TEHNICILE DE IMUNOHISTOCHIMIE

I. NOŢIUNI TEORETICE

METODE CITOCHIMICE
Citochimia cuprinde o serie de tehnici de laborator care urmăresc punerea în evidenţă
a prezenţei incluziunilor intracitoplasmatice. Aprecierea cantitativă, ochiometrică, a acestora
este un factor adjuvant de emitere a unui diagnostic de precizie.
Etapele realizării unui preparat de citochimie şi citoenzimologie sunt aproximativ
aceleaşi cu cele studiate la preparatul fixat, cu unele diferenţe:
1. Recoltarea se realizează similar recoltării descrise la preparatul fixat.
2. Fixarea se realizează cu ajutorul fixatorilor fizici şi chimici.
 Fixatorii fizici: criofixare, crioprecipitare. În fixarea cu fixatori fizici factorul esenţial
îl reprezintă congelarea rapidă a pieselor la o temperatură cât mai scăzută.
Avantajele acestei fixări sunt următoarele:
- stopează orice activitate enzimatică împiedicând astfel autoliza celulară post-
mortem;
- conservă structurile celulare;
- deplasarea substanţelor solubile sau difuzibile este mai redusă decât în orice alt
procedeu de fixare.
 Fixatorii chimici trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
- să nu modifice structura substanţelor de cercetat;
- să nu le deplaseze dintr-o zonă citoplasmatică în alta;
- să nu le dizolve;
- să permită desfăşurarea normală a reacţiilor chimice care vor fi aplicate.

133
 Nu există un fixator chimic universal pentru toate substanţele evidenţiabile prin reacţii
citochimice.
Cei mai utilizaţi fixatori sunt:
 Carnoy pentru glicogen, mucopolizaharide, proteine, acizi nucleici.
 Formol 10% tamponat pentru proteine, lipide.
 Sublimat dicromat de K pentru fosfolipide.
Durata fixării este mult mai strictă în citochimie şi citoenzimologie pentru a nu
permite fixatorului să acţioneze extractiv asupra unor componenţi chimici.
Volumul fixatorului va fi suficient de mare pentru a împiedica diluarea lui cu apa
conţinută în piesa citologică; în timpul fixării va fi schimbat de 1-2 ori.
Temperatura fixatorului influenţează atât procesele de autoliză cât şi viteza de
pătrundere în piesă. Se preferă fixarea la rece la 4 ◦C care previne autoliza, dar măreşte durata
fixării.
3. Includerea se face în marea majoritate a cazurilor la gheaţă, iar în cazul folosirii fixatorilor
chimici se face la parafină.
4. Secţionarea se realizează la criotom în cazul includerii la gheaţă şi mai rar la microtom
(pentru piesele incluzionate la parafină).

Metode de evidenţiere a glucidelor

Glicogenul se evidenţiază prin reacţia PAS (Periodic Acid Schiff): acidul periodic transformă
grupările alcoolice ale hexozelor în grupări aldehidice, care împreună cu reactivul Schiff
determină apariţia unui precipitat roşu. Incluziunile de glicogen pot fi evidenţiate cu
precădere în celulele musculare şi în hepatocite, celule cu necesităţi energetice crescute. În
mod normal, incluziunile de glicogen au un turnover scurt (ore) fiind primele utilizate în
energogeneză. Patologic, evidenţierea lor se impune atunci când se suspectează o deficienţă
enzimatică a enzimelor glicogenolitice, de exemplu în glicogenoze (tezaurismoze lizozomale).
Glicozaminoglicanii se evidenţiază cu albastru alcian sau albastru toluidină la un pH= 1
pentru GAG sulfatate şi pH=2,5 pentru GAG sulfatate şi nesulfatate.
Glicoproteinele membranare se evidenţiază prin metoda PAS după o prealabilă digestie
enzimatică cu neuraminidază.

Metode de evidenţiere a lipidelor

După cum s-a studiat anterior, lipidele se evidenţiază cu coloranţi liposolubili (indiferenţi),
după cum urmează:

134
Lipidele simple (trigliceridele cu rol energetic) se colorează cu Sudan III şi IV.
Intracitoplasmatic apar picături de culoare galbenă până la roşu – portocaliu. Evidenţierea şi
aprecierea lor cantitativă se impune atunci când se suspectează o maladie genetică manifestată
prin deficienţa de sinteză a enzimelor de degradare (lipaze) cum este cazul lipidozelor
(tezaurismoze lizozomale).
Lipidele complexe (lipide membranare cu rol structural) se evidenţiază cu :
- Sudan negru B în albastru – negru
- Albastru de Nil: lipidele acide se colorează în albastru, iar lipidele neutre în roz
- Acid osmic în negru.

TEHNICI DE CITOENZIMOLOGIE
Pentru evidenţierea enzimelor trebuiesc respectate următoarele condiţii:
 prepararea ţesuturilor şi a secţiunilor nu trebuie să influenţeze distribuţia şi
activitatea enzimelor;
 reactivii folosiţi trebuie să pătrundă cu viteză egală în toate celulele şi în
componentele subcelulare;
 substratul trbuie să fie scindat, dacă este posibil, numai de o singură enzimă
(reacţia substrat-enzimă să aibe un grad înalt de specificitate);
 produsul reacţiei enzimatice trebuie să fie imobilizat foarte repede de reactivii
utilizaţi;
 produsul final trebuie să precipite imediat, să fie practic insolubil în soluţii
apoase, să fie amorf şi stabil;
În cazul în care produsul final de reacţie este solubil, el va fi transformat într-un
produs insolubil printr-o reacţie de captare, după cum urmează:
 pentru hidrolaze există două tipuri de reacţii de captare: cu ioni metalici (de
exemplu se utilizează Ca2+ pentru fosfataza alcalină sau Pb2+ pentru fosfataza
acidă) şi cu săruri de diazoniu cu care, în urma reacţiei se formează o substanţă
cromoforă care permite vizualizarea enzimei;
 pentru dehidrogenaze, produsul final insolubil şi colorat se obţine folosind
sărurile de tetrazoliu. Sărurile se adaugă la mediul de incubare şi, pentru că
sunt incolore şi solubile, după reducere se transformă în formazan, produs
colorat şi insolubil.

135
 Dinamica unei reacţii enzimatice este influenţată de concentraţia substratului,
concentraţia enzimei, pH-ul optim de acţiune al enzimei, temperatură. Creşterea temperaturii
la peste 37◦C modifică ireversibil activitatea enzimatică.
Principalele etape pentru obţinerea unui preparat citoenzimologic sunt: recoltarea,
fixarea, secţionarea, incubarea şi montarea.
Recoltarea se poate face la om prin puncţie-biopsie sau intervenţie chirurgicală. Piesele
prelevate nu vor depăşi 1 cm3. La animalele de experienţă, recoltarea se poate face imediat
după sacrificarea lor.
Fixarea are ca scop conservarea activităţii enzimatice şi imobilizarea enzimei intracelular. Se
pot folosi fixatori chimici ca formolul, acetona, glutaraldehida (pentru M.E.) şi fixatori fizici
ca de exemplu congelarea rapidă în azot lichid la -190◦C (cea mai frevent utilizată în practică).
Secţionarea se face cu microtomul obişnuit sau criotomul în funcţie de metoda de fixare.
Grosimea optimă a secţiunilor este de 2-5µm.
Incubarea este o etapă specifică tehnicii citoenzimatice, în care mediul de incubare utilizat nu
degradează enzima şi oferă condiţii optime pentru reacţia specifică a acesteia cu substratul.
Mediul are o compoziţie diferită, în funcţie de enzima cercetată. El permite formarea
complexului enzimă-substrat şi face insolubil produsul de reacţie. Mediul de incubare conţine
în principal substratul cu care enzima reacţionează în mod specific. În final, reacţiile
citoenzimatice dau un precipitat colorat obţinut din reacţia enzimă-substrat; deci ceeace se
interpretează în microscopie nu este enzima în sine, ci precipitatul format în urma reacţiei
enzimă-substrat (produsul de reacţie enzimă-substrat). În plus, mediul de incubare va conţine
soluţii tampon care conferă un anumit pH, deoarece activitatea fiecărei enzime are loc la un
pH optim de acţiune. O importanţă crescută o are timpul de incubare, saturarea enzimei cu
substratul se face, de regulă, în aproximativ 20 de minute; totuşi, se recomandă tatonarea
timpului optim de incubare.
Montarea secţiunilor se face în medii hidrosolubile, de obicei glicerina sau lichidul Apathy.

Evidenţierea enzimelor marker (enzime cu concentraţie mare într-un anumit tip de

membrană sau într-un compartiment celular) se impune în aproape întreaga patologie.
Anomaliile enzimatice cantitative determină hipo- sau hiper-activitate enzimatică a unui
component celular, ceeace va conduce la o dereglare a funcţiei celulare şi, în final, la o
patologie de organ. În subsidiar, aprecierea activităţii enzimatice permite aprecierea
morfologică a compartimentului (organitului) pentru care enzima respectivă este marker.

136
Pentru o mai bună înţelegere enumerăm câteva exemple de enzime marker, substraturile cu
care se incubează pentru a fi puse în evidenţă şi coloraţia produsului de reacţie:
Peroxidaza este enzimă marker peroxizomală. Se evidenţiază cu benzidină, în mediu
oxigenat. Produsul de reacţie este un precipitat de culoare albastră.
O2
Benzidină + peroxidază → granule de albastru de benzidină

Citocromoxidaza (CitO) este enzima marker a membranei interne mitocondrială. Se

evidenţiază cu α naftol şi parafenilendiamină. Produsul de reacţie este un precipitat granular
de culoare albastră.

Citocromoxidaza + α naftol + parafenilendiamină → granule de albastru de indofenol

Succindehidrogenaza (SDH) este enzimă marker mitocondrială. Se evidenţiază cu săruri de

tetrazoliu şi determină formarea unui precipitat de culoare verde-gri.

săruri de tetrazoliu + SDH → granule de formazan

Fosfataza acidă (FAC) este enzimă marker lizozomală. Se evidenţiază prin metoda Gömöri cu β
glicerofosfat de potasiu, în prezenţa ionilor de Pb şi în mediu acid. Produsul de reacţie este un
precipitat granular de culoare brună. În practica de laborator se utilizează cu precădere în
aprecierea funcţiei hepatice şi a prostatei.
Pb2+
β glicerofosfat K + FAC ————> precipitat brun
pH 4 –5

Fosfataza alcalină (FAL) este enzimă marker a aparatului Golgi. Se evidenţiază prin reacţia
Dorfmann Epstein cu β glicerofosfat de sodiu, în prezenţa ionilor de calciu şi în mediu alcalin.
Produsul de reacţie este un precipitat de culoare albastră. În practica de laborator se utilizează cu
precădere în aprecierea funcţiei renale, hepatice şi intestinale.

Ca2+
β glicerofosfat Na —————> precipitat albastru
pH 8-9

137
INTRODUCERE ÎN TEHNICILE DE IMUNOHISTOCHIMIE

Imunohistochimia (IHC) este o tehnică de laborator utilizată pentru determinarea

tipurilor celulare, identificarea constituenţilor celulari sau tisulari (antigeni) şi evidenţierea
modificărilor patologice tisulare. În ultimii 20 de ani, IHC a devenit cea mai valoroasă metodă
calitativă de diagnostic completând diagnosticul anatomo-patologic convenţional. Tehnica se
bazează pe interacţiunile specifice dintre anticorp şi antigen, fiind cuplată cu metode de
vizualizare a acestei interacţiuni. În scopul recunoaşterii antigenelor, tehnica utilizează
anticorpi de înaltă specificitate.

Principiul metodei
Reacţiile IHC se bazează pe legătura antigen tisular-anticorp, acesta din urmă putând
fi evidenţiat prin conjugare cu molecule trasoare. Răspunsul imun este un fenomen complex
de interacţiune între diferite tipuri celulare (pe de o parte) şi limfocitele T, limfocitele B,
macrofage, plasmocite (de cealaltă parte).
1. Antigenele
Pentru a funcţiona ca antigen, molecula trebuie să aibă o mărime adecvată, rigiditate
structurală şi o conformaţie spaţială (3D) specifică, care să-i permită recunoaşterea şi legarea
de anticorp. Majoritatea proteinelor, polipeptidelor, lipoproteinelor şi carbohidraţilor prezintă
aceste caracteristici. În configuraţia lor spaţială există unul sau mai multe situsuri care se pot
lega de anticorpi specifici. Acestea sunt regiuni cu înaltă specificitate, compuse dintr-un
număr mic de aminoacizi sau unităţi monozaharidice, care poartă denumirea de determinanţi
antigenici sau epitopi. Prezenţa unui anumit epitop induce o cascadă de reacţii:

activarea limfocitelor T

activarea şi proliferarea limfocitelor B

multiplicarea plasmocitelor

secreţia de anticorp

În acest fel au fost obţinute în laborator, seruri de anticorpi monoclonali (cu pornire de la o
singură clonă de limfocite B) şi anticorpi policlonali (cu pornire de la mai multe clone de
limfocite B). Animalul cel mai frecvent folosit pentru prepararea serurilor policlonale este
iepurele. Cu ajutorul anticorpilor mono- şi policlonali au fost identificate diverse antigene:

138
 - antigene de diferenţiere prezente în celulele embrio-fetale, în celulele adulte normale,
dar şi în celulele tumorale. Acestea sunt proteine constitutive ale filamentelor
intermediare din alcătuirea citoscheletului celular sau molecule proteice de adezivitate
intercelulară.
- antigene de citotip (antigene specifice tipului celular). Aici se încadrează molecule de
tip secretor (-lactalbumină, caseină), molecule de tip neuroendocrin (cromogranine,
enolaza neurospecifică), molecule de tip apocrin (Gross Cystic Disease Fluid Protein),
hormoni.
- receptori hormonali steroidieni
- oncogene de tip p53, catepsina D, c-erb2
- factori de proliferare tumorală
- antigene virale şi microbiene - pentru virusul imunodeficienţei umane (HIV),
papilloma virus uman (HPV), citomegalvirus uman (CMV), bacteria pneumocystis
carrini (asociată infecţiei cu HIV).
2. Anticorpii
Anticorpii sunt imunoglobuline sintetizate de plasmocite. Dintre cele 5 clase de
imunoglobuline, IgG sunt cel mai frecvent utilizate în imunohistochimie. Molecula de IgG
are forma literei Y, fiind formată din două perechi de lanţuri grele şi uşoare legate prin punţi
disulfidice. Regiunile terminale ale fiecărui braţ se numesc „regiuni variabile” deoarece
secvenţa aminoacizilor care le compun este variată (Fig.1). Această variabilitate asigură
specificitatea pentru fiecare epitop şi permite anticorpului să se lege specific cu antigenul
contra căruia a fost creat. Reacţia dintre un antigen (sau epitop al său) şi anticorp este nu
numai foarte specifică ci şi foarte stabilă; formarea complexelor imune stă la baza identificării
componentelor antigenice celulare. În acest fel, alegerea anticorpului monoclonal utilizat
reprezintă un factor determinant pentru o reacţie histochimică corectă şi sigură.
Anticorpii au capacitatea de conjugare cu enzime, ceeace a permis dezvoltarea metodelor
imunoenzimatice. Punând în contact aceste enzime cu un cromogen adecvat se asigură
imunocolorarea preparatelor. În practica de laborator cei mai frecvent utilizaţi marcatori
enzimatici sunt:
- peroxidaza din hrean; în combinaţie cu cromogenul 3, 3 - diaminobenzidin
tetrahidroclorid (DAB) realizează un produs de colorare brun închis, stabil şi insolubil.
- fosfataza alcalină din intestinul de viţel cu cromogenul naftol-AS-MX fosfat de sodiu
dă un produs de culoare roşie
- glucozoxidaza dă o reacţie albastră

139
 - -galactozidaza.
O altă categorie de marcatori o constituie marcatorii metalici cum sunt aurul coloidal şi
argintul.

Fig.1. Reprezentarea
schematică a structurii
moleculare a anticorpului

Sunt utilizate două tipuri de metode imunohistochimice:

 Metoda directă care pune în contact antigenul cu anticorpul primar marcat cu o
enzimă sau cu aur coloidal. Metoda este simplă dar prezintă sensibilitate redusă.
 Metoda indirectă utilizează un anticorp primar nemarcat, a cărui porţiune antigenică
este legată de un anticorp secundar marcat cu peroxidază combinată cu un cromogen
(Fig.2). Metoda prezintă un grad crescut de sensibilitate.

Fig.2. Schema generală

a tehnicii IHC

Etapele generale ale tehnicii IHC

Fragmentul de ţesut este fixat, de regulă, în formol 10% în soluţie salină, inclus la parafină şi
secţionat; deoarece această procesare maschează şi/sau distruge epitopii antigenici, aceştia pot
fi conservaţi (revelaţi) care presupune una dintre metodele de pretratament:
- digestie cu enzime proteolitice (tripsină, pepsină, proteinază K, colagenază, DNA-ză)
- tratament termic prin recuperare în cuptorul cu microunde.

140
De rutină se utilizează metoda avidină-biotină peroxidată (ABC), schematizată după cum
urmează:
 Deparafinare în xilol şi rehidratarea secţiunilor
 Inhibarea peroxidazei endogene cu apă oxigenată
 Clătire în tampon fosfat salin (PBS), pH 7,4
 Pretratament prin digestie enzimatică sau cuptor cu microunde
 Incubare în ser neimun pentru legarea situsurilor antigenice nespecifice (Fc)
 Incubare cu anticorp primar, specific pentru antigenul în cauză. Este necesară
realizarea unei concentraţii optime de anticorp pentru a obţine o specificitate înaltă şi
a evita o colorare nonspecifică.
 Incubare cu ser secundar biotinilat specific pentru tipul de anticorp primar. Secţiunile
sunt incubate cu anticorpii secundari care reacţionează cu anticorpii primari şi care
sunt legaţi fie de un marker direct sau de o enzimă care poate fi utilizată în reacţia
chimică. Markerii direcţi sunt reprezentaţi de fluorocromi care emit fluorescenţă în
urma expunerii la lumină cu o anumită lungime de undă. În practică se utilizează
frecvent trei fluorocromi: fluoresceină, rodamină şi aminometilcumarină, care emit
lumină verde, roşie şi respectiv albastră. În consecinţă, prin marcarea cu mai mulţi
fluorocromi pot fi identificate mai multe antigene pe aceeaşi secţiune. Enzima care se
leagă de anticorpul secundar va cataliza o reacţie care transformă un substrat
necolarat într-un precipitat colorat la nivelul locului unde sunt fixaţi anticorpii,
indicând astfel situsul de legare al anticorpului.
 Incubare cu complexul ABC (avidină-biotină-peroxidază)
 Developare în 3-3’ diaminobenzidină (DAB). În acest fel se formează un precipat fin,
de culoare negru-brun, localizat în citoplasmă sau nucleu, care reprezintă localizarea
antigenului
 Contrastare cu hematoxilină Mayer
 Deshidratare, clarificare şi montaj.

Utilizarea clinică a metodei

Metoda este astăzi utilizată cu bune rezultate în diagnosticul diferenţial al tumorilor slab
diferenţiate sau nediferenţiate (ex. limfomul malign, carcinomul nediferenţiat, melanoamele
acrome şi tumorile cu diferenţiere neuro-endocrină), în cercetare şi în domeniul medico-legal.

141
 În morfopatologie, metoda poate diferenţia tumorile benigne de cele maligne. Mai
mult, pentru stabilirea originii unor tumori, metoda permite identificarea unor tipuri
celulare specifice. Exemple de markeri utilizaţi în acest scop sunt:
- anticorpii anti-keratină. Citokeratinele sunt filamente intermediare de natură proteică,
componente ale citoscheletului celular din epiteliile simple şi pluristratificate
keratinizate sau nekeratinizate. Anticorpii monoclonali pancitokeratină sunt utilizaţi în
depistarea tumorilor epiteliale.
- anticorpii anti-vimentină. Vimentina se sintetizează în cea mai mare parte a celulelor
mezenchimale, dar şi în unele celule epiteliale (fibroblaste, celule endoteliale, celule
musculare netede şi striate, condroblaste, osteoblaste, unele celule ale sistemului
hematopoetic).
- anticorpi anti-desmină. Desmina se exprimă (sintetizează) de regulă în celulele
musculare, în tumorile cu diferenţiere musculară, dar şi în celulele nemusculare
(miofibroblaste, celule din ganglionii limfatici, celule stromale ale endometrului,
celule din vilozităţile choriale). Evidenţierea desminei este utilă în diagnosticul
tumorilor cu punct de plecare muscular (rabdomiosarcoame).
- anticorpi monoclonali anti-actină. Sunt markeri ai diferenţierii musculare.
- anticorpi anti-leucocitari . Anticorpii care recunosc acelaşi tip de antigen sunt reuniţi
în clase sau clustere de diferenţiere, motiv pentru care sunt denumiţi CD. Anticorpii
dintr-o grupă CD pot recunoaşte diferiţi epitopi şi în acest fel pot avea un
comportament imunohistochimic diferit. Exemple de anticorpi mai frecvent utilizaţi în
reacţiile IHC:
- CD45 pentru antigenul leucocitar comun (LCA). LCA este o
glicoproteină de membrană care se exprimă în celulele
hematopoetice;
- CD20 pentru antigenul L26 specific membranei limfocitelor B
- CD3 specific pentru antigenul omonim din citoplasma limfocitelor T
- CD4 specific pentru un antigen membranar al limfocitelor T.
Evidenţierea lui este utilizată în diagnosticul infecţiei HIV.
- anticorpi ai markerilor de diferenţiere neuronală sau neuroendocrină: enolaza neuron
specifică (NSE), anticorpi anti-cromogranine, anticorpi anti-sinaptofizină, anticorpi
anti-neurofilamente; sunt utilizaţi ca markeri tumorali pentru tumorile nervoase sau
neuroendocrine.

142
  Identificarea unor depozite anormale de natură proteică cu localizare intracelulară.
Agregatele proteice se întâlnesc în numeroase boli neurodegenerative. Anticorpii
îndreptaţi împotriva proteinelor specifice pot recunoaşte incluziunile patologice pe
secţiunile din creier.
 Evidenţierea unor modificări proteice posttranslaţionale. Modificările posttranslaţionale
ale proteinelor celulare normale sunt frecvente în multe boli neurologice. De exemplu,
neurofilamentele citoscheletului axonului sunt în mod normal fosforilate. În situaţii
patologice neurofilamentele pot fi hipofosforilate, respectiv hiperfosforilate. Există
anticorpi care recunosc aceste neurofilamente anormale şi în consecinţă stările patologice.

II. ACTIVITATE PRACTICĂ

Observaţi în microscopie optică preparatele de citochimie şi citoenzimologie care vă sunt

puse la dispoziţie în laborator: incluziuni de glicogen, incluziuni lipidice, FAC, FAL.
Desenaţi câmpurile microscopice observate şi notaţi tipul celular, coloraţia utilizată, PM şi
observaţiile dumneavoastră din punct de vedere cantitativ.

Preparat microscopic nr.1

................................................................................................................................................

143
Preparat microscopic nr.2
................................................................................................................................................

Preparat microscopic nr.3

................................................................................................................................................

Preparat microscopic nr.4

................................................................................................................................................

144
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR

1.Lipidele simple:
a) se evidenţiază prin metoda Sudan III, Sudan IV sub forma unor picături de culoare
roşie-portocalie;
b) se evidenţiază cu Sudan negru B în albastru intens-negru;
c) au rol energetic;
d) se evidenţiază prin metoda Sudan III, Sudan IV sub forma unor picături de culoare
neagră;
e) au rol structural.

2. Glicogenul:
a) reprezintă forma de depozit a glucozei;
b) se evidenţiază prin reacţia PAS sub forma unor granule de culoare roşie-purpurie;
c) se evidenţiază prin reacţia PAS sub forma unor granule de culoare portocalie;
d) se depozitează în ficat şi celulele musculare;
e) toate răspunsurile sunt corecte.

3. Fosfataza acidă:
a) este enzimă marker lizozomală;
b) este enzimă marker mitocondrială;
c) se evidenţiază prin metoda Gömöri;
d) apare sub forma unui precipitat de culoare brună;
e) detectarea ei este utilizată în patologia prostatei
.
4. Fosfataza alcalină:
a) apare sub forma unui precipitat de culoare verde;
b) apare sub forma unui precipitat de culoare albastră;
c) se evidenţiază prin metoda Dorfmann-Epstein
d) se evidenţiază în prezenţa ionilor de Ca;
e) are o concentraţie crescută în aparatul Golgi.

145
5. Metoda imunohistochimică:
a) se bazează pe interacţiunea dintre antigen şi anticorp;
b) poate utiliza fluorocromi;
c) reacţia antigen-anticorp poate implica şi o enzimă care transformă substratul necolorat
într-un produs colorat;
d) este utilizată pentru identificarea tipurilor celulare specifice;
e) este utilizată în diagnosticul diferenţial al tumorilor.

6. În citoenzimologie:
a) fixarea se face cel mai frecvent la temperaturi ridicate;
b) fixarea se face cel mai frecvent la temperaturi foarte scăzute;
c) incubarea este o etapă specifică;
d) incubarea este o etapă nespecifică;
e) mediul de incubare conţine un substrat specific.

7. Lipidele complexe:
a) reprezintă forma de depozit cu rol energetic a lipidelor;
b) intră în constituţia membranelor;
c) se evidenţiază cu Sudan negru B
d) se evidenţiază cu acid osmic
e) sunt reprezentate de trigliceride.

8. Reacţia enzimatică este influenţată de:

a) pH;
b) temperatură;
c) concentraţia substratului;
d) concentraţia enzimei;
e) toate răspunsurile sunt corecte.

9. GAG se evidenţiază prin:

a) reacţia PAS;
b) cu albastru de toluidină
c) cu albastru alcian;
d) nici un răspuns nu este corect;

146
 e) toate răspunsurile sunt corecte.

10. Peroxidaza:
a) este enzima marker pentru lizozomi;
b) este enzima marker pentru mitocondrii;
c) este enzima marker pentru peroxizomi;
d) se evidenţiază sub forma unui precipitat de albastru de benzidină;
e) reacţia de evidenţiere necesită mediu oxigenat.

11. Fosfataza acidă:

a) este pusă în evidenţă în mediu alcalin,
b) este enzimă marker lizozomală,
c) analiza sa este factor de diagnostic în bolile hepatice,
d) substratul necesar evidenţierii este β glicerofosfatul de sodiu,
e) catalizarea reacţiei de evidenţiere este realizată de Pb2+

12. Fosfataza alcalină:

a) este enzimă marker aaparatului Golgi,
b) se evidenţiază printr-un precipitat roşu,
c) produsul de reacţie are culoare albastră,
d) reactantul specific este β glicerofosfatul de sodiu,
e) este utilizată în diagnosticul bolilor renale.

13. IHC este utilizată în:

a) diagnosticul diferenţial al tumorilor slab diferenţiate,
b) diagnosticul diferenţial al tumorilor nediferenţiate,
c) cercetare,
d) medicina legală,
e) completarea diagnosticului anatomopatologic convenţional.

14. Antigenul trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

a) să fie exclusiv de natură proteică,
b) să prezinte o conformaţie specifică,
c) molecula să prezinte o mărime adecvată contactului cu anticorpul,

147
 d) să prezinte conformaţie 2D stabilă,
e) să prezinte conformaţie 3D stabilă.

15. Mediul de incubare pentru reacţiile citoenzimatice:

a) conţine un substrat specific,
b) conţine soluşie tampon,
c) conţine indicator de pH,
d) conduce la obţinerea unui precipitat,
e) este utilizat pe timp nelimitat.

16. Realizarea tehnicii citoenzimatice urmăreşte:

a) obţinerea unui produs de reacţie stabil,
b) reacţia concomitentă a substratului cu mai multe enzime,
c) modificarea distribuţiei intracelulare a enzimelor,
d) neafectarea reactivităţii enzimatice cu substratul,
e) acţiunea lentă a substratului.

Data
..................................................

Calificativ Semnătura
................................................. cadrului didactic,
...............................................

148
 LUCRARE PRACTICĂ NR. 12

STUDIUL NUCLEULUI ÎN TIMPUL DIVIZIUNII

MORFOLOGIA CROMOZOMILOR METAFAZICI
ETAPELE CARIOTIPĂRII

I. NOŢIUNI TEORETICE

În cursul diviziunii materialul nuclear îşi pierde aspectul caracteristic interfazei, cel de
cromatină, şi se organizează sub formă de cromozomi. De fapt cromatina şi cromozomii
reprezintă acelaşi material biochimic cu mod diferit de prezentare în funcţie de etapele
ciclului celular. Termenul de cromozomi a fost introdus de Waldeyer în 1888 pentru a defini
corpusculii cu afinitate pentru coloranţii bazici, vizibili la microscop în timpul diviziunii
celulare.
Morfologia cromozomilor metafazici
Cromozomii sunt formaţiuni microscopice a căror morfologie caracteristică este
observată în timpul diviziunii în cursul metafazei, după blocarea diviziunii celulare cu o
substanţă statmokinetică (colchicină).
Studiul morfologiei cromozomilor se realizează în metafază, atunci când ei ating
gradul maxim de spiralizare (condensare). Un cromozom metafazic este alcătuit din
următoarele elemente structurale considerate obligatorii: cromatide, telomere, centromer
(fig.1).
Cromatidele sunt două subunităţi longitudinale identice ca mărime şi formă,
fiecare conţinând câte o moleculă de ADN.
Telomerele sunt extremităţile rotunjite ale cromatidelor care au rol în menţinerea
structurii cromozomilor respectiv a individualităţi lor. Sunt structuri importante, deoarece
sunt terminatorii bifurcaţiei replicative a ADN-ului şi deţin gene pentru sinteza ARN-urilor
ribozomale şi de transport, fiind implicate şi în mecanismele care intervin în apoptoză.
Centromerul reprezintă locul de unire al celor două cromatide surori la nivelul
constricţiei primare. Constricţia primară este zona la nivelul căreia cromatidele sunt mai
îngustate. Pe baza tehnicilor convenţionale, constricţiile primare sunt slab colorate sau

149
acromatice. Poziţia constantă a centromerului reprezintă un marker morfologic caracteristic,
care permite clasificarea cromozomilor în trei tipuri morfologice: metacentrici,
submetacentrici, acrocentrici (fig.2).

Fig.1. Reprezentarea schematică a cromozomului metafazic

Fig. 2. Clasificarea cromozomilor după poziţia centromerului. A-cromozom metacentric,

B-cromozom submetacentric, C- cromozom acrocentric

Centromerul împarte cromatidele în două braţe notate convenţional cu „p” (braţul

scurt) şi „q” (braţul lung). La cromozomii metacentrici, centromerul este situat în regiunea
mediană şi p=q. La cromozomii submetacentrici, centromerul este situat submedian şi p<q. La
cromozomii acrocentrici, centromerul este situat în regiunea terminală şi braţele sunt mult
inegale p<<q. La unele specii există şi cromozomi telocentrici (centromer dispus la nivelul
telomerului).

150
 De o parte şi de cealaltă a centromerului a fost descrisă o structură mică, rotund-
ovalară (câte una pentru fiecare cromatidă) numită kinetocor prin care cromozomul se leagă
de fibrele fusului mitotic. Examinarea kinetocorilor în microscopia electronică a evidenţiat
existenţa unei plăci alcătuită din trei straturi: un strat extern întunecat, dens la fluxul de
electroni; un strat intermediar, luminos şi un strat intern, de asemenea dens. Pe straturile dense
externe ale kinetocorilor sunt ataşaţi microtubulii fusului de diviziune, iar straturile dense
interne se continuă cu heterocromatina comisurală, cu rol în meţinerea legăturilor dintre
cromatidele surori până în momentul anafazei. S-a demonstrat că elementul structural de bază
al kinetocorilor este fibra de cromatină.
Elementele structurale prezente numai la anumiţi cromozomi sunt:
- constricţiile secundare,
- sateliţii.
Constricţiile secundare sunt elemente morfologice prezente numai la anumite
perechi de cromozomi umani având localizare:
- terminală, în regiunea distală a braţelor scurte, la nivelul pedunculului satelifer
pentru cromozomii acrocentrici,
- proximală, în regiunea proximală a braţelor lungi cromozomiale pentru perechile
de cromozomi 1, 9, 16.
La cromozomii acrocentrici, constricţiile secundare au rol de organizator nucleolar şi
filamentul de cromatină care uneşte satelitul cu segmentul proximal al braţului scurt este
denumit „peduncul satelifer”.
Sateliţii sunt localizaţi la nivelul porţiunii distale a braţului scurt la cromozomii
acrocentrici şi au formă rotundă sau ovală.
Lungimea unui cromozom metafazic variază între 1,5 µ - 8 µ .
Numărul şi morfologia cromozomilor sunt elemente caracteristice fiecărei specii. La
om, celulele somatice conţin 46 de cromozomi, celulele somatice se numesc diploide, iar
celulele sexuale mature care conţin numai 23 de cromozomi se numesc celule haploide. Setul
diploid de cromozomi se notează 2n, iar setul haploid se notează n. Cei 46 de cromozomi din
celulele diploide umane sunt dispuşi în 23 de perechi. În cadrul unei perechi, cromozomii sunt
identici ca mărime şi formă, codifică aceleaşi gene, dar sunt diferiţi ca origine, unul matern,
altul patern şi sunt numiţi cromozomi omologi. În celulele somatice există 22 de perechi de
cromozomi autozomi şi o pereche de cromozomi sexuali (heterozomi sau gonozomi):
perechea XX la sexul feminin şi XY la sexul masculin. Cromozomii X şi Y nu sunt omologi.
Cromozomul Y este mult mai mic (aproximativ 1/3 din talia cromozomului X), iar în cursul

151
evoluţiei filogenetice a pierdut majoritatea genelor somatice şi s-a specializat pentru procesul
de sexualizare masculină (Fig 3).

Fig.3. Cromozomii sexuali

Identificarea cromozomilor umani se face pe baza morfologiei lor, utilizând criterii

precis codificate în conferinţe internaţionale de standardizare. Pe baza lungimii
cromozomilor, a poziţiei centromerului, a existenţei sateliţilor şi constricţiilor secundare, cele
23 de perechi de cromozomi au fost clasificate în 7 grupe notate de la A la G. Acestea
constituie cariotipul uman (fig.4).

Fig.4. Cariotip uman

Grupa A cuprinde perechile de cromozomi mari 1–3, unde perechile 1 şi 3 sunt
metacentrici, iar perechea 2 uşor submetacentrici. Perechea 1 poate prezenta constricţie
secundară.
Grupa B cuprinde perechile de cromozomi mari 4–5, cromozomi submetacentrici.

152
 Grupa C cuprinde perechile de cromozomi mijlocii 6–12. Perechile 8, 10 şi 12 au
aspect submetacentric mai evident decât restul cromozomilor din grupă. În această grupă este
inclus şi cromozomul X; ca mărime este încadrat între perechile 6–8, dar ca morfologie este
mai metacentric.
Grupa D cuprinde perechile de cromozomi cu talie mijlocie 13–15 acrocentrici care
pot prezenta frecvent sateliţi.
Grupa E cuprinde perechile de cromozomi mici 16–18. În perechea 16 cromozomii
sunt metacentrici, în perechile 17 şi 18 sunt submetacentrici.
Grupa F cuprinde cromozomi mici, perechile 19–20, metacentrici.
Grupa G cuprinde cei mai mici cromozomi, perechile 21–22 acrocentrici. În această
grupă este inclus şi cromozomul Y, care are talie mai mare, nu prezintă sateliţi, este un
acrocentric cu braţele “q” aproximativ paralele.

Tehnica efectuării cariotipului uman

Studiul cromozomilor umani se face pe culturi de limfocite. Cultura de limfocite este
un tip de cultură în suspensie în care celulele se multiplică liber în masa mediului de cultură.
Limfocitele umane din sângele periferic sunt capabile de activitate mitotică după 48-72 de ore
de cultură, la care s-a adăugat fitohemaglutinină.
Tehnica comportă urmatorii timpi:
1. Recoltarea. Se recoltează 10 ml de sânge venos în condiţii sterile şi folosind
anticoagulante de tip: heparină, citrat de sodiu, EDTA.
2. Separarea leucocitelor se face prin centrifugarea sângelui sau se lasă aproximativ o
oră la temperatura camerei să sedimenteze pentru separarea leucocitelor.
3. Cultivarea celulelor. Se prelevează plasma cu leucocite cu ajutorul unei pipete sterile
şi se introduce în mediul de cultură. Acesta conţine electroliţi, glucoză, aminoacizi,
proteine, antibiotice, indicator de pH. Proporţia între mediu şi leucocite trebuie să fie
de 4/1. În continuare se lasă la termostat la 37˚C timp de 24 de ore. Se verifică
creşterea şi formarea cheagurilor de fibrină precum şi modificarea pH-ului.
4. Aprecierea indicelui mitotic. Din suspensia de leucocite numai limfocitele se divid.
Indicele mitotic ne furnizează informaţii despre dinamica mitozelor dintr-o cultură
celulară la un moment dat. Aprecierea indicelui mitotic prezintă importanţă atât pentru
alegerea momentului favorabil în vederea efectuării preparatelor cromozomiale din
cultura respectivă, cât şi pentru a stabili în ce măsură o anumită substanţă chimică,
administrată în cultură, într-o anumită concentraţie, influenţează proliferarea celulară.

153
 Pentru determinarea indicelui mitotic se examinează direct cultura celulară la
microscop, prin analiza a cel puţin 1000 de celule din mai multe zone de pe suprafaţa
vasului de cultură. Valoarea indicelui mitotic, (IM), se stabileşte după formula:
IM= nr. de celule în mitoză/nr. total de celule analizate x 100
5. Oprirea mitozelor se face după 72 de ore de incubaţie. În mediul de cultură se adăugă
colchicină (0,1μg/ml), după care se incubează din nou 4 ore la 37˚C. Rolul colchicinei
este de a depolimeriza microtubulii fusului de diviziune în stadiul de metafază. După
distrugerea fusului de diviziune cromozomii se împraştie în citoplasmă.
6. Şocul hipotonic. Pentru a uşura studierea cromozomilor, aceştia trebuie împrăştiaţi pe
toată aria cercetată. În acest sens, se incubează celulele scoase din cultură în soluţie
hipotonă de KCl 0,075M şi se lasă la termostat la 37˚C, timp de 15-30 minute, în
funcţie de densitatea celulară. Datorită diferenţei de presiune osmotică, celulele
acumulează apă şi se balonizează până la limita de rupere a membranei.
7. Fixarea şi efectuarea frotiurilor. Amestecul se centrifughează. Supernatantul
reprezentat de soluţia hipotonă se înlătură, iar sedimentul celular se fixează cu un
amestec de acid acetic glacial şi alcool metilic absolut în proporţie de 1/3. Se lasă la
rece, la 4˚C, timp de 24 de ore. Frotiul se întinde pe o lamă curată, degresată cu
ajutorul unei pipete Pasteur, după care se flambează.
8. Colorarea se face cu soluţie Giemsa 10%. Lamele se lasă în colorant 10-15 minute
după care se spală cu apă distilată şi se lasă să se usuce.
9. Examinarea. Cromozomii apar coloraţi într-un spectru de nuanţe de la albastru închis
până la purpuriu închis. Se examinează 50 de metafaze şi se face media numărului de
cromozomi evidenţiaţi. În acest fel, efectuarea cariotipului poate da indicaţii asupra
anomaliilor cromozomiale numerice somatice sau sexuale.

Stabilirea structurii cromozomilor prin tehnica bandării

Aceasta este o tehnică modernă ce permite recunoaşterea exactă a tuturor
cromozomilor metafazici şi face posibilă diagnosticarea eventualelor anomalii numerice sau
structurale. Pe baza unor coloraţii şi tehnici speciale de tratare a cromozomilor (denaturare
termică şi enzimatică) se poate evidenţia de-a lungul cromozomilor o structură heterogenă de
benzi, denumite în funcţie de metoda folosită, benzi Q, G, R – sau după localizare – benzi C
(centromerice) şi benzi T (telomerice) (fig. 5).

154
 Bandarea cromozomială permite identificarea precisă a cromozomilor în cadrul
fiecărei grupe pe baza modelului propriu de benzi şi facilitează diagnosticul de mare acurateţe
al anomaliilor structurale cromozomiale fine.
Prin folosirea tehnicilor cu fluorocromi s-au obţinut benzile Q (quinacrină),
fluorescente. În acest caz examinarea se face la microscopul cu lumină UV.
Prin tehnicile de tratare a cromozomilor cu diferiţi agenţi fizici şi chimici şi aplicarea
coloraţiei Giemsa se evidenţiază 3 feluri de benzi: G-Giemsa, R-reversebanda, C-
heterocromatina constitutivă.
Benzile Q, fluorescente, alternează cu benzile întunecate şi sunt localizate pe ambele
cromatide cu dispoziţie similară la cromozomii omologi. Numărul şi distribuţia acestor benzi
sunt caracteristice pentru fiecare pereche de cromozomi în parte.
Benzile G se aseamănă cu benzile Q şi apar colorate. Se descriu 320-554 benzi G.
Benzile R au distribuţie inversă benzilor G.
Benzile C apar în regiunea centromerică şi corespund localizării cromatinei
constitutive.

Fig. 5 Bandarea cromozomială

Importanţa medicală a cariotipării

1. Cariotiparea permite stabilirea etiologiei cromozomiale în diferite boli şi totodată face
posibilă diagnosticarea tipului de defect genetic, numeric sau structural.
2. Această procedură face posibil sfatul genetic şi prognoza genetică la familiile afectate.
3. Cariotiparea permite aprecierea statusului genetic fetal în familiile cu risc genetic
mare. Se procedează la determinarea cariotipului fetal din lichidul amniotic, lichid ce
se recolteză prin paracenteză. Cariotiparea din lichid amniotic pentru aprecierea

155
 statusului genetic al fetuşilor se face în mai multe situaţii: părinţi cu defecte
cromozomiale diagnosticate sau existenţa unor antecedente heredocolaterale; mame
expuse la infecţii mutagene în primele 3 luni de sarcină (rubeolă); mame cu avorturi
spontane repetate.
4. Cariotiparea este utilă şi în diagnosticul diferenţial al anomaliilor sexuale:
hermafroditism şi pseudohermafroditism şi la pubertate în caz de hipogonadism.
5. Prin cariotipare se face şi diagnosticul diferenţial al sterilităţii masculine.
6. În hematologie cariotiparea este utilă în diagnosticul diferenţial al unor boli, de
exemplu poate separa reacţiile leucemoide de leucemia francă (leucemia mieloidă
cronică prezintă cromozomul Ph - Philadelphia). În macroglobulinemie apare un
extracromozom W sau M4 caracteristic.
7. Evaluarea avorturilor spontane. Incidenţa anatomiilor cromozomiale este mult mai
mare la fetuşii avortaţi, deoarece existenţa anumitor anomalii cromozomiale este
incompatibilă cu viaţa.
8. Expertiza medico-legală apelează la cariotipare în testele pentru paternitate. De
asemenea s-au constatat anomalii cromozomiale numerice în cariotipul persoanelor cu
comportament violent, antisocial, criminal.
9. Cariotipul şi cariograma se mai recomandă în diagnosticul diferenţial benign-malign
în diverse tipuri de tumori; în prognosticul comportamentului tumorilor maligne la
tratament; în evaluarea riscului expunerii la diverşi factori de mediu cum ar fi:
substanţe chimice, infecţii virale, radiaţii ionizante.

II. ACTIVITATE PRACTICĂ

Cromozomii metafazici pot fi studiaţi relativ simplu în celulele vegetale. La rădăcinile

tinere de la baza bulbilor anumitor plante (usturoi, ceapă, zambilă) ritmul mitotic este rapid,
iar tehnica de punere în evidenţă a cromozomilor este uşoară. Se plasează bulbii într-un
recipient în aşa fel încât baza lor să fie în contact cu apa. Creşterea rădăcinii este rapidă
(câţiva mm pe zi). Pentru realizarea preparatului microscopic se recoltează meristemul, se
secţionează şi se colorează cu orceină. Preparatele se examinează la microscop.

156
 Bulbi de ceapă şi usturoi

Rădăcini tinere la baza bulbului de ceapă

Recoltarea preparatului

157
 Aşezarea lamelei peste preparatul colorat

Prepararea soluţiilor

Acidul clorhidric 1 mol.L-1

Într-o sticla de1 litru, se toarnă 914 ml apă distilată. Completaţi până la 1 litru cu acid
clorhidric 36 % (densitate 1,178).

Soluţia de orceină acetică

Dizolvaţi 1 g de orceină în 45 ml acid acetic pur.
Amestecaţi până la dizolvare şi lăsaţi sa se răcească.
Filtraţi şi conservaţi filtratul la frigider.

Soluţia de orceină utilizată pentru colorare se prepară extemporaneu : Se amestecă 9 ml de

solutie de orceină acetică cu 11 ml apă distilată.

Tehnică:

1. Plasaţi bulbii într-un recipient în aşa fel încât baza lor să fie în contact cu apa.
2. Urmăriţi creşterea rădăcinii timp de câteva zile.
3. Recoltaţi cu foarfeca 5mm din rădăcină în vederea realizării preparatului microscopic.
4. Se depune preparatul pe o lamă portobiect.
5. Se acoperă timp de 5 minute cu soluţia de acid clorhidric. Acesta disociază celulele.
Excesul de acid clorhidric se absoarbe cu hârtie de filtru.
6. Se acoperă preparatul cu soluţia de orceina 20 de minute. Excesul de colorant se
absoarbe cu hârtie de filtru.
7. Se acoperă cu soluţie de acid acetic 45% şi apoi cu lamela. Lamela se presează uşor pe
preparat în vederea disocierii celulelor.

158
8. Examinarea. Identificarea fazelor mitozei necesită examinarea întregului preparat
deoarece celulele sunt disociate ca urmare a “manevrelor” suferite.

Interfaza Debut de profază

Profaza Sfârşitul profazei

Metafază Metafază

159
 Anafază Telofază

1. Observaţi în MO preparatul de meristem de ceapă şi desenaţi în casetă diferitele faze ale

ciclului cellular.

2. Obsevaţi în MO metafaze obţinute prin cariotiparea umană, colorate Giemsa. Desenaţi

cromozomii metafazici şi notaţi numărul cromozomilor regăsiţi.

160
 III. VERIFICAREA CUNOŞTINŢELOR
1. Studiul cromozomilor umani se face pe:
a. Culturi de eritrocite
b. Culturi de trombocite
c. Culturi de limfocite
d. Cultura din nefrocite
e. Cultura din hepatocite
2. Fitohemaglutinina este o substanţă:
a. Statmochinetică
b. Mitogenă
c. De reglare a pH-ului
d. Anticoagulantă
e. Ce induce coagularea
3. Pentru studiul cariotipului se recoltează:
a. Sânge arterial
b. Limfă
c. Sânge venos
d. Lichid pleural
e. Celule hepatice
4. Rolul colchicinei este de a:
a. Iniţia mitoza
b. Depolimeriza microtubulii fusului de diviziune
c. Polimeriza microtubulii fusului de diviziune
d. Baloniza celula pâna la limita de rupere a membranei
e. Creşte presiunea osmotică
5. Prin tratarea cu soluţie hipotonă limfocitele din cultură se balonizează datorită:
a. Diferenţei de presiune osmotică
b. Diferenţei de pH
c. Concentraţiei de glucide din mediul de cultură
d. Creşterii temperaturii
e. Colorării cu soluţie Giemsa

161
 6. Cromozomii omologi sunt:
a. Identici ca mărime şi formă
b. Diferiţi ca origine
c. Unul de provenienţă maternă şi celălalt paternă
d. Codifică aceleaşi caractere
e. De dimensiuni diferite
7. Centromerul reprezintă:
a. Extremitatea rotunjită a cromatidelor
b. O subunitate longitudinală ce conţine o moleculă de ADN
c. Locul de unire al celor două cromatide surori
d. Unul din markerii ce permite clasificarea cromozomilor
e. Porţiunea distală a braţului scurt
8. Kinetocorul este o structură rotund-ovalară
a. Prin care cromozomul se leagă de fibrele fusului mitotic
b. Care are rol în menţinerea structurii cromozomilor
c. Care deţine gene pentru sinteza ARN-urilor ribozomale
d. Al cărui element structural de bază este fibra de cromatină
e. Pe care sunt ataşaţi microtubulii fusului de diviziune
9. Cromatidele sunt:
a. Două subunităţi longitudinale identice
b. Extremităţi rotunjite cu rol în menţinerea structurii cromozomilor
c. Elemente morfologice prezente numai la anumite perechi de cromozomi
cu localizare terminală
d. Elemente de mărimi şi forme diferite
e. Structuri ce conţin fiecare câte o moleculă de ADN

Data
.................................
Calificativ Semnătura
..................................... cadrului didactic,
..........................................

162
 METODE ŞI TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Până la începutul anilor 1970, cercetătorii considerau că molecula de ADN este

constituentul celular cel mai greu de analizat. Astăzi este posibilă izolarea unei regiuni
specifice a genomului, producerea unui număr teoretic nelimitat de cópii ale acesteia şi
determinarea secvenţelor nucleotidice. Noile tehnici permit modificarea unei gene izolate şi
transferarea ei într-o nouă linie germinală animală sau vegetală ; în acest fel, gena nou
inserată va deveni parte funcţională şi ereditară a genomului în care a fost introdusă.
Descifrarea completă a genomului uman şi posibilitatea de manipulare extrem de
precisă a ADN au avut un impact spectacular asupra tuturor cunoştinţelor de biologie celulară.
Tehnicile utilizate au facilitat studiul celulelor, al macromoleculelor, au condus la
descoperirea de noi clase de proteine, au permis obţinerea de cantităţi masive de proteine,
hormoni proteici şi vaccinuri. Izolarea şi studierea regiunilor regulatoare ale genelor a permis
înţelegerea mecanismelor complexe de reglare a controlului expresiei genelor la eucariote.
Noţiunile teoretice ale acestei secţiuni de lucrări practice se referă la prezentarea
principiilor tehnicilor fundamentale care au revoluţionat studiul biologiei celulare şi au pus
bazele biologiei moleculare. De asemenea, deoarece aceste tehnici sunt aplicate pe un produs
biologic (ADN sau ARN), vă sunt prezentate şi tehnicile de izolare şi amplificare a acizilor
nucleici.
1. DECUPAJUL ADN LA NIVELUL SITUSURILOR SPECIFICE
Decupajul ADN la nivelul situsurilor specifice permite izolarea şi manipularea genelor
individuale. Genomul uman (recent decodificat) conţine 35.000 de gene diferite, grupate pe
cei 46 de cromozomi. Rezultă că pe o macromoleculă de ADN există o multitudine de mici
regiuni, fiecare dintre ele reprezentând o genă care codifică sinteza unei proteine.
Separarea genelor este astăzi posibilă prin utilizarea unor enzime numite nucleaze de
restricţie. Aceste enzime au fost purificate de la bacterii; la ora actuală sunt cunoscute,

163
purificate şi comercializate sute de tipuri. Dintre cele mai utilizate amintim : Hpal izolată de
la Haemophilus parainfluenzae, EcoRI de la Escherichia coli, HindIII de la Haemophilus
influenzae şi PstI de la Providencia stuarti. Enzimele de restricţie recunosc secvenţe
nucleotidice specifice de pe ADN şi secţionează dublul lanţ de ADN în fragmente cu lungime
bine definită (fig.1). Secvenţele nucleotidice specifice recunoscute de enzimele de restricţie au
o lungime de 4-6 nucleotide, sunt în general localizate între gene şi poartă denumirea de
situsuri de restricţie. Enzimele determină secţionarea celor două lanţuri la acelaşi nivel
(simetric), sau produc secţiuni decalate, unul dintre lanţuri prezentând o « coadă » de 4
nucleotide (fig.2). Aceste capete se numesc extremităţi coezive (adezive) deoarece se pot
ataşa de manieră complementară cu alte fragmente de ADN. Moleculele de ADN formate prin
reunirea acestor fragmente poartă denumirea de ADN recombinant.

Fig.1. Acţiunea nucleazelor de restricţie Fig.2. Formarea ADN recombinant

(după Alberts et al.,2004) (după Alberts et al., 2004)

2. CLONAREA SAU AMPLIFICAREA SELECTIVĂ A ADN

Clonarea ADN permite copierea unei singure molecule de ADN şi obţinerea a
miliarde de molecule identice. Clonarea ADN poate fi realizată :
- in vivo - clonare celulară a ADN, care foloseşte mecanismul natural al replicării ADN ;
- in vitro - clonare acelulară a AND, care se bazează pe reacţia de polimerizare în lanţ (PCR).

164
2.1. Clonarea ADN in vivo implică 4 etape majore :
 Obţinerea ADN recombinant prin ataşarea (in vitro) a fragmentelor de ADN uman
la un “vector” sau “replicon” capabil de replicare independentă (fig.3). Un vector
este o moleculă naturală de ADN utilizată pentru transportul secvenţelor de ADN
exogen într-o celulă gazdă. În tehnicile de clonare se utilizează frecvent 4 tipuri
principale de vectori : plasmide, bacteriofagi, cosmide, cromozomi artificiali.
 Transformarea este tehnica prin care ADN recombinant este transferat în celula
gazdă, de obicei bacterii nepatogene modificate (E. Coli, Pseudomonas, Bacillus
subtilis). O celulă gazdă competentă fixează o singură moleculă de ADN
recombinant, deci fiecare celulă transformată va forma o clonă specifică.
 Amplificarea presupune multiplicarea celulelor gazdă transformate (fig.4). Dacă
celula gazdă a fost o bacterie, prin însămânţare pe mediu de cultură (agar) va
forma o populaţie de celule identice. Toate vor conţine vectorul recombinant, deci
şi fragmentul de ADN ataşat vectorului.
 Izolarea clonelor de ADN recombinant se realizează prin oprirea culturilor şi
izolarea selectivă a ADN recombinant. Acesta poate fi ulterior utilizat în cercetare
sau poate fi stocat în bănci sau biblioteci de gene.

Fig.3. Obţinerea ADN recombinant din ADN exogen şi plasmidă bacteriană

Fig.4. Amplificarea ADN recombinant prin cultură bacteriană

165
2.2. Clonarea acelulară a ADN (tehnica PCR)
Tehnica de polimerizare în lanţ (polymerase chain reaction – PCR) a fost introdusă în
1985 de Mullis şi Smith (premiul Nobel, 1993) şi permite amplificarea selectivă a unei
secvenţe scurte de ADN sau ARN. Tehnica este utilizată în cercetare, dar este extreme de utilă
în analiza medicală deoarece permite obţinerea unei cantităţi suficiente de material genetic
(miliarde de cópii ale genei) în câteva ore. Tehnica poartă denumirea de “în lanţ” deoarece
reproduce de un număr de ori (20-40) mecanismul autoreplicării ADN (fig.5) ; la fiecare
ciclu, catenele de ADN nou sintetizate vor acţiona ca “matriţe” pentru ciclul următor.
Ciclurile de amplificare presupun :
- denaturarea termică a ADN (separarea celor două catene) la 95-96ºC;
- ataşarea primerilor (amorselor) de ARN la 50-60°C;
- polimerizarea nucleotidelor catalizată de ADN-polimerază la 72°C;
În acest fel, la fiecare 3-10 minute rezultă o nouă dublare a secvenţei de ADN.

Fig.5. Principiul amplificării ADN prin tehnica PCR

Reacţia se realizează cu ajutorul unui aparat numit termocycler (fig.6), capabil să

realizeze cicluri de temperatură coordonate automat (fig.7).
Metoda PCR a revoluţionat diagnosticul molecular al bolilor genetice. Ea este aplicată
în studiul secvenţelor de ADN genomic şi mitocondrial, ADN exogen (în special viral), dar şi
în studiul ARNm. În acest scop a fost introdusă o variantă a tehnicii, numită RT-PCR (reverse
transcriptase PCR) care presupune:

166
 - sinteza unei catene de ADN complementar (ADNc) prin copierea ARNm cu ajutorul
enzimei revers transcriptază (RT),
- amplificarea ulterioară a ADNc prin PCR.

Fig.6. Termocycler
GeneAmp 9700

Fig.7. Ciclurile de temperatură realizate de termocycler

3. HIBRIDIZAREA MOLECULARA A ACIZILOR NUCLEICI

Hibridizarea moleculară a acizilor nucleici se bazează pe capacitatea unor molecule

monocatenare de a forma, pe bază de complementaritate, molecule bicatenare. Tehnica este
utilizată pentru a identifica o secvenţă similară dintr-un amestec heterogen de molecule de
acid nucleic. În acest scop este utilizată o sondă monocatenară de acid nucleic (de cel puţin 20
de nucleotide), cu structură cunoscută, marcată cu un trasor radioactiv sau un compus
fluorescent. În condiţii adecvate, sonda se fixează complementar pe secvenţa omologă de
ADN sau ARN şi hibridizează specific şi stabil cu aceasta.
Hibridizarea moleculară a acizilor nucleici este utilizată în practica medicală în scop
diagnostic pentru:

167
- studiul patologiei moleculare în boli genetice şi cancer,
- diagnostic genotipic prenatal,
- recunoaşterea unei infecţii virale latente.

Principalele tehnici de laborator utilizate în hibridizarea moleculară sunt :

1. Metoda de transfer Southern (Southern blot) – introdusă de Ed Southern, 1975
- permite diagnosticul prenatal al unor mutaţii genice şi identificarea heterozigoţilor
- nu permite evidenţierea modificărilor minore de structură a ADN (microdeleţii,
mutaţii punctiforme etc.)
- este laborioasă, complexă, costisitoare şi prezintă numeroase dificultăţi de
interpretare.
2. Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei alele (ASO)
- permite depistarea alterărilor minime ale secvenţei genice (alterarea unei singure
perechi de baze);
- este utilizată pentru depistarea unei mutaţii caracteristice unei boli genetice;
- este costisitoare şi utilă numai în cazul în care un alt individ al familiei posedă o
mutaţie deja cunoscută.
3. Analiza ARNm prin Northern blot (variantă a Southern blot pentru ARNm)
- oferă informaţii cu privire la profilurile de expresie a genelor clonate : în care tip
celular se exprimă şi în ce cantitate ;
- metoda este mai dificilă din două motive :
- ARN este extrem de sensibil la RN-azele citoplasmatice
- tipurile de ARN de interes se găsesc numai în anumite celule (de ex. ARNm
pentru tireoglobulină este prezent numai în tireocite).
4. Hibridizarea ADN in situ. Hibridizarea ADN se poate realiza şi in situ, pe cromozomi
aflaţi în pro-metafază, cu ajutorul unor sonde marcate radioactiv sau fluorescent (FISH –
fluorescence in situ hibridisation).
- metoda oferă posibilitatea vizualizării locaţiei unei anumite gene la nivel
cromozomial. Absenţa semnalului corespunzător sondei indică deleţia regiunii, iar
prezenţa semnalului pe un alt cromozom indică mutaţia (fig.8);
- metoda se foloseşte şi pentru evidenţierea ARN în secţiuni histologice.

168
 Fig.8. Hibridizare in situ
stg. - localizarea genelor specifice pe cromozomi (după D.C.Ward citat de Alberts et al.)
dr. - nucleol, fiecare punct alb reprezintă transcripţia unei gene pentru ARNr (după P.Shaw)

4. SECVENŢIEREA ADN
Secvenţierea nucleotidelor dintr-un fragment de ADN purificat permite identificarea
genelor şi, prin aceasta se pot deduce secvenţele de aminoacizi ale proteinei codificată de
fragmentul respectiv de ADN.
Metodele de secvenţiere a nucleotidelor dintr-un fragment de ADN au fost imaginate de
Walter Gilbert (tehnica de degradare chimică) şi Fred Sanger (tehnica de sinteză enzimatică)
(premiul Nobel, 1980). De atunci, tehnica de secvenţiere a fost mult ameliorată, astăzi fiind
total automatizată.
Secvenţierea prin metoda enzimatică didezoxi Sanger
Metoda se bazează pe utilizarea didezoxinucleozidelor trifosfat, derivate din
dezoxinucleozide trifosfat la care s-a îndepărtat gruparea 3'-OH. Metoda comportă următorii
timpi (fig.9):
 molecula de ADN care trebuie secvenţiată este separată în cele două catene;
 se adaugă un primer oligonucleotidic care permite ADN-polimerazei să iniţieze
sinteza;
 se adaugă dezoxinucleozidele trifosfat dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Amestecul de
ADN monocatenar cu ADN-polimerază şi dezoxinucleozide se împarte în 4 eprubete. În
fiecare dintre ele se introduce un tip de didezoxinucleozide: ddATP, ddGTP, ddTTP şi
ddCTP. În timpul polimerizării catenei complementare, aceste didezoxiribonucleozide
vor fi încorporate. Datorită absenţei grupării OH la extremitatea 3' odată inserat
didezoxiribonucleozidul opreşte sinteza. Vor rezulta în acest fel mici fragmente de ADN
nou sintetizate. În fiecare eprubetă se vor obţine grupe de cópii de ADN care se termină
în puncte diferite ale secvenţei.

169
  produşii din cele 4 reacţii sunt introduşi în 4 godeuri ale unui în gel de polyacrylamidă
(notate A, T, C, G). Electroforeza va conduce la formarea de benzi care se vor citi în
ordine cu începere din partea de jos a gelului. Secvenţa citită va fi identică cu cea a
lanţului 5'→3' a moleculei de ADN de origine. Detecţia fragmentelor nou sintetizate
este posibilă datorită marcării lor radioactive sau prin fluorescenţă. Markerul poate fi
încorporat în primer sau în dezoxiribonucleozidele trifosfat utilizate pentru elongarea
lanţului de ADN.
Metoda enzimatică Sanger este astăzi complet automatizată. Secvenţializatorul (fig.10)
amestecă reactivii, depune produşii în gel, realizează migrarea produşilor şi citeşte ordinea
nucleotidelor. Fiecare nucleotid este marcat cu fluorescenţă diferită ceea ce permite realizarea
analizei într-un singur tub de reacţie şi separarea produşilor pe o singură bandă de gel.
Detectorul (fascicul laser) citeşte gelul în mod progresiv (de jos în sus) şi înregistrează
culoarea markerului fluorescent. Ulterior, calculatorul afişează şi stochează secvenţele
nucleotidice (fig.11).
Graţie informatizării, determinarea secvenţei acizilor nucleici este extrem de rapidă. În
acest fel a fost posibilă determinarea secvenţei integrale a genomului uman alcătuit din
aproximativ 3 miliarde de perechi de baze (pb); programul internaţional “Human Genomic
Project” a anunţat stabilirea completă a hărţii genomului uman în 2005.

Fig. 10. Secvenţializator

Fig.11. Afişararea secvenţelor

nucleotidice pe ecran

170
 Secvenţa de ADN
citită 5’→3' va fi:
ATGTCAGTCCAG

Fig.9. Metoda enzimatică (Sanger) de secvenţiere a ADN

171
 APLICAŢII ALE TEHNOLOGIEI ADN RECOMBINANT ÎN MEDICINĂ
ŞI INDUSTRIA FARMACEUTICĂ

Clonarea unei gene sau a ADNc care codifică o proteină reprezintă doar prima dintre
etapele necesare pentru producerea unei proteine recombinate, utilizabilă în practică. Gena
clonată trebuie să fie ulterior introdusă într-o gazdă capabilă de a asigura un sistem de
exprimare eficient. Au fost utilizate în acest scop tulpini de E.coli, B.subtilis şi Saccharomices
cerevisiae. O alternativă de gazdă pentru clonare o reprezintă celulele de drojdii care oferă
avantaje din punct de vedere al modificărilor posttranslaţionale şi dau posibilitatea obţinerii
compusului dorit într-o stare destul de pură. În ultimii ani au fost elaborate sisteme de
exprimare a proteinelor heterologe în celule de insecte ; acestea au permis obţinerea unor
glicoproteine ale HIV, utilizabile în obţinerea vaccinului anti-SIDA. Experimentul s-a dovedit
extrem de costisitor motiv pentru care tehnica nu poate fi aplicată pe scară largă.
1. Sinteza humulinei (insulina umană)
Primul medicament autorizat obţinut prin inginerie genetică a fost humulina. Iniţial,
insulina era extrasă din pancreasul animalelor (porc, vacă), dar s-a observat că unii pacienţi
dezvoltă anticorpi anti-insulină şi resping tratamentul deoarece hormonul de natură animală
nu este identic cu cel uman. Tehnologia ADN recombinant a permis “confecţionarea” celor
două gene care să conducă la sinteza artificială a celor două lanţuri (A şi B) ale hormonului
uman. La ora actuală, condiţiile biotehnologice de sinteză a insulinei permit producerea şi
comercializarea unor cantităţi mari de hormon sub denumirea de humulină.
2. Sinteza hormonului uman de creştere
Hormonul uman de creştere (HGH – human growth hormon) este o proteină sinetizată
de celulele glandei pituitare (adenohipofiza) cu rol în reglarea creşterii şi dezvoltării
organismului. Malsinteza HGH determină nanismul hipofizar. Prin tehnologia ADN
recombinant s-a realizat in vitro o genă hibridă care conţine cea mai mare parte a ADNc
pentru HGH; la capătul 5' al acesteia s-a adăugat o secvenţă sintetică care să poată fi
recunoscută de o bacterie. Gena hibridă a fost introdusă într-un vector plasmidial, ceea ce a
permis bacteriei recombinate să producă un hormone foarte apropiat de hormonal uman.
Purificarea proteinei a necesitat ulterior liza celulei bacteriene şi separarea ei de restul
proteinelor bacteriene.
3. Obţinerea vaccinului anti-hepatită B
Vaccinurile produse în mod clasic conţineau agenţi infecţioşi (virusuri sau bacterii)
atenuate sau omorâte. Aceste vaccinuri pot avea însă efecte secundare: o atenuare insuficientă

172
determină infectarea pacientului şi contractarea maladiei, iar omorârea agentului infecţios
determină pierderea efectului stimulator al răspunsului imun.
Prin utilizarea tehnologiei ADN recombinant se pot obţine vaccinuri care conţin doar
proteine de suprafaţă ale agentului infecţios, ceeace stimulează eficient răspunsul imun.
Primul vaccin de acest tip conţine antigenul de suprafaţă (HbsAg) al virusului hepatitic B.
Gena pentru HbsAg a fost inserată într-un vector de exprimare pentru drojdii. Prin cultivarea
drojdiilor s-a reuşit obţinerea a 50-100 mg proteină virală / l cultură microbiană. Tehnologia
simplă şi preţul de cost convenabil permit utilizarea acestui tip de vaccin la un mare număr de
persoane.
4. Producerea anticorpilor monoclonali
Anticorpii sunt proteine produse de limfocite ca urmare a prezenţei unor antigene
străine. Fiind foarte selective sunt capabile să-şi recunoască „ţinta” din milioane de alte
molecule nespecifice. Datorită acestei proprietăţi, imunoglobulinele ar putea fi utilizate ca
„gloanţe direcţionate” în tratarea bolilor infecţioase sau împotriva celulelor tumorale.
Tehnologia clasică a producerii anticorpilor monoclonali presupune inocularea unui antigen la
şoarece, recoltarea limfocitelor splenice de şoarec şi fuzionarea acestora cu celule tumorale.
Celulele astfel obţinute se numesc hibridoma şi prezintă proprietăţi de la ambele tipuri
celulare din care au provenit: se divid în cultură ca şi celulele tumorale şi produc anticorpi ca
şi limfocitele animalului imunizat. Anticorpii monoclonali produşi în acest fel sunt utilizaţi
pentru diagnosticul unor infecţii şi a cancerului, dar nu pot fi injectaţi la oameni în scop
terapeutic; deoarece conţin proteine de şoarece, organismul uman îi poate recunoaşte ca
antigeni faţă de care va sintetiza anticorpi specifici. Producerea de anticorpi monoclonali prin
tehnologia ADN recombinant (inginerie proteică) urmăreşte combinarea secvenţelor
anticorpilor de şoarece cu secvenţe umane. S-a reuşit obţinerea de anticorpi bispecifici la care
fiecare dintre cele două braţe este capabil să recunoască câte un antigen diferit. Pe baza
acestui experiment s-ar putea obţine anticorpi capabili să recunoască, în acelaşi timp, o celulă
tumorală şi o proteină de suprafaţă a limfocitului T killer. În acest fel anticorpul ar permite
contactul direct între celula tumorală şi limfocitul T killer, ceeace ar conduce la distrugerea
tumorii.
5. Detecţia virusului HIV (SIDA)
Din 1985, singurul test aplicabil expunerii la infecţia cu HIV se baza pe detecţia
anticorpilor produşi de organismul infectat. Producerea anticorpilor necesită însă mai multe
săptămâni, astfel că o persoană aflată la debutul infecţiei poate fi diagnosticată fals-negativ.
Introducerea probelor ADN şi a PCR a permis detecţia directă a prezenţei virusului. În cursul

173
ciclului de infecţie, ARN viral suferă o reverstranscripţie în limfocitele T, apoi este integrat ca
ADN-proviral în genomul celulei gazdă. Detectarea ADN-proviral prin PCR este cel mai
sigur test în stabilirea diagnosticului, în efectuarea studiilor epidemiologice, precum şi în
urmărirea eficienţei tratamentului instituit.
6. Detectarea infecţiei cu Mycobacterium tuberculosis (TBC)
Diagnosticul clasic de laborator al TBC se realizează în câteva săptămâni deoarece
bacteria Mzcobacterium tuberculosis se înmulţeşte foarte greu în mediul de cultură. Un
diagnostic stabilit cu întârziere are consecinţe nefaste asupra stării bolnavului, dar şi asupra
colectivităţii din care acesta face parte. Tehnica PCR permite astăzi un diagnostic rapid (zile)
şi extrem de precis deoarece stabileşte şi tulpina bacteriană răspunzătoare de apariţia bolii.
Tehnica utilizează un bacteriofag specific pentru M. tuberculosis căruia, prin inginerie
genetică, i s-a introdus gena pentru sinteza luciferazei (enzimă produsă de licurici, care are
proprietatea de a produce un fulger minuscul de lumină). Fagul este introdus în cultura
microbiană. În cazul în care cultura conţine şi M.tuberculosis, fagul pătrunde în bacterie, se
inseră în cromozomul acesteia şi în acest fel determină bacteria să sintetizeze luciferază. În
cultura bacteriană se adaugă luciferina (substratul pe care acţionează luciferaza), enzima
hidrolizează luciferina şi în urma acestor reacţii se produc descărcări luminoase. Lumina este
detectată cu un luminometru şi este confirmată astfel prezenţa M.tubeculosis.
7. Teste bazate pe proba ADN utilizate în alte boli umane
- identificarea virusului papilloma uman (HPV) care stă la baza etiologiei cancerelor
de col uterin
- identificarea virusurilor hepatitelor B şi C, herpes simplex, citomegalovirus,
- identificarea a trei specii bacteriene implicate în boala periodontală (paradontoza),
- identificarea genelor implicate în eredopatologia umană. Se cunosc peste 10.000 de
boli determinate sau condiţionate genetic. Ele au o mare diversitate, se manifestă la
orice vârstă, orice sistem de organe şi de aceea se regăsesc în aproape toate
specialităţile medicale. Noile tehnologii au permis diagnosticul de precizie şi
elucidarea mecanismelor moleculare de producere a bolilor în fibroza chistică, boala
Huntington, retinoblastom, scleroza laterală amiotrofică, diabet, diferite forme de
cancer, hipertensiunea arterială, boala coronariană etc.

174